在轉基因哺乳動物的奶中生產外源蛋白的方法以及從其中純化蛋白的方法

專利名稱：：在轉基因哺乳動物的奶中生產外源蛋白的方法以及從其中純化蛋白的方法在轉基因哺乳動物的奶中生產外源蛋白的方法以及從其中純化蛋白的方法本分案申請是基于申請號為200480031507.8，申請日為2004年09月29日，發明名稱同上的中國專利申請的分案申請。
背景技術：
：在過去十年已經由制藥工業通過提取或通過重組技術來普遍地生產涉及人保健的蛋白因子和激素。涉及所需基因的遺傳構建體在細菌、酵母或哺乳動物細胞系中成功地得到了表達。然而，使用哺乳動物細胞培養物來獲得復雜的蛋白質，如需要適當糖基化模式的那些，涉及高成本的方法。在過去十年已經日益增長地使用重組DM技術來生產商業上重要的生物材料。為此，已經克隆了編碼各種醫學上重要的人蛋白質的DNA序列。這些包括胰島素、纖溶酶原激活劑、otl-抗胰蛋白酶和凝固因子VIII和IX。目前，即使使用新出現的重組DNA技術，通常也從血液和組織中純化這些蛋白質，這是昂責而費時的方法，可能帶有傳播感染物質如導致ADIS和肝炎的那些的風險。盡管在細菌中表達DNA序列來生產所需的醫學上重要的蛋白質看起來是有吸引力的提議，實際上通常證明細菌作為宿主不能令人滿意，因為外源蛋白在細菌細胞中不穩定并且沒有得到正確地加工。認識到這個問題，已經嘗試了在哺乳動物組織培養物中表達所克隆的基因并已經在一些情況下證明了是可行的策略。然而，動物細胞的批量發酵是昂貴的且需要技術的過程。因此存在對用于生產生物物質如正確修飾的真核多肽的高產量，低成本方法的需要。在該方法中不存在對人感染性的物質將是一個優勢。為了在奶中獲得大量的人蛋白質，獲得所需基因的轉基因動物如牛的可能性已經引起了工業的極大興趣。文獻中的幾個小組報道了生產人血清清蛋白、cc抗胰蛋白酶的成功以及在轉基因牛或山羊中的一些其它實例。之前已經在小鼠或大鼠中進行了許多實驗，通常優選將轉基因表達限制于乳腺中，因為使用P酪蛋白或乳清蛋白啟動子，其只響應哺乳期雌性中的乳腺轉錄因子。異源蛋白專門在奶中的表達意欲避免對宿主動物健康的不利影響并提供容易的純化方法。目前人們致力于建立幾個系統來提高細胞轉染或選擇的產量，并選擇同源胎兒體細胞的來源來提高克隆動物的存活和免疫狀況。另一方面，出于農業和生物藥物的目的，存在對體細胞核移植的巨大興趣，主要是使原種家畜的繁殖和轉基因動物的工程化變成可能。簡要地，核移植(NT)包括受體卵母細胞的去核，接著將供體細胞移植至受體胞質體緊密并置的卵周隙中，并使它們融合。通過化學或物理激活來人工誘導發育。通過體細胞核移植來產生克隆的后代已經在綿羊(Campbell,K.H.等，iV""re380:64-66(1996),1996;Wells,D.N.等，"/o"e拜"7:385-393(1997);Wilmut，I.等，斑810-813(1997));山羊(Baguisi，A.等，射S/"ec/wo/":456-461(1999))和牛(Cibelli，J.B.等，Sc/e扁觀1256-1258(19981);Kato，Y.等，斑2095-2098(1998);Wells，D.N.等，ye/rod尸e""/erJft369-378(1998))中獲得了成功。存在幾個影響NT結果的因素，包括去核、融合、激活和供體-受體細胞周期同步性的方法。已經獲得了受體卵母細胞去核的高效率，使用DNA特異性活體染料來顯現染色質(Stice，S.L.和Keefer,C.L.，A'o7Wepro(/715-719(1993);Westhusin,M.E.等，/We;rof/Fe"http://夕J:475-480(1992))。供體細胞和受體卵母細胞的融合取決于脈沖場中細胞對準的準確度、供體細胞和受體卵母細胞的接觸和供體細胞的大小(Collas，P.等，^23/萬/oc力e邁2M:1-9(1993))。NT重建胚胎的激活已經得到精心的改進并且發育成胚泡的速度等于體外授精的卵母細胞(Liu，L等，#。//e/rocT齡伙298-307(1998))。已經實現NT胚胎的成功發育，使用成熟的卵母細胞(Willadsen,S.M.,iV""re觀63-65(1986))、合子(McGrath，J.和Solter,D.，ZerWo/#/《37-55(1985))和卵裂期的胚胎(Tsunoda,Y.等，/je/rocT尸e"http://夕f:275-281(1992))作為受體胞質體；然而，這取決于供體核的來源。受體胞質體和供體細胞之間的細胞周期的相容性是影響NT胚胎發育的一個重要因素。需要適當的同步化來保持重建胚胎的倍性。有絲分裂的細胞周期具有以下連續的期復制前間期(G1)、DNA合成(S)、有絲分裂前間期(G2)和有絲分裂(M)。在單個細胞周期過程中，在有絲分裂前所有基因組DNA復制一次。移植至去核成熟卵母細胞(中期II)中的間期供體核經歷幾次形態改變。融合后，但在供體核包膜分解(NEBD)之前，染色體濃縮(PCC)。這些改變通過BJ頃工fMDT7、A古"A劃(MAPK)的活性來誘導(Collas，P.和Robl，J.M.,AeprocTO:455-465(1991))。在所有減數分裂和有絲分裂的細胞中發現了MPF和MAPK活性且在中期最高，這些高含量在哺乳動物卵母細胞中還誘導了停止于中期II。通過授精或用鈣離子載體激活來減少MPF和MAPK是完成減數分裂、第二極體發射、精核解凝和前核形成的信號。周期。二倍體G。/d核濃縮成單染色單體，但是四倍體G2核濃縮成雙染色單體。然而，S期的核在移植時顯示出特征性的"粉碎"外觀；PCC產生大范圍的DNA破壞。因此，可以在激活時或激活之前將G!或G。的核移植至中期II的卵母細胞中來產生正確的倍性。第二種方法是將核移植至之前激活的S期的卵母細胞中，這種情況中，可以使用G,、G。或S期的供體細胞。因為MPF和MAPK是低的；染色質解凝，并經歷DNA復制沒有PCC和NEBD。已經在小鼠中報道了第三種同步化方案，其中通過胚胎重建來產生活的后代的發育，使用G2或中期供體細胞和去核的中期2卵母細胞(Cheong，H.T.等，Wo/腳rod化'958-963(1993);Kwon，0.Y.和Kono，T.,戶roc#a〃JcadSc/〃WW:13010-13013(1996))。報道了從NT重建胚胎中極體的擠出，導致單個二倍體胚胎和二倍體極體(Kwon,0.Y.和Kono，T.，/Yoc;V"/Jcat/iW夕義13010-13013(1996))。然而，沒有報道在牛、綿羊或豬中NT進入去核MII卵母細胞后極體的形成，提示物種之間在完整紡錘體的力學控制形成和極體的擠出中的差異。已經提出供體細胞和受體細胞周期的階段對于為供體細胞核重編程度也是重要的。增加供體核移植和合子轉錄之間的時間可以促進核重編程序。為此，幾位作者在融合后幾小時激活了卵母細胞(Cibelli，J.B.等,5We鮮廁1256-1258(1998));Wakayama，T.等，W""re規369-374(1998);Wells,D.N.等，5/o//e/iY^fft996-1005(1999))。其它報道應用了順序核移植(SUce，S.L.和Keefer，C.L.,Ae/7ro￡f化715-719(1993))。增加供體核重編程序時間的未考察過的方法是在間期II之前通過核移植。在生發泡破裂(GVBD)后，通過卵母細胞胞質MPF和MAPK的實質性增加來調控所有的核事件，其防止了核被膜的重建和進入S期直至授精或激活。因此，成熟^母細胞可以是用于間期或G2供體細胞的通用受體。如果激活在細胞分裂之前誘導了S期，甚至Gt或G。也可以用作供體細胞。當G2或M的卵裂球用作供體細胞時，核重編程序是可能的(Cheong，H.T.等,5/o/ieprod":958-963(1993);Kwon，0.Y.和Kono，T.,Jcad5W夕J:13010-13013(1996);Liu,L.等，及e/rod47:255-264(1997))。一種解釋是作為染色體濃縮的結果置換了染色質中的一些因子。實際上，對于核移植，已經認為NEBD和PCC是核重編程序的形態學征兆。此外，授精時精子染色質極端濃縮，它的體積比體細胞核的體積小得多，且卵母細胞具有除去精核蛋白的能力。在精子-卵母細胞融合的過程中，卵母細胞染色體也被濃縮。可能是濃縮的染色質構象具有一些生物關聯。因而，通過中期核移植模擬這種情況，中期去核的受體可以提高NT結果。然而，少數研究者已經在家畜中使用該方法并使用卵裂球作為供體細胞(Liu，L.，等，M7Weprod47:255-264(1997))。本發明的一個目的是表征現有的體細胞核移植并將其精心改進成用于從成體供體細胞生產遺傳上相同的牛的可靠而經濟的技術。
發明內容本發明涉及非人轉基因哺乳動物，其特征在于在其奶中以意想不到的高水平產生重組生長激素。重組生長激素可以是，但不限于，人生長激素。非人轉基因哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的動物。本發明進一步涉及提供目標蛋白在哺乳動物乳房細胞中表達的質粒，其中表達受到P酪蛋白啟動子的調控。目標蛋白可以是，但不限于，人生長激素。本發明還涉及制造在其奶中產生重組生長激素的非人轉基因哺乳動物的不同方法。重組生長激素可以是，但不限于，人生長激素。非人轉基因哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的動物。本發明還涉及生產目標蛋白的方法，包括制造在其奶中產生所述蛋白的非人轉基因哺乳動物，從所述非人轉基因哺乳動物獲得所述奶并從奶中純化所述蛋白質。目標蛋白可以是，但不限于，人生長激素。非人轉基因哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的動物。本發明還涉及從轉基因哺乳動物奶中生產和純化重組生長激素的方法。重組生長激素可以是，但不限于，人成長激素。非人轉基因哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的動物。圖1A-1B顯示了從轉基因奶牛收集的每日奶體積，該轉基因奶牛是通過融合去核的卵母細胞和之前用質粒轉染的成纖維細胞而獲得的，該質粒含有編碼人生長激素(hGH)的基因和指導其表達至乳房細胞的啟動子。圖2A-2C顯示了從相同轉基因奶牛收集的奶中發現的細菌計數。圖3A-3B顯示了在相同轉基因奶牛的奶中含有的hGH的生物活性。圖4A顯示了在相同轉基因奶牛的奶中產生的hGH的每日質量。該量值和從轉基因奶牛收集的每日奶體積一起作圖表示圖4B中。圖5A顯示了在相同轉基因奶牛的血清中的hGH和胰島素樣生長因子1(IGF-1)的濃度，和在相同轉基因奶牛的奶中產生的hGH的每曰質量。將轉基因奶牛的血清中的hGH濃度和轉基因奶牛的奶中產生的hGH的每日質量一起作圖表示于圖5B中。在圖5C中，將轉基因奶牛的hGH和IGF-1血清濃度的時間特征一起作圖。圖6A和6B顯示了在通過在其奶中產生hGH的轉基因奶牛的亞克隆而獲得的兩個轉基因小牛中hGH和胰島素樣生長因子1(IGF-1)的血清濃度。在圖6C和6D中，對這些轉基因小牛中每個的hGH和IGF-1血清濃度的時間特征一起作圖。發明詳述本發明涉及非人轉基因哺乳動物，其特征在于在其奶中以意想不到的高水平產生重組生長激素。該哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的動物。轉基因哺乳動物的其它物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、山羊物種或嚙齒動物物種。重組生長激素可以是，但不限于，人生長激素。該分子，也稱為促生長素，是由191個氨基酸構成的蛋白質，具有約22kD的分子量。它對于線性生長是必要的且其應用得到了很好地建立。本發明還涉及轉基因動物，其特征在于為了產生更多的含有所述激素的奶在其奶中產生的重組生長激素自我刺激了動物乳腺的事實。本發明還涉及質粒，該質粒包含可操作地連接于P酪蛋白啟動子和P內酰胺酶基因的編碼目標蛋白的基因。該目標蛋白可以是，但不限于，人生長激素。該質粒可以是pRPhGH。進一步的實施方案中，質粒另外包括新霉素抗性基因用于遺傳霉素抗性細胞的選擇。這樣質粒的實例是pRNeo。進一步的實施方案中，質粒包括編碼綠色熒光蛋白如GFP的基因，其在巨細胞病毒(CMV)啟動子的控制下。這樣質粒的實例是pRNeoGreen。本發明進一步涉及質粒如上迷的那些，其已經通過限制酶消化而線性化。尤其是，使用限制酶ApaLI并切除p內酰胺酶基因。根據布達佩斯條約正在進行上述質粒的保藏程序。保藏單位的名稱和地址是DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(德國微生物保藏中心)，MascheroderWeglb,38124Braunschweig,德國。在適當的時候將提供相應的保藏號。本發明進一步涉及基于含有Neo抗性基因的質粒而構建的質粒，其中在hGH編碼區上游插入了修飾的較短的P酪蛋白啟動子區，如pVEpcashGH。通過切除P內酰胺酶基因可以從質粒pVEPcashGH獲得線性片段。本發明進一步涉及用于遺傳構建體轉染的方法，使用用于脂質體應用的陽離子脂質的組合。還描述了在合適培養基中選擇新霉素抗性細胞的方法，如選擇綠色熒光轉基因細胞的方法。小心地挑選這些細胞，使得避免細胞損傷。本發明還涉及將停止于G。或細胞周期不同時間的細胞核移植至去核牛卵母細胞中的方法。本發明涉及將轉基因胚胎移植至激素刺激的奶牛子宮中的方法。根據本發明，公開了測定動物健康參數的方法。為了測定這些參數，對動物的血清和奶兩者進行了分析。本發明進一步涉及制造非人轉基因哺乳動物的方法，包括獲得編碼生長激素的基因，將基因克隆進質粒中，借此將基因可操作地連接至指導基因在乳房細胞中表達的啟動子，形成表達質粒，用該表達質粒轉染體細胞使得質粒摻入到細胞的基因組中，形成轉基因體細胞，將成熟卵母細胞去核，形成去核的卵母細胞，將一個轉基因體細胞與去核的卵母細胞融合形成單細胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中，并監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。本發明進一步涉及制造非人轉基因哺乳動物的方法，包括從雌性哺乳動物中提取體細胞，任選地為成纖維細胞，該哺乳動物是轉基因的以在其奶中產生重組生長激素，將成熟卵母細胞去核，形成去核的卵母細胞，將一個轉基因體細胞與去核的卵母細胞融合形成單細胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中，并監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。本發明進一步涉及制造非人轉基因哺乳動物的方法，包括使雌性非人哺乳動物超排卵，該哺乳動物是轉基因的以在其奶中產生重組生長激素，將該哺乳動物用從雄性非人非轉基因哺乳動物獲得的精子人工授精來產生胚胎，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中，并監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。本發明進一步涉及制造非人轉基因哺乳動物的方法，包括使雌性非人哺乳動物超排卵，該哺乳動物是轉基因的以在其奶中產生重組生長激素，將該哺乳動物用從雄性非人哺乳動物獲得的精子人工授精來產生胚胎，從中獲得精子的哺乳動物是轉基因的以產生重組生長激素，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中，并監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。本發明進一步涉及制造非人轉基西哺乳動物的方法，包括使雌性非人非轉基因哺乳動物超排卵，將該哺乳動物用從雄性非人哺乳動物獲得的精子人工授精來產生胚胎，從中獲得精子的哺乳動物是轉基因的以產生重組生長激素，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中，并監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。重組生長激素可以是，但不限于，人生長激素。非人轉基因哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的動物。本發明進一步涉及生產蛋白質的方法，包括制造在其奶中以意想不到的高產量產生目標蛋白的非人轉基因哺乳動物，從該非人轉基因哺乳動物獲得奶，并從奶中純化目標蛋白。本發明還涉及在非人轉基因哺乳動物中生產目標蛋白的方法，該哺乳動物是通過包括以下步驟的方法制得的獲得編碼所述目標蛋白的基因，將基因克隆進質粒中，借此將基因可操作地連接至指導基因在乳房細胞中表達的啟動子，形成表達質粒，用表達質粒轉染體細胞，任選地為成纖維細胞，使得質粒摻入到所述體細胞的基因組中，形成轉基因體細胞，將成熟卵母細胞去核，形成去核的卵母細胞，將一個轉基因體細胞與去核的卵母細胞融合形成單細胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中，并監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。本發明還涉及在非人轉基因哺乳動物中生產目標蛋白的方法，該哺乳動物通過包括以下步驟的方法制得從雌性哺乳動物提取體細胞，任選地為成纖維細胞，該哺乳動物是轉基因的以在其奶中產生，將成熟的卵母細胞去核，形成去核的卵母細胞，將一個轉基因體細胞與去核的卵母細胞融合形成單細胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中，并監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。本發明還涉及在非人轉基因哺乳動物中生產目標蛋白的方法，該哺乳動物通過包括以下步驟的方法制得使雌性非人哺乳動物超排卵，該哺乳動物是轉基因的以在其奶中產生所述的目標蛋白，將該哺乳動收集胚胎，將胚胎植二受體哺乳動物的子宮中，并監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。本發明還涉及在非人轉基因哺乳動物中生產目標蛋白的方法，該哺乳動物通過包括以下步驟的方法制得使雌性非人哺乳動物超排卵，該哺乳動物是轉基因的以在其奶中產生所述的目標蛋白，將該哺乳動物用從雄性非人哺乳動物獲得的精子人工授精來產生胚胎，從中獲得精子的哺乳動物是轉基因的以產生所述的目標蛋白，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中，并監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。本發明還涉及在非人轉基因哺乳動物中生產目標蛋白的方法，該哺乳動物通過包括以下步驟的方法制得使雌性非人非轉基因哺乳動物超排卵，將該哺乳動物用從雄性非人哺乳動物獲得的精子人工授精來產生胚胎，從中獲得精子的哺乳動物是轉基因的以產生所述的目標蛋白，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中，并監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。其特征在于在其奶中以意想不到的高水平產生目標蛋白的轉基因哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的動物。轉基因哺乳動物的其它物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、山羊物種或嚙齒動物動物。目標蛋白可以是，但不限于，人生長激素。本發明進一步涉及在其奶中產生重組人生長激素的牛物種的非人轉基因哺乳動物，它的基因組包含整合的質粒，所述的質粒包含人生長激素基因和指導所述基因在哺乳動物的乳房細胞中表達的P酪蛋白啟動子。本發明進一步涉及以意想不到的高水平產生hGH的轉基因哺乳動物，但沒有顯示以這樣高水平的hGH產生所期望的自然生長。由于轉基因牛受到人生長激素存在的影響，預期動物生長將超過非轉基因的生長速率，并患病如糖尿病、高血壓、心血管疾病提高的風險和身體器官的擴大，包括肝臟、脾臟、腎臟和心臟。理論上，這樣高含量的hGH應使得動物不能存活。然而，情況并非如此。哺乳動物，如奶牛，在其血液中含有令人擔憂的高水平的外源激素，但是其完全健康并產生顯著的重組蛋白生產力，構成意想不到的和創新的貢獻。本發明的重組人生長激素以意想不到的高水平產生。所產生的人生長激素的含量高于約1.Og/L奶。hGH的含量可以高于約2.Og/L奶。所產生的hGH的含量還可以高于約3.Og/L奶。另一實施方案中，所產生的hGH的含量可以高于約4.Og/L奶。仍然另一實施方案中，所產生的hGH含量可以高于約5.Og/L奶。進一步的實施方案中，所產生的hGH含量可以高于約6.Og/L奶。仍然進一步的實施方案中，所產生的hGH含量為約1.Og/L奶至約7.Og/L奶。進一步的實施方案中，所產生的hGH含量為約2.Og/L奶至約6.Og/L奶。仍然另一實施方案中，所產生的hGH含量為約2.Og/L奶至約5.Og/L奶。此外，本發明涉及從轉基因哺乳動物的奶中純化重組生長激素的方法，以及所述激素的測定法。純化方法可以包括色語和濃縮步驟。可以使用不同類型的色鐠，包括離子交換色語、反相色譜、分子排阻色譜或親和色譜。離子交換色譜可以是陰離子交換色譜。親和色譜可以是免疫親和色鐠。此外，可以進行多個色譜步驟。本發明進一步涉及從產生重組生長激素的非人轉基因哺乳動物的奶中純化重組生長激素的方法，包括將非人轉基因哺乳動物的奶澄清，得到澄清的奶，并對澄清的奶進行色譜，得到純化的重組生長激素。本發明進一步涉及從產生重組生長激素的非人轉基因哺乳動物的奶中純化重組生長激素的方法，包括將非人轉基因哺乳動物的奶澄清，得到澄清的奶，并對澄清的奶進行膨脹床陰離子交換色謙，得到陰離子交換色譜過的物料，對陰離子交換色譜過的物料進行反相色譜，得到反相色譜過的物料，對反相色鐠過的物料進行陰離子交換色譜，得到陰離子交換色鐠過的物料，對陰離子色鐠交換過的物料進行分子排阻色譜，得到分子排阻色譜過的物料，將分子排阻色語過的物料濃縮，得到濃縮的物料，并對濃縮的物料進行分子排阻色鐠，得到純的重組生長激素。本發明還涉及從產生重組生長激素的非人轉基因哺乳動物的奶中純化重組生長激素的方法，包括將非人轉基因哺乳動物的奶澄清，得到澄清的奶，并對澄清的奶進行免疫親和色i普，得到免疫親和色鐠過的物料，對免疫親和色譜過的物料進行反相色譜，得到反相色譜過的物料，對反相色譜過的原料進行陰離子交換色譜，得到陰離子交換色謙過的物料，對陰離子交換色譜過的物料進行分子排阻色譜，得到分子排阻色鐠過的物料，對分子排阻色鐠過的物料進行濃縮，得到濃縮的物料，并對濃縮的物料進行分子排阻色譜，得到純的重組生長激素。上述純化方法的重組生長激素可以是，但不限于，人生長激素。轉基因動物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動物。具體實施例方式以下實施例是本發明方法和組合物的說明，而不是限制。在化學合適的本領域技術人員顯而易見的修改和改進在本發明的精神和范圍內。實施例1表達質粒的構建我們生產了帶有大部分牛P酪蛋白基因啟動子的構建體，包括5，-非編碼P酪蛋白棊因區的短片段，與人生長激素基因的編碼序列融合。不同構建體中所用的P酪蛋白區從3.8kbp減小至約1.3kbp。根據是否包括內在的polyA信號，hGH基因包括約2至2.2kbp。在pUC或pBS類型的通常的克隆栽體的多接頭中容納表達盒。該啟動子確保基因的組織特異性和發育可調型表達在其控制下，如P酪蛋白，和這種情況中的異源hGH。最具代表性的質粒是pRPhGH,其攜帶全長牛P酪蛋白啟動子，與人生長激素基因的編碼序列融合。公開的其它構建體主要源自如所述的原始的構建體，來提高轉染細胞的選擇或DM進入牛細胞基因組的整合效率。第一階段中，用含有遺傳霉素抗性基因的質粒進行共轉染來幫助選擇，但是接著，使用其它構建體，在含有hGH表達盒的相同載體中帶有用于新霉素抗性的NPT基因。這樣質粒的實例是pRNeo。獲得用于組成型表達綠色熒光蛋白的另一種質粒，其包括CMV啟動子，植物來源(苜蓿)的增強子和來自水母丄W"oria的綠色熒光蛋白基因。這樣質粒的實例是pRNeoGreen。此外，生產了另一種質粒。這是基于含有Neo抗性基因的質粒來構建的，其中在hGH編碼區上游插入了修飾的較短的p酪蛋白啟動子區。該質粒是pVEPcashGH。生產了其它構建體，其中通過ApaLI限制酶切除了p內酰胺酶區，并在瓊脂糖凝膠電泳和凝膠提取后純化含有完整表達盒的線性片段。通過限制酶和DNA測序來分析構建體，并預先在乳腺細胞系中通過熒光抗體識別測試它們進行hGH表達的能力。將作為涉及遺傳構建體這部分的實例來詳細描述質粒pVEPcashGH的制備。pVEPcashGH的制備該構建體的目的是提供P酪蛋白啟動子區的最小延伸以指導下游立即融合的hGH基因，與其在宿主生物中的polyA信號一起的特定可調型轉錄。使用pVEX作為原始載體允許使用通過已經存在于該質粒中的tk啟動子調控的新霉素抗性基因。通過用Stul和Ndel限制來消除包括554bp的早期SV40啟動子，最后的位點用Klenow填補，且自我連接所得到的載體。PCR擴增來自3.8kbp原始基因啟動子區的1.3kbp片段后獲得了P酪蛋白短的啟動子，使用以下寡聚物作為引物PB15，TCTACTCGAGGATCATCTATCTGTCCCAAAG(SEQIDNO:1)和PB25，CTAGGATCCAATGATCTGATTTTGTGG(SEQIDNO:2)該片段包括1230bp的規范啟動子加49bp的P酪蛋白基因的第一個非編碼外顯子。通過PCR技術獲得了hGH基因片段，基于原始的牛基因組hGH克隆，使用以下的寡聚物作為引物PB45，CTAGGATCCATGGCTACAGGTAAGCGCC(SEQIDNO:3)和GHTE5，ATGCTGTGTCTGGACGTCCT(SEQIDNO:4)用Klenow酶將p酪蛋白啟動子片段平截并插入pVEX的BamHI填補的位點。選擇重組克隆后，我們選擇適于使用位于pVEX下游的唯一HindIII位點的特定方向來插入hGH編碼區。為此，將hGH片段也平截了并填補了質粒HindIII位點。選擇含有P酪蛋白啟動子和恰當融合的hGH的克隆使得只在該啟動子的控制下表達hGH。該質粒的大小約為8.5kbp。體細胞的轉染然后將質粒pRPhGH(與另一帶有遺傳霉素抗性基因的質粒一起)、pRNeo、pRNeoGreen或pVEPcashGH用于轉染體細胞的初級培養物，使用磷酸鈣或脂質體方法。通常使用胎牛成纖維細胞來待轉染。將遺傳霉素加入培養物中來選擇轉染的細胞。2至8周后，對遺傳霉素具有抗性的細胞適于用作供體細胞來獲得轉基因克隆。通過PCR分析轉染的所選擇的細胞含有表達盒，以確保合適的核移植來產生轉基因胚胎。實施例2卵母細胞的去核和成熟去核卵母細胞中的中期核移植牛卵母細胞的收集和體外成熟從屠宰場卵巢中吸出牛的卵母細胞并在TCM-199+5%FCS中于39^成熟24小時。在使用前用C02平衡成熟培養基至少2小時。在含有lmg/ml牛睪丸透明質酸酶的溫熱TL-HEPES中渦旋2分鐘使成熟的卵母細胞棵露。使用卵丘細胞進行核移植去核寸吏用Narishige液壓顯樣i操作器和NikonDiaphot顯樣i鏡將卵母細胞機械去核。用20lam斜角的和削尖的吸管進行去核。之前用g/ml的bisbenzimidine(Hoechst333421)染料將卵母細胞染色20分鐘。在紫外線下通過觀察被染色的染色體將中期去核。在吸管之內抽吸后評估中期染色體。將轉基因體細胞移植至卵周隙中并嚴格地與去核的卵母細胞相對。融合將轉基因體細胞和去核的卵母細胞在融合室中人工對準使得待融合的膜平行于電極。使用玻璃的胚胎操作吸管來進行。通過電方式進行融合使用180伏特/cm的一個電脈沖進行融合15us(BTXElectroCellManipulator200)2并用BTXOptimizer-GraphicPulseAnalyzer來監控。用于脈沖胚胎的室由相隔0.5mm放置于玻璃的顯微鏡載玻片上的兩個0.5mm的不銹鋼絲電極組成。監控假定合子的融合、溶胞和斷裂。發育能力的評估在授精后48小時評價合子的斷裂并在7至9天后評價發育成桑椹胚或胚泡。'SigmaChemicalCo.,St.Louis,M0，USA2BTXInc.，SanDiego，Ca，USA實施例3細胞和胚胎培養在實驗中測試不同的供體細胞、培養系統和卵母細胞受體處理，目的在于簡化牛克隆程序中的方法并提高胚胎的存活率。當成體成纖維細胞用作供體細胞時，使用了重建胚胎的三種培養系統TCM-199+5%FCS，Menezo+5%FCS(兩者都含有VERO細胞作為共培養物)和無共培養物但是具有較低02濃度的S0F。當供體細胞是遺傳上和非遺傳上修飾的胎兒成纖維細胞時，也將S0F培養基用于培養重建的胚胎。最后，當遺傳上修飾的胎兒成纖維細胞用作供體細胞時，之前用roscovitine(R)處理受體卵母細胞來中止減數分裂并最佳化受體的適用性。從屠宰場卵巢中吸出卵母細胞并在TCM-199+5%FCS中于39°C成熟24小時。對于R處理的組，在成熟之前，在TCM-199+5%FCS中將卵母細胞與25jaMR在39t;溫育24小時。在含有lmg/ml牛睪丸透明質酸的TLHEPES中渦旋3分鐘使成熟的卵母細胞棵露。評估中期并在紫外線下(<6秒)通過用Hoechst33342(5mg/ml)觀察將卵母細胞去核。將來自Augus公牛的成體成纖維細胞和來自45天大的Jersey雌性胎兒的胎兒成纖維細胞用作供體細胞。使用脂質體進行用含有新霉素抗性基因的構建體的轉染。用遺傳霉素選擇10-15天后，通過電脈沖將G。/G,期的供體細胞與去核的卵母細胞融合。3小時后，通過在TL-HEPES中與5jnM離子霉素孵育4分鐘和與2mM6-DMAP賻育3小時來誘導激活。然后用TL-HEPES洗滌卵母細胞并在TCM-199+5%FCS+10g/l清蛋白中或在Menezo+2°/。FCS中(兩者都含有VER0細胞)，或在S0F培養基和5%C02+5%02+90°/。^中共培養。通常，每個受體奶牛非外科手術地移植兩個胚泡，并通過超聲波在30-35天測定懷孕。記錄卵裂(48小時)、發育成胚泡(第7至9天)并通過Chi-square來分析。在S0F中培養胚胎時，卵裂率和發育成胚泡較高。然而，沒有觀察到由于不同培養條件或供體細胞來源的懷孕率的差異。中止減數分裂成熟24小時沒有損害受體卵母細胞的發育能力。因此，用roscovitine處理可以用于提高NT方法中的卵母細胞的有效性。參見以下的表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>欄中具有不同上標的百分數是有差異的(P<0.05)。使植入的奶牛正常通過懷孕直至自然分娩。最后，chirurgic方法(Caesarea)可以用于分娩。在頭48小時期間給新生兒喂養富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(所有都不含動物來源的化合物)。實施例4對轉基因小牛和所產生的重組蛋白進行的測試該實施例中，我們呈現了對特定的轉基因小牛及其產生的重組蛋白所進行測試的完整描述，該轉基因小牛是作為實施例1至3中所述方法的結果而獲得的。盡管如此，尚須清楚的是對作為其它獲得轉基因小牛方法，如以下實施例5和6中所述的那些方法的結果而出生的動物進行了同一套的測定。通過對從小牛白細胞中純化得到的DNA進行PCR反應，使用非轉基因jersey小牛的DNA作為負對照，證明了在轉基因小牛細胞的基因組中包括牛P酪蛋白啟動子和hGH編碼基因。可以作為不同于動物的同源P酪蛋白基因的單一DNA片段一起發現它們。使用Pharmacia自動測序儀，證實了插入的基因序列100°/。對應于hGH編碼基因。其包括內含子、分泌信號和終止子。將控制在我們的小牛中相同hGH基因表達的牛P酪蛋白啟動子也進行了測序。所有那些元件與其預期的理論序列精確地一致，該理論序列來自用于轉化細胞的遺傳構建體，從該細胞產生了克隆。一旦已知該實驗遺傳階段的正確性，我們便轉向證明所產生的重組蛋白是所期望的并在每一個物理和化學特性方面都與天然hGH相一致。為此，我們不得不從小牛獲得奶，由于當動物處于產奶時間時，P酪蛋白啟動子使得重組蛋白只在乳腺中表達。然后通過激素處理來誘導轉基因小牛使其到滿十個月時產奶。到那個時間小牛稱重為240kg(約530lbs)。所述處理的第一階段包括通過皮下途徑，聯合給予雌激素(雌二醇苯甲酸酯，Histeren,InstitutoRosenbusch)和孕激素(甲孕酮醋酸酯，Pronal,Aton)，包括5次連續應用每種藥物，劑量分別為0.1mg/kg和0.25mg/kg，每48小時(即，第1、3、5、7和9天，假定處理開始于第一天)。第二個階段包括通過皮下途徑，給予地塞米術>(Decadron,Sidus)和催產素(Orasthin,HoechstMarionRoussel);將總量為20mg的前者在第18至20天的時間段內進行注射(每天為所述總量的三分之一)，而在第21至23天應用三次50IU的后者。上述信息總結于表2中表2_<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如所期望的，在處理結束后奶牛開始產生初乳，然后所產生流體的品質逐漸變成奶。將收集的流體適當地保存并徹底地分析。對初乳和奶(為了簡化，初乳和奶在下文中都稱為"奶"，除了當應該進行區分時)進行了幾個測試，其結果顯示于圖1-4中。首先，測量所收集奶的體積。開始的奶生產力(頭五個泌乳日)約為1，650mL/天。在第一個產奶月中，每天進行兩次手工擠奶，一次在上午，一次在下午(可以注意每個乳房對終體積的貢獻)；而從第二個月起，因為奶的產生開始增加，每天進行三次擠奶(在上午、中午和下午)。每天的體積以或多或少的連續方式增加，直至頭次擠奶后三個月達到接近于10,000mL。在每日奶體積對日期的曲線(圖IB)中可以觀察到關于該主題的詳細信息(圖1A)。與奶體積的測量平行，對奶進行了微生物學測定，其結果(圖2A)顯示于每mlCFU(菌落形成單位)對日期的相應曲線中(圖2B-2C)。還通過在NB2細胞培養物中的體外生物活性測定評估了(hGH的)生物活性(圖3A-3B)。證明了小母牛的奶中產生的重組hGH的生物活性在母親的誤差等級內，處于人天然hGH的正常值。此外，通過蛋白質印跡研究了所獲得的奶，檢測了其中主要的條帶，對應于完整hGH。還發現了對應于斷裂變體和聚集體的其它次要條帶，如在這些生產系統中所預期的。利用關于生物活性和每日體積的信息，可以使用公式1來計算hGH的日產量，其中mhGH是以毫克計的每日產生的hGH質量；BA，以國際單位表示的生物活性；SA，hGH的比活性(3IU/mg);和V，每日收集奶的體積。數據顯示于圖4A中。hGH每日質量的曲線顯示于圖4B中。為了建立hGH每日質量和每日奶體積之間的直觀關聯，也將后者作圖表示于圖4B中。邁力^=_^_(公式1)可以從該信息觀察到，奶中hGH的每日質量和每日奶體積隨著奶牛的發育趨于增加(盡管，前者以更大的比例)，其構成重組激素生產力(每升奶中的hGH克數)的上升趨勢。可以注意到該生產力從產物是初乳時的約每升2ghGH(頭次擠奶)至從第二個泌乳月起的每升奶5ghGH的平均量。因此，隨著生產力的提高獲得了意想不到高產量的人生長激素，隨著流體的品質從初乳變成奶以或多或少連續的方式。盡管目前每天產生的hGH質量是相當顯著的，但是應該注意到，因為奶牛還沒有完全生長，每天產生的重組蛋白的質量上升趨勢應該會在將來持續，直至達到最大值。對奶進行測試的同時，對奶牛的血清進行了一套不同的測定，其結果顯示于圖5A-5C中。首先，進行奶牛血清中hGH濃度的測量。將結果(圖5A)與奶中hGH的每日質量一起作曲線于圖中，使得可以比較兩個量值(圖5B)。(人)血清中GH的參考范圍是0.06-5ng/ml。假定對于牛是假設的相似范圍，可以注意到，除了開始時，轉基因奶牛血清中hGH對日期的整個曲線完全超過所述范圍的上限。盡管該事實，必須考慮盡管對于它們的氨基酸序列和3D-結構，hGH和相應的牛激素(bGH)非常相似，前者，盡管是完全功能性的，但在牛中不是完全活性的。因此，為了評估由于在其血清中這些高含量的hGH對奶牛健康的潛在風險，同時進行了IGF-1(胰島素樣生長因子1，也稱為促生長因子C)血清濃度的測量(圖5A)。生長激素主要通過在肝臟中形成的IGF-1執行其功能。因為IGF-1介導許多體內細胞分裂和生長激素的代謝作用，所以IGF-1評估對于可疑的生長激素失調的間接評價是有價值的診斷工具。因此，IGF-1代表生物可利用的生產激素的可靠指示物。這些分析的結果與對應于hGH的結果一起顯示于圖5C中，可以同時觀察兩個量值。此外，為了具有對照組并因此建立與對應于轉基因奶牛數據的比較，測量了非轉基因奶牛組血清中的IGF-1和hGH。對于非轉基因組和轉基因奶牛的兩種蛋白質測量的平均值顯示于以下的表3中。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>值得注意的是非轉基因組中hGH的平均血清濃度位于假設參考范圍內，而轉基因奶牛的平均值完全超過所述范圍的上限。此外，無容置疑的是轉基因動物血清中的IGF-1平均含量絕對高于對應于非轉基因奶牛的，其構成根本的差異。因此，盡管轉基因奶牛血清中hGH的高濃度(已知其在人中導致具有嚴重后果的疾病，如糖尿病、高血壓、心血管疾病提高的風險和身體器官的擴大，包括肝臟、脾臟、腎臟和心臟)理論上將使得動物不能存活，這明顯地并不能代表對其健康和保持良好狀態的障礙。在其血液中具有令人驚訝高含量的外源激素，但是其完全健康并產生突出產量的重組蛋白的奶牛構成意想不到的和創新的貢獻，本發明另一創新的方面是進入奶牛血流中的重組hGH,刺激乳腺產生更多的奶。該作用是間接獲得的，即，通過IGF-1的作用。該分子提高了通過乳腺的血液流動，提供了用于合成乳脂、蛋白質和乳糖的關鍵前體物質。因此，IGF-1起指導營養物通過血液流向乳房細胞的作用，在乳房中它們幫助產生奶。因此，獲得了自我刺激的動物，因為轉基因奶牛的奶中產生的重組hGH通過乳腺刺激促進了動物產生的奶體積的持續增加，相應地在其奶中分泌更多的hGH。實施例5通過亞克隆獲得轉基因小牛使用1.5mm直徑的針從轉基因小牛的耳朵取出五個組織樣品，為了該目的之前已經將針的末端做成了斜角。將樣品在含有抗生素和抗真菌劑的基于PBS的培養基中冷凍運送至實驗室。然后，將組織樣品在含有10%胎牛血清和抗生素的MEM培養基中在39C和5%0)2氣氛下溫育72小時。最終，取出組織樣品，使平板周圍的成纖維細胞生長直至連生。一旦達到連生，為了獲得它們在G。期的同步化，將成纖維細胞至少孵育5天而沒有改變培養基，通過用顯微鏡觀察來評估。胰蛋白酶作用后，將單個成纖維細胞與根據實施例2的去核牛卵母細胞融合，將因此荻得的胚胎在S0F培養基中和5%CO2+5%O2+90%N2氣氛下培養直至胚泡的階段。然后，通常在每個受體奶牛中非外科手術地移植兩個胚泡，并通過超聲波在30-35天測定懷孕。使植入的奶牛正常地從懷孕直至自然分娩。最終，可以使用chirurgic方法(Caesarea)來分娩。在頭48小時給新生兒喂養富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(它們都不含動物來源的化合物)。圖6A和6B顯示了同時進行的通過亞克隆轉基因奶牛獲得的兩個轉基因動物的hGH和IGF-1血清濃度的測量，并將這些分析的結果分別作圖于圖6C和6D中，使得可以同時觀察每個動物的兩個量值。由于目前小牛是年輕的，hGH和IGF-1兩者的值仍然位于各自的參照范圍內，但是預期它們將與從中獲得了這兩個克隆的轉基因奶牛一樣升高。實施例6通過將超排卵的轉基因奶牛人工授精來獲得轉基因小牛該實施例中將公開獲得轉基因牛的可替換的方法。該方法包括通過激素處理使轉基因奶牛超排卵；將所述的奶牛人工授精；收集因此產生的胚胎；將所述胚胎植入代孕奶牛中；并產生懷孕直至動物的出生。以下呈現了該方法的描述。超排卵在笫1天(即，方法開始的那天)的早晨，通過肌內途徑將150iag的前歹'J腺素(D(+)-clorprosteno1，Arsaprost,Arsa)給藥于轉基因奶牛。使動物接受每天4kg的含有約15%蛋白質的膳食(在第1天之前，動物已經給予2kg食物，含有相同含量的蛋白質)。在第8天的早晨，陰道內放入黃體酮的CIDR(受控內部藥物釋放)裝置。此外，通過肌內途徑給予50mg黃體酮和雌二醇。喂養動物的食物量提高至6kg/天，含有相同含量的蛋白質。然后，在第12、13和14天兩次肌內注射FSH和LH(PLUSET,Calier)(—次在早晨，另一次在下午)。接下來的一天(第15天)，通過肌內途徑繼續給藥處理，兩次注射PLUSET(—次在早晨，另一次在下午)和兩次注射每次150jag前列腺素(相同給藥方案)。在第16天的早晨，除去CIDR。整個超排卵期給予的？1^387@總量為350IU。該階段包括來自供體jersey公牛的精子的三次連續給予(第一次和第二次，各自在第17天的早晨和下午，最后一次，在第18天的早晨)，之前已經獲得精子并冰凍保存以保持游動精子的存活力。收集胚胎并將它們植入代孕奶牛中在第26天的早晨通過用1LDMPBS(Nutricell)沖洗奶牛子宮的兩個角來收集胚胎。此后立刻在每個受體奶牛中非外科手術地移植兩個胚胎，并通過超聲波在30-35天測定懷孕。使植入的奶牛正常地從懷孕直至自然分娩。最后可以使用chirurgic方法(Caesarea)來分娩。在頭48小時給新生兒喂養富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(它們都不含動物來源的化合物)。由于生物后代的產生遵循孟德爾遺傳定律，作為上述方法的結果出生的動物的一半是轉基因的，這些中的一半是雄性，而另一半是雌性。因此，存在獲得轉基因雄性(起始動物)的高概率，為了擴大轉基因畜群，其精子可以用于建立jersey轉基因精子的母種庫(MasterBank)，用于超排卵的轉基因/非轉基因奶牛的授精。實施例7從奶中純化重組hGH一旦證實近似分子量、蛋白質印跡的結果和小牛的奶中產生的重組hGH的生物活性是正確的，就進行徹底的純化過程，因為當制造生物藥物產品時，為了避免所述產品中存在可能的污染物，必不可少的是應該將目標蛋白純化至均一性。該過程包括以下步驟通過離心獲得奶的撇渣并將獲得的上清液稀釋以達到最終保留于酪蛋白膠束中的重組hGH更好的溶解度(澄清)；并使該溶液通過膨脹床陰離子交換色譜柱(該步驟可替換的方案是使用免疫親和柱，參見以下的實施例8);使所得到的溶液接受反相HPLC(C4)步驟；然后對富含重組hGH的級分進行陰離子交換色傳。將純化的物料脫鹽、濃縮并接受分子排阻色鐠。為了獲得純的重組hGH，通過分子量來分離。從奶中純化人生長激素(hGH)的方法包括以下步驟，依次為(a)澄清(b)膨脹床陰離子交換色譜，(c)反相色譜，(d)陰離子交換色鐠，(e)分子排阻色譜(脫鹽)，(f)濃縮和(g)分子排阻色譜。澄清為了獲得0.5%的溶液，將新鮮的奶與足量的吐溫80混合。加入吐溫80后，加入2M的Tris-HC1來獲得7.3±0.1的pH。然后，將產物均化30分鐘，然后為了分離脂肪層在14000g下離心。之后，將所得到的溶液用0.5%的吐溫80稀釋直至低于或等于1500/jS/cm的傳導率。用2MTris-HCl將pH調節至7.3±0.1，然后將產物通過0.8jam孔的膜過濾并方便地保存。膨脹床陰離子交換色鐠根據以下參數，使用陰離子交換基質將前一步驟所獲得的物料進行色鐠1.設備A.柱子1)直徑5cm2)床高30cm(壓實的床)3)基質a)StreamlineQXL(Amersham)b)體積600ml2.溶液和緩沖液A.0.5NNaOHB.20%乙醇C.緩沖液A:20mMTris.HCl,pH7.3D.緩沖液B:500mMTris.HC1，pH7.3E.緩沖液C:20mMTris.HCl，150mMNaCl，pH7.3F.緩沖液D:20mMTris.HCl，500mMNaCl，pH7.33.待色譜的物料A.澄清的奶B.樣品條件1)體積25±5L2)傳導率<1500uS/cm3)pH:7.3土0.1為了平衡柱子，使1.5倍柱體積("vc")(900niL)的純水通過柱子，流速為115士5cm/小時(下行流)。然后，使下列溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速為230±30cm/小時(上行流)3.0vc(1，800ml)的0.5NNaOH;3.0vc(1，800ml)的純水；1.0vc(600ml)的緩沖液B;和最后，3.0vc(1，800ml)的緩沖液A。一旦柱子得到了平衡，裝載待色譜的物料。所述裝栽在12士3X:下和以230±30cm/小時的流速進行。此后，以115±15cm/小時的流速和在相同的溫度下進行洗脫。首先，使足夠量的緩沖液A通過柱子(上行流)，其次使下文中詳述的溶液和緩沖液以下列次序通過柱子(下行流)1.5vc(900ml)的緩沖液A;2.0vc(1,200ml)的緩沖液C;和最后，2.0vc(1,200ml)的緩沖液D。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下的溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子1.5vc(900ml)的純水；1.5vc(900ml)的0.5NNaOH;2.0vc(1，200ml)的純水；1.0vc(600ml)的緩沖液B;1.5vc(900ml)的純水；和最后，1.5vc(900ml)的20%乙醇。測定所選擇的含有hGH級分的總蛋白(通過Bradford方法)和目標蛋白(通過RIA)，并保存于2-8匸。反相色譜根據以下參數將前一步驟所獲得的物料進行色謙1，設備A.柱子1)直徑4cm2)床高48cm3)基質a.BakerBondWide-PoreButyl(C4)15jimprepLCPacking(Baker)b,體積600ml2.溶液和緩沖液A.移動相l(MPl):30mMNaHC03，pH7.2:純水乙腈(35:55:10)B.移動相2(MP2):30mMNaHC03，pH7.2:純水乙腈(20:10:70)C.50%曱醇3.待色譜的物料A.從前一步驟得到的所選級分的集合體B.樣品條件1)體積30±15L2)pH:7.3±0.3為了平衡柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于或等于478cm/小時0.3vc(180ml)50%甲醇；此后，運用50。/4甲醇-MP2的梯度，從所述溶液100:0的比例開始直至達到在1.Ovc(600ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；一旦完成梯度，使1.Ovc(600ml)的MP2通過柱子；此后，運用MP2-MP1的梯度，從所述溶液100:0的比例開始直至達到在1.Ovc(600ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；和最后，使2.Ovc(1，200ml)的MPl通過柱子。一旦柱子得到了平衡，使待色譜的物料通過0.45um孔的膜過濾，此后立即裝載。所述裝栽在20土5X:和低于或等于238cm/小時的流速下進行。此后，在478土78cm/小時的流速和相同的溫度下進^f亍洗脫，使下文中詳述的溶液和緩沖液以以下的次序通過柱子1.Ovc(600ml)的MP1;MP1-MP2的梯度，從所述溶液65:35的比例開始直至達到在18.Ovc(9，OOOml)的總體積中所述溶液45:55的比例；1.Ovc(600ml)45:55比例的MP1-MP2;和最后，2.Ovc(1，200ml)的MP2。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，運用MP2-50。/。曱醇的梯度，從所述溶液100:0的比例開始直至達到在1.Ovc(600ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；和最后，使2.Ovc(1，200ml)的50%甲醇通過柱子。通過SDS-PAGE測定該色語所得到的級分，均質性為20%且對于氧化的hGH，根據結果，進行選擇。此后，測定所選擇的含有hGH級分的總蛋白(通過Bradford方法)，并保存于2-8'C。陰離子交換色i普使用陰離子交換基質將前一步驟所獲得的物料進行色^普，如下1.設備A.柱子1)直徑5cm2)床高25cm3)基質a.Source30Q(Pharmacia)b.體積500ml2.溶液和緩沖液A.20%乙醇B.溶液K:0.5NNaOH,3MNaClC.溶液L:50mMTris，pH7.50D.溶液M:0.INHCl，3MNaClE.移動相3(MP3):溶液L:乙腈(70:30)F.移動相4(MP4):50mMTris，0.1MNaCl，pH7.50:乙腈(70:30)3.待色鐠的物料A.從前一步驟獲得的所選級分B.樣品條件1)體積4.5±1L2)pH:7.2±0.2為了平衡和清潔柱子，使以下的溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于或等于183土20cm/小時1.Ovc(500ml)純水；l.Ovc(500ml)的溶液K;1.Ovc(500ml)的溶液L;和最后，1.Ovc(500mL)的MP3。一旦柱子得到了平衡，裝載待色鐠的物料。所述裝載在2G士5X:和低于或等于183cm/小時的流速下進行。此后，在183土20cm/小時的流速和相同的溫度下進行洗脫，使下文中詳述的溶液和緩沖液以以下的次序通過柱子1.Ovc(500邁1)的MP3;MP3-MP4的梯度，從所述溶液15:85的比例開始直至達到在5.Ovc(2500ml)的總體積中所述溶液25:75的比例；和最后，使2.Ovc(1000ml)的MP4通過柱子。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，將以下溶液或緩沖液以下文中詳迷的量按次序通過柱子MP4-純水的梯度，從所述溶液100:0的比例開始直至達到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；0.5vc(250ml)的純水；純水-溶液K的梯度，從所述溶液100:0的比例開始直至所述達到在0.5vc(250ml)的總體積中溶液0:100的比例；l.Ovc(500ml)的溶液K;溶液K-純水的梯度，從所述溶液100:0的比例開始直至達到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；0.5vc(250ml)的純水；純水-溶液M的梯度，從所迷i^液100:0的比例開始直至達到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；1.Ovc(500ml)的溶液M;溶液M-純水的梯度，從所迷溶液100:0的比例開始直至達到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；1.0vc(500ml)的純水；純水-溶液L的梯度，從所述溶液100:0的比例開始直至達到在0.5vc(250ffll)的總體積中所述溶液0:100的比例；0.5vc(250ml)的溶液L;溶液L-純水的梯度，從所述溶液100:0的比例開始直至達到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；和最后，1.5vc(750ml)的純水。測定所選的含有hGH級分的總蛋白(通過Bradford方法)，并保存于2-8匸。分子排阻色謙使用分子排阻基質將前一步驟所獲得的物料進行色譜，如下1.設備A.柱子1)直徑5cm2)床高25cm3)基質a.CellufineGH25(Millipore)b.體積500ml2.溶液和緩沖液A.0.5NNaOHB.20%乙醇C.緩沖液C:150mMNaH氛pH7.2D.緩沖液G:320mM甘氨酸，10mMNaH2PO4，0.1%吐溫80，pH6.93.待色鐠的物料A.從前一步驟得到的所選級分B.樣品條件1)體積0.5士0.2L2)pH:7.5±0.5為了平衡和清潔柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于或等于180cm/小時1.0vc(500ml)的純水；l.Ovc(500niL)的0.5NNaOH;0.5vc(250ml)的純水0.5vc(250ml)的緩沖液C;和最后，2.Ovc(1000ml)的緩沖液G。一旦柱子得到了平衡，裝載待色鐠的物料。所述裝載在20±5匸和183土20cm/小時的流速下進行。此后，在相同流速和溫度下進行洗脫，并使l.0vc(500ml)的緩沖液G通過柱子，運行所需進行的次數。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子0.5vc(250ml)的純水；1.Ovc(500ml)的0.5N歸H;0.5vc(250ml)的純水；0.5vc(250ml)的緩沖液C;0.5vc(250ml)的純水；和最后，1.5vc(750ml)的20%乙醇。測定所選的含有hGH級分的總蛋白(通過Bradford方法)，并保存于2-8t:。濃縮根據以下所述的條件將前一實施例中所得到的級分濃縮1.設備A.蠕動泵WatsonMarlow—Cat，No.302SB.管道WatsonMarlow-Cat.No.902.0080.016C.濃縮器PrepScaleMillipore—Cat.No.CDUF006LC2.溶液和緩沖液A.0.28%的十二烷基硫酸鈉(SDS)B.0.06%的TritonC.0.125NNaOHD.緩沖液G:320mM甘氨酸，10mM的NaH2P04，0.1%的吐溫80，pH6.93.待處理的物料A.從前一實施例獲得的所選級分B.樣品條件1)體積1.0±0.5L2)傳導率1200±lOOyS/cm3)pH:6.9±0.1首先清洗、清潔和平衡設備，并使以下次序的溶液和緩沖液流過設備2L的0.125NNaOH;10L的純水；和最后，2L的緩沖液G。然后準備好設備以便用于按照通常的方法，濃縮所選的級分。進行濃縮程序直至達到15mg/ml的蛋白濃度(通過Bradford方法測得)。使所選的級分通過0.22jum孔的膜過濾，測定總蛋白(通過Bradford方法)，并保存于41c。所選級分的傳導率和pH分別為1，100-1，300mS/cm和6.9±0.1。分子排阻色鐠使用分子排阻基質將前一步驟所得到的物料進行色鐠，如下1.設備A.柱子1)直徑5cm2)床高92cm3)基質a.SephacrylS-200HighResolution(AmershamPharmacia)b.體積1，800ml2.溶液和緩沖液A.0.5NNaOHB.20%乙醇C.緩沖液H:320mM甘氨酸，2.2mMNaH2P04，1.8mMNa2HP04，pH7.303.待色譜的物料A.從前一步驟所選的，濃縮的級分B.樣品條件1)體積40±20ml2)傳導率l,200±100pS/cm3)pH:7.3±0.1為了平衡和清潔柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于46cm/小時1.Ovc(1，800ml)的純水;1.Ovc(1，800ml)的0.5NNaOH;和最后，2.0vc(3，600ml)的緩沖液H。一旦柱子得到了平衡，裝載待色鐠的物料。所述裝載在20±5匸和46士15cm/小時的流速下進行。此后，在相同流速和溫度下進行洗脫，并使1.0vc(1，800ml)的緩沖液H通過柱子，運行所需進行的次數。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子l.Ovc(1，800ml)的純水；和1.5vc(2，700ml)的20%乙醇。將含有純hGH的級分通過O.22jim孔的膜無菌過濾至無菌的、去熱原的塑料瓶中，測定總蛋白，并保存于-2ox:。實施例8從奶中純化hGH的可替換的方法替代之前所述的純化方法，為了純化奶中所含有的重組hGH，可以使用可替換的方案。實施例7中所述方法和該實施例中所呈現的可替換方法之間的主要差異在于前者的第二個步驟包括膨脹床陰離子交換色鐠，而后者相應的步驟需要免疫親和色鐠。兩種方法的澄清步驟也略有差別。因為兩個純化方案的其余部分是相同的，以下只描述可替換方法的頭兩個步驟。澄清為了獲得O.5%的溶液，將新鮮的奶與足量的吐溫80混合。加入吐溫80后，加入1M的Tris來獲得7.3±0.3的pH。此后，將產物均化30分鐘，然后為了分離脂肪層在14000g下離心。之后，用緩沖液S(50mMTris.HCl，500mMNaCl，0.5%吐溫80，pH7.3)將所得到的溶液稀釋20倍，然后將產物通過0.45um孔的膜過濾并方便地保存。免疫親和色鐠根據以下參數使用免疫親和相互作用基質(Affigel10EsterAgarose,BioRad制造，共價連接的抗-GH單克隆抗體，BioSidus制造)將前一步驟所獲得的物料進行色譜1.設備A.柱子1)直徑30cm2)床高15cm3)基質a)Affigel10EsterAgarose(BioRad)，共價連接的抗-GH單克隆抗體(BioSidus)b)體積10L2.溶液和緩沖液A.緩沖液A:20mMTris.HCl，500mMNaClB.緩沖液B:100mM檸檬酸，pH3.0C.緩沖液C:150mMNaH2P04，pH7.2D.緩沖液D:50mMTris.HCl，500mMNaClpH7.2E.緩沖液E:50mMTris.HCl，500mMNaCl，化鈉，0.lg/L慶大霉素3.待色語的物料A.澄清的奶B.樣品條件1)體積30-50L2)傳導率45±15mS/cm3)pH:7.3±0.3為了平衡和清潔柱子，如果在最近七天中沒有使用過，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于51cm/小時l.O柱體積("vc")(IOL)的緩沖液A;2.Ovc(20L)的緩沖液D;2.Ovc(20L)的緩沖液A;1.Ovc(10L)的緩沖液B;,2.Ovc(20L)的緩沖液C;和最后，1.Ovc(10L)的緩沖液A。，pH7.2,500mM胍.HCl，pH7.2，0.2%疊氮另一方面，如果在最近七天中已經用過柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子，流速低于51cm/小時l.Ovc(10L)的緩沖液C;和最后，2.Ovc(20L)的緩沖液A。一旦柱子得到平衡，裝載待色鐠的物料。所述裝載在5土3X:和低于51cm/小時的流速下進行。此后，在42±9cm/小時的流速和相同的溫度下進行洗脫。將下文中詳述的溶液和緩沖液以以下的次序通過柱子2.0vc(20L)的緩沖液A;和1.5vc(15L)的緩沖液B。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過柱子2.Ovc(20L)的緩沖液D;2.0vc(20L)的緩沖液A;和最后，2.0vc(20L)的緩沖液E。測定所選的含有hGH級分的總蛋白(通過Bradford方法)和目標蛋白(通過RIA)，并保存于4"C。實施例9純的重組hGH的質量控制對兩批純的重組hGH進行一系列的測定來證實該產物與天然hGH沒有差別。這樣的方法包括，但不限于，SDS/PAGE、蛋白質印跡、體外(細胞nb2)和體內(切除垂體的大鼠)的生物活性、肽圖譜、完整氨基酸序列的測定、等電聚焦(IEF),以及反相和大小排阻HPLC分析。對于重組的和天然的hGH，所有那些測定中所獲得的結果完全相同，其證明了純的重組hGH完全對應于天然hGH,因此適用于制造生物藥物產品。現在已經充分地描迷了本發明，本領域普通技術人員將理解可以在寬和相等范圍的條件、配制和其它參數下進行相同的發明而不會影響本發明或其任何實施方案的范圍。在此所引用的所有專利和出版物在此以其整體全部引入作為參考。序列表<110>SterrenbeldBiotechnologieNorthMelo,CarlosAlbertoBaranao,LinoCarbonetto，Cesar<120>在轉基因哺乳動物奶中生產外源蛋白的方法以及從其中純化蛋白的方法〈130>1909.010PC02〈腸4<170>Patentlnversion3.2<210>1<2U>31<212>DNA<213〉人工的<220><223>引物PB1<400〉1tctactcgaggatcatctatctgtcccaaag31<210>2<211〉27<212>腿<213〉人工的<220><223〉引物PB2<400>ctaggatccaatgatctgattttgtgg〈210〉<211〉<212><213>腿人工的<220〉<223〉引物PB4<400〉3ctaggatccatggctacaggtaagcgcc<210>4<211>20<212>薩<213>人工的<220><223>引物G町E<400〉4atgctgtgtctggacgtcct權利要求1.生產蛋白質的方法，包括a)制造在其奶中產生目標蛋白的非人轉基因哺乳動物；b)從所述非人轉基因哺乳動物獲得所述奶；和c)從所述奶中純化所述目標蛋白。2.根據權利要求1的方法，其中所述的非人轉基因哺乳動物是通過以下方法制得的，該方法包括a)獲得編碼目標蛋白的基因；b)將所述基因克隆至質粒中，借此將所述基因可操作地連接至指導所述基因在乳房細胞中表達的啟動子，形成表達質粒；c)用所述表達質粒轉染體細胞，使得所述質粒摻入到所述體細胞的基因組中，得到轉基因體細胞；d)將成熟卵母細胞去核，得到去核的卵母細胞；e)將一個所述的轉基因體細胞與所述去核的卵母細胞融合，得到單細胞胚胎；f)將所述胚胎植入受體哺乳動物的子宮中；和g)監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。3.權利要求2的方法，其中所述啟動子是P酪蛋白啟動子，而其中所述的目標蛋白是人生長激素。4.權利要求3的方法，其中表達質粒是pRPhGH。5.權利要求4的方法，其中所述表達質粒進一步包含新霉素抗性基因。6.權利要求5的方法，其中所述表達質粒是pRNeo。7.權利要求2的方法，其中所述哺乳動物是在其奶中產生重組人生長激素的牛，其基因組包含整合的質粒，其中所述的質粒包含人生長激素基因和指導所述基因在所述哺乳動物的乳房細胞中表達的P酪蛋白啟動子。8.權利要求7的方法，其中所述質粒是pRPhGH。9.權利要求8的方法，其中所述質粒進一步包含新霉素抗性基因。10.權利要求9的方法，其中所述質粒是pRNeo。11.權利要求2的方法，其中所述體細胞是成纖維細胞。12.權利要求2的方法，其中經從在其奶中產生所述目標蛋白的轉基因雌性中分離來獲得所述的轉基因體細胞。13.權利要求12的方法，其中所述轉基因體細胞是成纖維細胞。14.根據權利要求l的方法，其中所述非人轉基因哺乳動物通過以下方法制得，該方法包括a)使在其奶中產生所述目標蛋白的轉基因雌性非人哺乳動物超排卵；b)將所述哺乳動物與從雄性非人非轉基因哺乳動物獲得的精子人工授精來產生胚胎；c)收集所述胚胎；d)將所述胚胎植入受體哺乳動物的子宮中；和e)監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。15.根據權利要求l的方法，其中所述非人轉基因哺乳動物通過以下方法制得，該方法包括a)使在其奶中產生所述目標蛋白的轉基因雌性非人哺乳動物超排卵；b)將所述哺乳動物與從產生所述目標蛋白的轉基因雄性非人哺乳動物獲得的精子人工授精來產生胚胎；c)收集所述胚胎；d)將所述胚胎植入受體哺乳動物的子宮中；和e)監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。16.根據權利要求l的方法，其中所述非人轉基因哺乳動物通過以下方法制得，該方法包括a)使雌性非人非轉基因哺乳動物超排卵；b)將所述哺乳動物與從產生所述目標蛋白的轉基因雄性非人哺乳動物獲得的精子人工授精來產生胚胎；c)收集所迷胚胎；d)將所述胚胎植入受體哺乳動物的子宮中；和e)監控懷孕直至轉基因哺乳動物的出生。17.權利要求2、12、14、15或16任一項的方法，其中所述哺乳動物屬于牛物種、豬物種、綿羊物種、山羊物種或嚙齒動物物種。18.權利要求17的方法，其中所述哺乳動物屬于牛物種。19.權利要求2、12、14、15或16任一項的方法，其中所述目標蛋白是哺乳動物生長激素。20.權利要求19的方法素、牛生長激素、豬生長激素物生長激素。21.權利要求20的方法素。22.權利要求21的方法，奶的水平來產生人生長激素。23.權利要求22的方法，奶的水平來產生人生長激素。24.權利要求23的方法，奶的水平來產生人生長激素。25.權利要求24的方法，奶的水平來產生人生長激素。26.權利要求25的方法，奶的水平來產生人生長激素。27.權利要求26的方法，奶的水平來產生人生長激素。28.權利要求19的方法，其中所述哺乳動物所述哺乳動物生長激素的產生刺激了所述哺乳動物產生更多的包含所述哺乳動物生長激素的奶。29.權利要求2、12、14、15或16任一項的方法，其中在所述哺其中所述哺乳動物生長激素是人生長激綿羊生長激素、山羊生長激素或嚙齒動其中所述哺乳動物生長激素是人生長激其中所述哺乳動物以高于約1.0ghGH/L其中所述哺乳動物以高于約2.0ghGH/L其中所述哺乳動物以高于約3.0ghGH/L其中所述哺乳動物以高于約4.0ghGH/L其中所迷哺乳動物以高于約5.0ghGH/L其中所述哺乳動物以高于約6.0ghGH/L指導所述基因在乳房細胞中表達的啟動子)。全文摘要本發明涉及生產目標蛋白的方法，包括制造在其奶中產生所述蛋白的非人轉基因哺乳動物，從非人轉基因哺乳動物獲得所述奶，并從奶中純化所述目標蛋白。方便地克隆產生了轉基因牛動物，其能夠在乳腺中產生人生長激素。該方法包括在表達載體中方便地克隆編碼hGH基因和β酪蛋白啟動子的遺傳構建體。還包括胎牛體細胞，通常是成纖維細胞的轉染過程，并核移植進去核的牛卵母細胞，因此產生轉基因胚胎。該方法還包括產生轉基因胚胎的其它過程用于進一步擴大轉基因畜群，如亞克隆轉基因雌性牛，使轉基因奶牛超排卵并與來自非轉基因或轉基因雄性牛的精子授精，以及使非轉基因奶牛超排卵并與來自轉基因雄性牛的精子授精。然后，轉基因胚胎產生在其奶中大量產生人生長激素的轉基因牛，從奶中完全純化激素并分析以滿足制造純的生物藥物產品的所有要求。文檔編號C12N15/16GK101413003SQ200810170189公開日2009年4月22日申請日期2004年9月29日優先權日2003年9月30日發明者C·A·梅洛,C·卡爾博內托,L·巴拉瑙申請人:斯特林貝爾德生物技術北美公司