專利名稱：：一種用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒及其使用方法
技術領域：
：本發明屬于分子生物學的領域，具體涉及一種用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒及其使用方法。
背景技術：
：口腔黏膜病(oralmucosaldisease)是發生在口腔黏膜及軟組織上的類型各異、種類眾多的疾病的總稱[李秉琦，周曾同.口腔黏膜病學(第二版).北京人民衛生出版社.2005，1-15]。口腔教膜病具有同一病變的損害在病變的不同階段可以發生不同類型的損害的特點，具有同一疾病在口腔黏膜的不同部位具有不同的臨床表現的特點，具有多同翻膜病共存的特點，具有發病原因多不清楚的特點。同時，口腔白斑(oralleukoplakia,OLK)、口腔紅斑(oralerythroplakia，OEK)、口腔扁平莒蘚(orallichenplanus,OLP)、口腔粘膜下纖維化(oralsubmucousfibrosis,OSF)、上皮異常增生等口腔都膜病是口腔磷狀上皮細胞癌(Oralsquamouscellcarcinomas,OSCC)的癌前病變。OLK的發病率約為3-6%,中年以上的男性多見，癌變率為3-5%;OEK的發病率約為0.05%，41-50歲的男性多見，癌變率為52%;OLP的發病率約為0.51%,好發于中年人，女性多于男性，癌變率為0.4-12.3%。口腔黏膜病的診斷除了從臨床病損進行橫向比較進行診斷和鑒別診斷外，還常需要結合病理檢查進行診斷。但是，由于病損的重疊與更迭性，有時病損也難以確診，因此，需要在臨床上進行治療性診斷。總之，由于口腔黏膜病的種類的多樣性、臨床表現的復雜性、現有診斷方法的滯后性、部分疾病的癌變性等特點，急需建立可行、可靠的臨床診斷方法，特別是建立判定口腔黏膜病癌變趨勢大小判定的臨床診斷方法。
發明內容本發明提供了一種用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒及其使用方法。本發明采用如下的技術方案實現一種用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、01igo(dT)15、試劑I、試劑II、試劑III-a、試劑III-b、試劑III-c、試劑III-d和試劑III-e。其中試劑I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNaseFreedH20、dNTPMixture、RNaseIhibitor、AMVReverseTranscriptaseXL組成；試劑II由Tris-HCL+KCL、滅菌蒸餾水、TaKaRaEXTaqHS組成；試劑III-a為基因NF-1的PCR引物，試劑III-b為基因ACP-2的PCR引物，試劑III-c為基因CTNN-B1的PCR引物，試劑m-d為基因SOCS-3的PCR引物，試劑III-e為基因卩-actin的PCR引物。上述各試劑的配比如下表1~表4所述。表1:本發明試劑盒所包含的試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注本表所列試劑的量為10個樣本反應表2:試劑I的組份<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表4:試劑III的組份<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒的使用方法，其特征在于步驟如下1)、樣本的制備和貯存；2)、同時進行NF-1、ACP-2、CTNN-B1、SOCS-3和p-actin基因的RT-PCR操作;3).NF-1、ACP-2、CTNN-B1、SOCS-3和p-actin基因的瓊脂糖凝膠電泳；4)、使用KodakDigitalScienceID軟件對瓊脂糖凝膠電泳結果進行定量分析，將NF-1、ACP-2、CTNN-Bl和SOCS-3的相對表達量帶入方程"組織性質判定值非標準化判別公式Y=-16.811十0.477Xnw+0.540XACP-2-0.543XCTNN-B1-0.089乂50(:5-3"計算組織癌變程度判定值Y;5)、根據組織癌變程度判定值Y判定該口腔黏膜組織的癌變趨勢大小，Y小于0.1117判斷該組織為無癌變，Y介于O.1117和8.6513之間為輕度癌變組織，Y大于8.6513為癌變組織。所迷的GDF-15、NF-1、SOCS-3和P-actin基因的RT-PCR操作的退火溫度為55°C。本發明具有如下有益效果使用本試劑盒提供的試劑可同時進行NF-1、ACP-2、CTNN-Bl、SOCS-3和p-actin五個基因的RT-PCR反應并同時可進行多個口腔翁膜組織樣本的癌變程度的判定；判定時間短，準確性高。圖1:使用本發明方法獲得的12例組織RT-PCR電泳圖。其中泳道l、6、7、10、11、15、16、20均為DNA分子量標準，本實例中使用的是DL-2000;泳道2、3、4、5、14、19為口腔黏膜癌變組織，共6例不同病例的組織；泳道8、9、13、18為口腔翁膜輕度癌變組織，共4例不同病例的組織；泳道12、17為口腔翁膜無癌變組織，共2例不同病例的組織；bp為basepair的簡寫，即為tt對，下方的數字顯示為該電泳條帶的bp值。具體實施例方式一、試劑盒包含的試劑及i兌明本發明所述的試劑盒包含試劑12種，分別為TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、01igo(dT)15、試劑i、試劑n、試劑in-a、試劑in-b、試劑m-c、試劑ni-d和試劑ni-e。其中，trizol、氯仿、異丙醇、乙醇為組織總RNA提取試劑，01igo(dT;h5和試劑I為mRNA反轉錄為cDNA試劑，試劑II為TaKaRa公司PCR操作試劑，試劑III-a為基因NF-1的PCR引物，試劑III-b為基因ACP-2的PCR引物，試劑III-c為基因CTNN-B1的PCR引物，試劑III-d為基因SOCS-3的PCR引物，試劑III-e為基因p-actin的PCR引物。具體如表l'所示，其中試劑I、試劑II和試劑HI的具體組份見表2'-4'。表l':本發明試劑盒所包含的試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注本表所列試劑的量為IO個樣本反應表2':試劑I的組份<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3':試劑II的組份<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4':試劑III的組份<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>;主NF-1,英文全稱是Neurofibromin1(neurofibromatosis,vonRecklinghausendisease,Watsondisease),在Genebank中的基因編號是NM—000267;ACP-2，英文全稱是Acidphosphatase2，在Genebank中的基因編號是NM—001610;CTNNB-1，英文全稱是Cadherin-associatedproteinbeta1,在Genebank中的基因編號是NM_001904;SOCS-3,英文全稱是Suppressorofcytokinesignaling3,在Genebank中的基因編號是NM—003955;(3-actin，莢文全稱是Homosapiensactinbeta(ACTB),在Genebank中的基因編號是NM_001101.2。上述各基因引物可以通過本領域技術人員通過現有基因合成儀合成，其基本信息表述如下(1)一般信息(ii)發明名稱一種用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒及其使用方法(iii)序列數目10(2)SEQIDNO:l的信息(i)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:1:GTCATTGCCTTCCGTTCC18(3)SEQIDNO:2的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核芬酸(xi)序列描述SEQIDNO:2:CACCCAAAGACAACAAGAGC20(4)SEQIDNO:3的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核香酸(xi)序列描述SEQIDNO:3:CGCTCCAGACCTATGATGACTT(5)SEQIDNO:4的信息(i)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:4:CCTTGAGCCCATTCCACA(6)SEQIDNO:5的信息(i)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:5:CCAAGTGGGTGGTATAGAG(7)SEQIDNO:6的信息(i)序列特征(A)長度16bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苦酸(xi)序列描述SEQIDNO:6:GGGACAAAGGGCAAGA(8)SEQIDNO:7的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:6:CCCCAGAAGAGCCTATTACATC(9)SEQIDNO:8的信息(i)序列特征(A)長度23bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:6:AGGAACTCCCGAATGGGCCCCGGCA(10)SEQIDNO:9的信息(i)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苦酸(xi)序列描述SEQIDNO:7:AGCGCAAGTACTCCGTGTG(11)SEQIDNO:IO的信息(i)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:8:AAGCAATGCTATCACCTCC19二、操作步驟本步驟包括樣本的制備和貯存、RT-PCR反應、瓊脂糖凝膠電泳的實驗操作和口腔黏膜組織的判定。(一)樣本的制備和貯存對疑似組織的確切部位、大小、包膜狀況、與周圍關系、色澤、形狀、質地以及標本數目等登記后，經多典酒、酒精消毒局部后取組織，一般大小為L5-2xlx0.3cm。對于面積較大的組織可在周邊采用"三點法"分別取樣，并分別標記。取樣深度不超過0.3cm，質量約50mg。獲取的標本若在短時間檢驗可貯存于-20。C，若在三日后檢驗可貯存于-80。C或液氮中備用。(二)RT-PCR反應本方法適用于一個組織標本的處理，多個組織標本可同時平4亍操作。1、用1.5ml的EP管取一個組織標本，加入lml的TRIZOL試劑，手動勻漿，于15-30。C孵育3-5min。2、加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈振蕩管體15sec后，15-30。C孵育2-3min。4°C下12,000xg離心15min。3、將上層水相轉移到新EP管中，加入異丙醇0.5ml，混勻后15-30。C孵育10min,于4。C下12,000xg離心10min。4、移去上清液，加入75o/o乙醇lml，適度振蕩后，4。C下7,500xg離心5min。5、小心去除上層溶液后，EP管于通風廚中干燥5-10min。6、先加入無RNA酶的水20nl，用槍反復吹打幾次，然后55-60。C孵育10min。混勻后lyl/支(S500ngtotalRNA)分裝6支(分別編號為A、B、C、D和E卜E2、E3、E4)可直接進行以下操作，其余RNA溶液保存于-70。C備用。7、依次于PC化良應管A、B、C、D和E卜E2、E3、E4中各加入試劑I8.5jil后，再加入01igo(dT^0.5fxl，將其置于PCR儀內，設置程序如表5所示。表5:基因反轉錄反應條件<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>8、于第7步的PCR反應管A、B、C、D和E,、E2、E3、E4中分別再加入試劑I139^1,A中加入試劑III-aB中加入試劑III-b1^1,C中加入試劑III-clnl,D中加入試劑III-d1^1,E2、E3、E4中各加入試劑III-elul,分別輕輕混勻，按表6所示條件同時進行PCR反應。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳。表6:基因的PCR^應條件<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(三)瓊脂糖凝膠電泳1、試劑配制和準備常規配制2.0%的瓊脂糖凝膠電泳緩沖液等，具體如下(1)電泳緩沖液(TBE)的配制。先配制0.5mol/L(pH8.0)的EDTA溶液將37.2gEDTA-Na加入l60ml蒸餾水中，在攪拌器上劇烈攪拌；再用NaOH調節溶液pH值至8.0(約需4gNaOH);用蒸餾水定容至200ml;后送至高壓滅菌；室溫保存。(2)配制5xTBE溶液在0.6L蒸餾水中溶解54gTris堿，加入27.5ml冰乙酸和20ml0.5ml/LEDTA溶液，再加蒸餾水定容至1L,室溫保存。(3)2.0%瓊脂糖溶液的配制。取5xTBE溶液2ml，稀釋成20ml0.5xTBE,溶解0.4g瓊脂糖，電爐上煮至沸騰，溶化的瓊脂物冷卻至6(TC左右時加入10mg/mlGlodviewNa核酸染料2pl，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的電泳板中，在室溫下放置30min左右后進行電泳備用。(4)加樣緩沖液(LoadingBuffer)的配制常規配制6xLoadingBuffer。2、步驟(1)取55ml5xTBE,用dH2O稀釋成550ml，取20ml溶解0.4g瓊脂糖，沸后稍冷卻，加入GlodviewNa核酸染料2pl，另外530mlTBE倒入電泳槽中。(2)瓊脂糖溶液冷卻至溫熱時，倒入帶梳子的電泳板中，冷卻后拔出梳子，將凝肢放入電泳槽中。(3)DL2，000Marker2pl加入孔中。(4)PCR反應產物液A5(al+lnlLoadingBuffer,再加入PCR反應產物液E,5fil混合，同時加入一個上樣孔中。PCR反應產物液B、C和D分別與5nlE2、5|alE3、5plE4混合后，再分別與ljilLoadingBpffer混合，并A、B、C、D同時進行電泳操作。(5)接上電源，電壓100V,電流20mA進行電泳45min。(6)紫外燈檢測，并用柯達凝膠成像分析系統初步判定A、B、C和D的bp大小。A的堿基對數量為239bp和501bp;B的堿基對數量為217bp和501bp;C的堿基對數量為為247bp和501bp，D的堿基對數量為179bp和501bp。(7)用柯達凝膠成像分析系統進行基因的表達量分析。三、結果分析本結果分析包括瓊脂糖凝膠電泳圖的分析方法和口腔黏膜組織的判定方法。(一)瓊脂糖凝膠電泳圖的分析方法下面，以某基因的RT-PCR結果為例說明對瓊脂糖凝膠電泳圖的定量分析過程。1、打開KodakDigitalScience1D軟件。2、從菜單欄中"file"中的"open"打開待處理的文件。3、將目標文件打開后，軟件直接將待處理的圖片顯示在窗口的中間位置。4、點整個頁面最左側的方框選擇標志，將待處理的范圍選中，可適當裁減多余部分，通過"Edit"菜單中的"Crop"來完成。5、點圖片左側的"findlanes"可顯示圖片中的各列。若顯示的豎線不位于泳帶的中間位置可點擊圖片左側的箭頭圖標，將豎線移動至各條帶的中間位置。6、點擊圖中"findbands"按鈕，軟件將會顯示出目的基因條帶的位置和寬度。可使用"Del鍵"刪除不存在的泳帶顯示。7、在菜單欄中，找到"Show"中的下拉菜單，選擇"ImageDisplay"。點擊后出現對話框，點擊對話框右下角的"Auto"鍵，軟件將自動找到最適合的顯示對比度。8、找到菜單中的"show，，下拉菜單>點擊"Lands/Bands，，的次級下拉菜單中的"LaneAnalysisData"。而后，出現表格窗口。9、點擊最新出現的對話框中菜單欄的"Display"，勾選"mean"和"area"。然后點擊"確定"，即可出現每個泳帶的灰度值和面積值。10、目的基因相對表達量的計算。例如，NF-1的電泳圖中存在兩個電泳條帶，分別為250bp左右的NF-1條帶U28bp)和基本與500bp平行的p-actin條帶(501bp),經柯達凝膠成像分析系統分析后NF-l的mean-83.09、area=3%.00，而卩-actin的mean=100.06、area=650.00。利用"目的基因表達的灰度值=meanxarea"計算得NF-l的灰度值為32405.1，p-actin的灰度值為65039。再利用"目的基因的相對表達量=目的基因表達的灰度值xlOO/p-actin的灰度值，，計算得GDF-15的相對表達量為49.82。同樣，可計算獲得NF-l和S0CS-3的相對表達量。此值即可用于進行口腔黏膜組織的判定。(二)口腔黏膜組織的判定方法將NF-1、ACP-2、CTNNB-l和SOCS-3的相對表達量帶入"組織性質判定值非標準化判別公式丫=-16.811十0.477Xnjm+0.540XACP-2-0.543乂〔麗8-,-0.089乂50^-3"即可計算出組織性質判定值Y。例如，若NF-1、ACP-2、CTNNB-l和SOCS-3的相對表達量為分別49.54、53.11、82.55和76.94'則該組織的癌變趨勢判定值丫=-16.811+0.477x49.54+0.540x53.11-0.543x82.55-0.089x76.94=-16.811+23.631+28.679-35.497-6.848=-6.848。判定如果癌變趨勢判定值Y小于O.1117判斷該組織為無癌變，Y介于O.l117和8.6513之間為輕度癌變組織，Y大于8.6513為癌變組織。上例中，癌變趨勢判定值丫=-6.848<0.1117,所以可判定該組織為口腔黏膜正常組織，無癌變趨勢。方程"組織性質判定值非標準化判別公式Y=-16.811+0.477X,+0.540XACP.2-0.543Xctnnb-!-0.089乂50^-3"以及判別界值0.1117和8.6513通過338.11.5統計分析軟件的三項判別分析方法獲得。四、方法評價取12例口腔翻膜組織，經專家進行組織病理學鑒定，分別為口腔黏膜正常組織2例、口腔黏膜輕度癌變組織4例、口腔磷狀上皮細胞癌組織6例。采用本發明所示的方法進行操作后，再采用Cross-validated(a)法對本判別方法進行評價，總判別符合率為100%;口腔黏膜組織共2個組織，均判斷正確；口腔黏膜輕度癌變組織有4個組織，均判斷正確；口腔磷狀上皮細胞癌組織6例，均判斷正確；交互判別符合率為100.00%,靈敏度為100%,特異度為100%。結果如圖l、表7所示。表7:采用Cross-validated(a)法對本發明方法進行評價<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權利要求1.一種用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、試劑I、試劑II、試劑III-a、試劑III-b、試劑III-c、試劑III-d和試劑III-e，其中試劑I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNaseFreedH2O、dNTPMixture、RNaseIhibitor、AMVReverseTranscriptaseXL組成；試劑II由Tris-HCL+KCL、滅菌蒸餾水、TaKaRaEXTaqHS組成；試劑III-a為基因NF-1的PCR引物，試劑III-b為基因ACP-2的PCR引物，試劑III-c為基因CTNN-B1的PCR引物，試劑III-d為基因SOCS-3的PCR引物，試劑III-e為基因β-actin的PCR引物。2、根據權利要求1所述的一種用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒，其特征在于由表1所述配比的試劑組成。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>表3:試劑II的組份<table>complextableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>表4:試劑III的組份<table>complextableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>3、根據權利要求1或2所述的用于口腔翁膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒的使用方法，其特征在于步驟如下1)、樣本的制備和Bi存；2)、同時進行NF-l、ACP-2、CTNN-Bl、SOCS-3和(3-actin基因的RT-PCR操作；3)、NF-l、ACP-2、CTNN-Bl、SOCS-3和(5-actin基因的瓊脂糖凝膠電泳；4)、使用KodakDigitalScienceID軟件對瓊脂糖凝膠電泳結果進行定量分析，將NF-l、ACP-2、CTNN-B1和SOCS-3的相對表達量帶入方程"組織性質判定值非標準化判別公式Y=-16.811+0.477XNF.,+0.540XACP-2-0.543XCTNN.B1墨0.089Xsocs.3"計算組織癌變程度判定值Y;5)、根據組織癌變程度判定值Y判定該口腔黏膜組織的癌變趨勢大小，Y小于0,1117判斷該組織為無癌變，Y介于O.l117和8.6513之間為輕度癌變組織，Y大于8.6513為癌變組織。4、根據權利要求3所述的用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒的使用方法，其特征在于所述的GDF-15、"NF-1、SOCS-3和(3-actin基因的RT-PCR操作的退火溫度為55°C。全文摘要本發明屬于分子生物學的領域，具體是一種用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒及其使用方法，實現了口腔黏膜病癌變趨勢大小的臨床診斷檢測及判別。用于口腔黏膜組織癌變趨勢檢測的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、Oligo(dT)<sub>15</sub>、試劑I、試劑II、試劑III-a、試劑III-b、試劑III-c、試劑III-d和試劑III-e。其使用方法樣本的制備和貯存；各基因的RT-PCR操作和瓊脂糖凝膠電泳；對瓊脂糖凝膠電泳結果進行定量分析，判定口腔黏膜組織的癌變趨勢大小。本發明具有如下有益效果使用本試劑盒提供的試劑可同時進行NF-1、ACP-2、CTNN-B1、SOCS-3和β-actin五個基因的RT-PCR反應并同時可進行多個口腔黏膜組織樣本的癌變程度的判定；判定時間短，準確性高。文檔編號C12Q1/68GK101368212SQ20081016720公開日2009年2月18日申請日期2008年10月15日優先權日2008年10月15日發明者劉瑋瑋,勃牛,軍王,程牛亮,軍解,趙文軍,趙榮瑞,郭劍津,郭巍偉,陳顯久申請人:陳顯久