專利名稱：：一種用于口腔黏膜白斑組織的檢測試劑盒及其使用方法
技術領域：
：本發明屬于分子生物學的領域，具體涉及一種用于口腔黏膜白斑組織(OralLeukoplakia)的檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術：
：口腔l占膜白斑(Oralleukoplakia,OLK)是中老年人較常見的口腔黏膜病，好發于唇、頰、舌、腭等黏膜上，一般無自覺癥狀，初起時呈乳白色斑塊，表面光滑、平或稍高出正常黏膜。由于口腔白斑與WHO1972年公布的癌前病變概念相符[李秉琦主編，口腔粘膜病學(第二版)[M],北京人民衛生出版社，2000,88-92],因而被公認為口腔斑紋類疾病中最具典型性的癌前病變之一，其癌變率約為3-5%。1994年，流行病學家、臨床學家及病理學家在瑞典的烏普薩拉(Uppsala)對口腔白斑病的概念及相關問題再次進行了修訂，并于1996年正式公布。該決議將口腔白斑病定義為口腔白斑病是口腔黏膜上以白色為主的損害，不具有其他任何可定義的損害特征，一些口腔白斑病可轉化為癌。根據檢查環境和診斷手段的差異，可將口腔白斑病的診斷分為暫時性(provisional)和肯定(definitive)診斷兩個階段。如果一種白色的黏膜損害在臨床上不能診斷為任何其他的疾病，即可做出暫時性診斷的結論；假如暫時性診斷中的白色損害被懷疑與某種因素有關，而這種因素又有消除的可能，但消除后損害持續存在的病例，或通過組織病理學檢查的方法給予鑒定即為肯定性檢測。目前，對口腔黏膜白斑的檢測以組織病理學檢查為主，該方法具有對患者的組織黏膜破i不面;lP、大、i貪斷不)偉石角的擊夾,存、[KondohN,OhkuraS,AraiM,etal.Geneexpressionsignaturesthatcandiscriminateoralleukoplakiasubtypesandsquamouscellcarcinoma.OralOncol.2007May;43(5):455-62〗。
發明內容本發明為了解決現有口腔黏膜白斑的檢測方法具有對患者的組織黏膜破壞面積大、診斷不準確的缺點，提供了一種用于口腔勦膜白斑組織的檢測試劑盒及其使用方法。本發明采用如下技術方案實現一種用于口腔黏膜白斑組織的^r測試劑盒，其特征在于由以下試劑組成TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、01igo(dT)15、試劑I、試劑II、試劑III-a、試劑m-b、試劑in-c和試劑m-d。其中，試劑I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNaseFreedH20、dNTPMixture、RNaseIhibitor、AMVReverseTranscriptaseXL組成；試劑II由Tris-HCL+KCL、滅菌蒸餾水、TaKaRaEXTaqHS組成；試劑III-a為基因GDF-15的PCR引物，試劑III-b為基因NF-1的PCR引物，試劑III-c為基因SOCS-3的PCR引物，試劑III-d為基因(3-actin的PCR引物。上述各試劑的配比如下表1表4所述。表1:試劑盒的組成(注本表所列試劑的量為10個樣本反應)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>用于口腔黏膜白斑組織的檢測試劑盒的使用方法，其特征步驟如下1)、樣本的制備和貯存；2)、同時進行GDF-15、NF-1、S0CS-3和卩-actin基因的RT-PCR操作；3)、GDF-15、NF-1、SOCS-3和(3-actin基因的瓊脂糖凝膠電泳；4)、使用KodakDigitalScienceID軟件對瓊脂糖凝膠電泳結果進行定量分析，將GDF-15、NF-1和SOCS-3的相對表達量帶入方程"組織性質判定值P=-27.503+0.094XGDF.15-0.122XMM+0.368XSOCS-3"計算組織性質判定值P;5)、組織的判定值P與-1.186比較判定該組織是否為口腔黏膜白斑組織，大于-U86為非口腔l占膜白斑組織，小于-1.186為口腔黏膜白斑組織。所述的GDF-15、NF-1、SOCS-3和13-actin基因的RT-PCR操作的退火溫度為54°C。本發明具有如下有益效果使用本試劑盒提供的試劑和使用方法可在同一反應中進行GDF-15、NF-1、SOCS-3和P-actin四個基因的RT-PCR反應，并可同時進行多個組織樣本是否為口腔黏膜白斑組織的判定，判定時間短，準確性高，具有廣泛的臨床應用價值。圖1:使用本發明方法獲得的12例組織rt-pcr電泳圖。其中泳道l、6、7、10、11、15、16、20均為DNA分子量標準，本實例中使用的是DL-2000;泳道2、3、4、5、12、14、17、19為非口腔教膜白斑組織，共8例不同病例的組織；泳道8、9、13、18為口腔黏膜白斑組織，共4例不同病例的組織；bp為basepair的簡寫，即為堿基對，下方的數字顯示為該電泳條帶的bp值。具體實施例方式一、試劑盒包含的試劑及說明本發明所述的試劑包含11種，分別為TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、01igo(dT)15、試劑i、試劑ii、試劑in-a、試劑ni-b、試劑m-c和試劑in-d。其中，trizol、氯仿、異丙醇、乙醇為組織總RNA提取試劑，Oligo(dT)is和試劑I為mRNA反轉錄為cDNA試劑，試劑II為TaKaRa公司PCR操作試劑，試劑III-a為基國GDF-15的PCR引物，試劑III-b為基因NF-1的PCR引物，試劑m-c為基因SOCS-3的PCR引物，試劑III-d為基因p-actin的PCR引物。具體如表r所示，其中試劑i、試劑ni和試劑iv的具體組份見表2'~表4'。表r:本發明試劑盒所包含的試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注本表所列試劑的量為10個樣本反應表2':試劑I的組份<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3':試劑II的組份<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表4':試劑III的組份<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注GDF-15,英文全稱是Growthdifferentiationfactor15，在Genebank中的基因編號是NMJ)04864;NF-1,英文全稱是Neurofibromin1(neurofibromatosis,vonRecklinghausendisease,Watsondisease),在Genebank中的基因編號是NMJ)00267;SOCS-3,英文全稱是Suppressorofcytokinesignaling3,在Genebank中的基因編號是NMJX)3955;P-actin,英文全稱是Homos叩iensactinbeta(ACTB),在Genebank中的基因編號是雨一00U01.2。上述各基因引物可以通過本領域技術人員通過現有基因合成儀合成，其基本信息表述如下(1)一般信息(ii)發明名稱一種用于口腔黏膜白斑組織的檢測試劑盒及其使用方法(iii)序列數目8(2)SEQIDNO:l的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:1:CGCTCCAGACCTATGATGACTT22(3)SEQIDNO:2的信息(i)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:2:CCTTGAGCCCATTCCACA18(4)SEQIDNO:3的信息(i)序列特征(A)長度18bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:3:GTCATTGCCTTCCGTTCC18(5)SEQIDNO:4的信息(i)序列特征(A)長度20bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:4:CACCCAAAGACAACAAGAGC20(6)SEQIDNO:5的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:5:CCCCAGAAGAGCCTATTACATC22(7)SEQIDNO:6的信息(i)序列特征(A)長度22bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQIDNO:6:AGGAACTCCCGAATGGGCCCCGGCA22(8)SEQIDNO:7的信息(i)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核香酸(xi)序列描述SEQIDNO:7:AGCGCAAGTACTCCGTGTG19(9)SEQIDNO:8的信息(i)序列特征(A)長度19bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結構線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述:SEQIDNO:8:AAGCAATGCTATCACCTCC19二、操作步驟本步驟包括樣本的制備和貯存、RT-PCR反應、瓊脂糖凝膠電泳的實驗操作和口腔翻膜白斑組織的判定。(一)樣本的制備和貯存對疑似白斑組織的確切部位、大小、包膜狀況、與周圍關系、色澤、形狀、質地以及標本數目等登記后，經碘酒、酒精消毒局部后取組織，一般大小為1.5-2xlx0.3cm。對于面積較大的組織可在周邊采用"三點法"分別取樣，并分別標記。取樣深度不超過0.3cm,質量約50mg。獲取的標本若在短時間檢驗可貯存于-20。C，若在三日后檢驗可貯存于-80。C或液氮中備用。(二)RT-PCR反應本方法適用于一個組織標本的處理，多個組織標本可同時平行操作。1、用1.5ml的EP管取一個組織標本，加入lml的TRIZOL試劑，手動勻漿，于15-30。C孵育3陽5min。2、加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈振蕩管體15sec后，15-30。C孵育2-3min。4。C下12,000xg離心15min。3、將上層水相轉移到新EP管中，加入異丙醇0.5ml，混勻后15-30。C孵育10min,于4。C下12,000xg離心10min。4、移去上清液，加入75。/o乙B孚lml，適度振蕩后，4。C下7,500xg離心5min。5、小心去除上層溶液后，EP管于通風廚中干燥5-10min。6、先加入無RNA酶的水2(V1，用槍反復吹打幾次，然后55-60。C孵育10min。混勻后lpl/支(5500ngtotalRNA)分裝6支(分別編號為A、B、C和D,、D2、D3)可直接進行以下操作，其余RNA溶液保存于-70。C備用。7、依次于PCR反應管A、B、C和D,、D2、03中各加入試劑18.5nl后，再加入01igo(dT)u0.5nl,將其置于PCR儀內，設置程序如表5所示。表5:基因反轉錄反應條件<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>8、于第7步的PC殖應管A、B、C和D,、D2、D3中分別再加入試劑H39nl，A中加入試劑III-alW,B中加入試劑III-blpl，C中加入試劑III-c1^1，D,、D2、D3中各加入試劑III-d1^1，分別輕輕混勻，按表6所示條件同時進行PCR^應。反應結束后進行瓊脂糖凝膠電泳。表6:基因的PCR反應條件<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(三)瓊脂糖凝膠電泳1、試劑配制和準備常規配制2.0%的瓊脂糖凝膠電泳緩沖液等，具體如下(1)電泳緩沖液(TBE)的配制。先配制0.5mol/L(pH8.0)的EDTA溶液將37.2gEDTA-Na加入160ml蒸餾水中，在攪拌器上劇烈攪拌；再用NaOH調節溶液pH值至8.0(約需4gNaOH);用蒸餾水定容至200ml;后送至高壓滅菌；室溫保存。(2)配制5xTBE溶液在0.6L蒸餾水中溶解54gTris堿，加入27.5ml冰乙酸和20ml0.5ml/LEDTA溶液，再加蒸餾水定容至1L，室溫保存。(3)2.0%瓊脂糖溶液的配制。取5xTBE溶液2ml，稀釋成20ml0.5xTBE,溶解0.4g瓊脂糖，電爐上煮至沐騰，溶化的瓊脂物冷卻至60。C左右時加入10mg/mlGlodviewNa核酸染料2(xl，充分混勻，將溫熱的凝膠倒入已置好梳子的電泳板中，在室溫下放置30min左右后進行電泳備用。(4)加樣緩沖液(LoadingBuffer)的配制常規配制6xLoadingBuffer。2、步驟(1)取55ml5xTBE，用dH2O稀釋成550ml，取20ml溶解0.4g瓊脂糖，沸后稍冷卻，加入GlodviewNa核酸染料2)il,另外530mlTBE倒入電泳槽中。(2)瓊脂糖溶液冷卻至溫熱時，倒入帶梳子的電泳板中，冷卻后拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中。(3)DL2,000Marker2|^1加入孔中。(4)PCR反應產物液A5^1+lplLoadingBpffer，再加入PCR反應產物液D！5|^1混合，同時加入一個上樣孔中。PCR反應產物液B和C分別與5plD2、5|ulD3混合后，再分別與1^1LoadingBpffer混合，并A、B、C同時進行電泳操作。(5)接上電源，電壓100V，電流20mA進行電泳45min。(6)紫外燈檢測，并用柯達凝膠成像分析系統初步判定A、B和C的bp大小。A的堿基對數量為128bp和501bp;B的堿基對數量為239bp和501bp;C的堿基對數量為179bp和501bp。(7)用柯達凝膠成像分析系統進行基因的表達量分析。三、結果分析本結果分析包括瓊脂糖凝膠電泳圖的分析方法和口腔黏膜白斑組織的判定方法。(一)瓊脂糖凝膠電泳圖的分析方法下面，以某基因的RT-PCR結果為例說明對瓊脂糖凝膠電泳圖的定量分析過程。1、打開KodakDigitalScience1D軟件。2、從菜單欄中"file"中的"open"打開待處理的文件。3、將目標文件打開后，軟件直接將待處理的圖片顯示在窗口的中間位置。4、點整個頁面最左側的方框選擇標志，將待處理的范圍選中，可適當裁減多余部分，通過"Edit"菜單中的"Crop"來完成。5、點圖片左側的"findlanes"可顯示圖片中的各列。若顯示的豎線不位于泳帶的中間位置可點擊圖片左側的箭頭圖標，將豎線移動至各條帶的中間位置。6、點擊圖中"findbands"按鈕，軟件將會顯示出目的基因條帶的位置和寬度。可使用"DeK定"刪除不存在的泳帶顯示。7、在菜單欄中，找到"Show"中的下拉菜單，選擇"ImageDisplay"。點擊后出現對話框，點擊對話框右下角的"Auto"鍵，軟件將自動找到最適合的顯示對比度。8、找到菜單中的"show"下拉菜單，點擊"Lands/Bands"的次級下拉菜單中的"LaneAnalysisData"。而后，出現表格窗口。9、點擊最新出現的對話框中菜單欄的"Display",勾選"mean"和"area"。然后點擊"確定"，即可出現每個泳帶的灰度值和面積值。10、目的基因相對表達量的計算。例如，GDF-15的電泳圖中存在兩個電泳條帶，分別為小于200bp大于100bp的GDF-15條帶(128bp)和基本與500bp平行的p-actin條帶(501bp),經柯達凝膠成像分析系統分析后GDF-15的mean=98.81、area=364.00,而卩-actin的mean=101.47、area=390.00。利用"目的基因表達的灰度值=meanxarea"計算得GDF-15得灰度值為39573.30,(3-actin的灰度值為35966.84。再利用"目的基因的相對表達量=(3-actin的灰度值x目的基因表達的灰度值/100"計算得GDF-15的相對表達量為90.89。同樣，可計算獲得NF-1和S0CS-3的相對表達量。此值即可用于進行口腔黏膜白斑組織的判定。(二)口腔私膜白斑組織的判定方法將GDF-15、NF-I和S0CS-3的相對表達量帶入"組織性質判定值P=-27.503+0.094Xgdf-i5-0.122Xmm+0.368Xsocs-3"即可計算出組織性質判定值P。例如，若GDF-15、NF-l和SOCS-3的相對表達量為分別90.89、49.54和76.94,則該組織的性質判定值P=-27.503+0.094x90.89-0.122x49.54+0.368x76.94=-27.503+8.54366-6.04388+28.31392=3.3107。判定如果判定值P小于-1.186為口腔黏膜白斑，如果判定值P大于-1.186為暫不能判定為口腔黏膜白斑。上例中判定值P=3.3107>-1.186,所以暫不能判定該組織為口腔黏膜白斑。方程"組織性質判定值P--27.503+0.094XODJM5-0.122xnw+0.368Xsocs—3"以及判別界值-1.186通過SPSS.11.5統計分析軟件的二項判別分析方法獲得四、方法評價取12例口腔黏膜組織，經專家進行組織病理學鑒定，分別為口腔教膜正常組織4例、口腔黏膜白斑組織4例、口腔磷狀上皮細胞癌組織4例。采用本發明所示的方法進行操作后，再采用Cross-validated(a)法對本判別方法進行評價，總判別符合率為100%;口腔恭膜白斑組織共4個組織，均判斷正確，非口腔黏膜白斑組織有8個組織，均判斷正確，交互判別符合率為(12-0)/12=100.00%,靈敏度為8/(8十0)=100%,特異度為4/(0+4))=100%。結果如圖1、表7所示。表7:采用Cross-validated(a)法對本發明方法進行評價判定結果方法判別口腔黏膜白斑組織非口腔黏膜白斑組織口腔翁膜白斑組織合計數量非口腔黏膜白斑組織808組織病理學(例)口腔黏膜白斑組織044判定比例非口腔黏膜白斑組織跳00.0100.0(%)口腔黏膜白斑組織0.0100.0100.0Cross-validated(a)法對本發明方法判定數量(例)比例(%)非口腔黏膜白斑組織口腔黏膜白斑組織非口腔黏膜白斑組織口腔黏膜白斑組織80100.00.0040.0湖.o84100.0跳o權利要求1.一種用于口腔黏膜白斑組織的檢測試劑盒，其特征在于由以下試劑組成TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、Oligo(dT)15、試劑I、試劑II、試劑III-a、試劑III-b、試劑III-c和試劑III-d，其中，試劑I由MgCl2、Tris-HCL+KCL、RNaseFreedH2O、dNTPMixture、RNaseIhibitor、AMVReverseTranscriptaseXL組成；試劑II由Tris-HCL+KCL、滅菌蒸餾水、TaKaRaEXTaqHS組成；試劑III-a為基因GDF-15的PCR引物，試劑III-b為基因NF-1的PCR引物，試劑III-c為基因SOCS-3的PCR引物，試劑III-d為基因β-actin的PCR引物。2、根據權利要求1所述的一種用于口腔翁膜白斑組織的檢測試劑盒，其特征在于由表1所述配比的試劑組成，表l:試劑盒的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>注本表所列試劑的量為IO個樣本反應表2:試劑I的組份<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>表4:試劑III的組份<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>3、根據權利要求1或2所述的用于口腔黏膜白斑組織的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于步驟如下1)、樣本的制備和貯存；2)、同時進行GDF-15、NF-1、SOCS-3和卩-actin基因的RT-PCR操作；3)、GDF-15、NF-1、SOCS-3和卩-actin基因的瓊脂糖凝膠電泳；4)、使用KodakDigitalScienceID軟件對瓊脂糖凝膠電泳結果進行定量分析，將GDF-15、NF-1和SOCS-3的相對表達量帶入方程"組織性質判定值P=-27.503+0.094XGDF.15-0.122XNM+0.368XSOCS.3"計算組織性質判定值P;5)、組織的判定值P與-1.186比較判定該組織是否為口腔黏膜白斑組織，大于-1.186為非口腔黏膜白斑組織，小于-1.186為口腔勒膜白斑組織。4、根據權利要求3所述的用于口腔黏膜白斑組織的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于所述的GDF-15、NF-1、SOCS-3和(5-actin基因的RT-PCR操作的退火溫度為54°C。全文摘要本發明屬于分子生物學的領域，具體涉及一種用于口腔黏膜白斑組織的檢測試劑盒及其使用方法，解決了現有口腔黏膜白斑的檢測方法具有對患者的組織黏膜破壞面積大、診斷不準確的缺點。用于口腔黏膜白斑組織的檢測試劑盒，其特征在于由以下試劑組成TRIZOL、氯仿、異丙醇、乙醇、Oligo(dT)<sub>15</sub>、試劑I、試劑II、試劑III-a、試劑III-b、試劑III-c和試劑III-d。其使用方法樣本的制備和貯存；各基因的RT-PCR操作和瓊脂糖凝膠電泳；對瓊脂糖凝膠電泳結果進行定量分析，判定組織是否為口腔黏膜白斑組織。本發明具有如下有益效果可在同一反應中進行四個基因的RT-PCR反應，并可同時進行多個組織樣本是否為口腔黏膜白斑組織的判定，判定時間短，準確性高，具有廣泛的臨床應用價值。文檔編號C12Q1/68GK101368210SQ20081016720公開日2009年2月18日申請日期2008年10月15日優先權日2008年10月15日發明者劉瑋瑋,炯燕,勃牛,王翔宇,程牛亮,軍解,趙榮瑞,郭劍津,郭巍偉,陳顯久申請人:陳顯久