一種植物單性結實調控基因及其應用的制作方法

專利名稱：一種植物單性結實調控基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用分子生物學方法從植物中分離得到植物單性結實調控基因及其應用，特 別涉及茄子調控單性結實的生長素響應因子基因及其應用。
背景技術：
開花植物的果實發育和種子的產生依賴于柱頭的授粉和子房的雙受精過程。不利的環境 條件會阻礙很多植物的果實產生和發育，過高或過低的溫度和濕度都會對果實生長過程的每 一個環節造成不利影響，如花粉的形成、傳播和萌發、受精和種子成熟過程等等，從而影響 作物的產量和質量。另外果實中種子的生長發育，會使果實加快衰老，產量和商品性降低， 影響銷售。單性結實是指植物不經過授粉和受精就能正常結果和果實生長的現象，能在低溫 或高溫等不利于授粉和受精的逆境條件下產生無籽的果實。同時，單性結實的果實因不經受 精而無籽，品質明顯提高，商品性得到改善，保鮮貯藏期延長，更受消費者的歡迎。因此， 世界各國都十分重視作物單性結實的研究。
許多激素如GA，生長素和細胞分裂素，都參與到果實和種子發育的信號傳導過程，它們 的含量和活性增加會促進結果和果實生長，促進包括細胞分裂、細胞增大和產生種子等過程 的果實成熟。擬南芥等作物在施加外源生長素的情況下，能誘導產生單性結實。Rotino等采 用基因工程手段成功，在子房和卵子中表達生長素合成基因，使茄子子房中的生長素含量大 大增加，導致茄子子房未經受精而直接膨大發育成果實，獲得了單性結實品種，并在番茄 (5^朋aceae)、葡萄(Kz'tecese)等蔬菜水果上得到廣泛利用。
Ulmasoy等(Ulmasov T. ， Hagen G and Guilfoyle TJT. Dimerization and DNA binding of auxin response factors. Plant J", 1999(19): 309 - 319; Ulmasov T. ， Hagen G and Guilfoyle T J. Activation and repression of transcription by auxin response factors. Proc Natl Acad Sci USA ， 1999 (96): 5844 - 5849.)研究表明生長素響應因子(Auxin Response Factors)，簡稱ARFs，能和生長素早期誘導基因如Aux/IAA、 SAUR和GH3等家族 的啟動子響應元件(AuxREs) TGTCTC特異結合，是生長素調控植物生長發育的關鍵基因。擬 南芥突變體fwf (sr/《-》(fruit without fertilization)能在去雄下未經授粉和受精單性 結實產生無籽果實，基因克隆表明是由于Z^^基因翻譯起始位點ATG突變為ATA引起的。擬 南芥^ /^基因編碼閱讀框T-DNA插入突變體7和ar/S^在去雄情況下均能單性結實， 而編碼閱讀框上游942bp處的T-DNA插入突變體ar/^-5則未能在去雄下單性結實。這些結果說明擬南芥ARF8基因的編碼區域突變功能缺失而導致單性結實。Goetz等將突變基因ar/《4 轉基因到番茄中表達發現同樣能在去雄下未經授粉和受精而單性結實，形成無籽果實。并從 番茄中克隆獲得了 S1ARF8基因，結果域分析發現擁有與ARF8基因同樣的保守功能域，因此 推斷它與擬南芥ARF8基因同樣的方式控制果實發育。這些結果都表明了 ARF8基因能直接調 控植物單性結實，并且保守功能域行使主要功能。這為生長素調控植物單性結實的分子機制 提供了直接的證據。但到目前為止仍未見到關于茄子單性結實的分子調控的報導。茄子 (5b^/7咖/ffWo/^e朋L )在世界各地普遍栽培，是我國城鄉居民喜食的主要蔬菜種類之一， 因此獲得茄子的調控單性結實基因，利用轉基因植物培育無籽或少籽莉子品種具有重大的經 濟利益。

發明內容
本發明的目的是提供一種調控植物調控單性結實的生長素響應因子基因，特別是茄子生 長素響應因子基因及其應用，以使具有生長素響應因子基因的轉基因植物能單性結實。
本發明提供的利用分子生物學手段從茄子中分離得到的生長素響應因子基因，命名為 5k^ /W。所述5)a^/^的核苷酸序列是序列表中的SEQ IDN0:8，長度為3750bp。所述茄子生 長素響應因子表達的氨基酸序列是序列表中的SEQ工D N0:9。
本發明還提供了一種獲得上述生長素響應因子的方法。是以茄子根莖葉的總RNA反轉錄 獲得的cDNA為模板，以引物P1 (SEQ ID N0:1)和引物P2 (SEQ ID NO:2)進行PCR擴增克 隆茄子中的ARFs基因片段(SEQ IDN0:3)，所得ARF基因片段長度為477bp。根據克隆獲得 的茄子ARF基因片段分別設計5'-RACE引物(SEQIDN0:4)和3'-RACE引物(SEQIDN0:5)。 根據Clontech公司的RACE試劑盒SMART RACE cDNA Amplification Kit (PT3269-1 )， 分別做5'-RACE和3'-RACE試驗，進行全長cDNA的克隆。得到長度為3750bp的cDNA全長序 列5ia^ /^(SEQ ID N0:8)。BLASTN分析結果表明，該序列與擬南芥調控單性結實基因^ /^cDNA 序列的一致性為53. 7%，氨基酸序列的同源性為54. 7%。
本發明提供了一種利用5k^/^構建植物表達載體及其轉化茄子的方法。


圖l茄子總RNA提取的糖凝膠電泳分析
圖2 5fe^ /^ RT-PCR擴增產物凝膠電泳分析
圖3 5'-RACE和3'-RACE擴增片段瓊凝膠電泳分析圖4 5k47 /^全長cDNA的序列擴增產物凝膠電泳分析
圖5 SmARF8氨基酸序列的結構域分析
圖6 SmARF8及其蛋白的氨基酸序列系統進化樹
具體實施例方式
下面結合本發明的具體實施例，作進一步詳述。 實施例l:茄子中的ARFs基因的克隆與分離 1. 1試驗材料及試劑
材料杭州紅茄植株由浙江省農業科學院蔬菜所提供。植株種于室溫，于旺盛生長期分 別取根、莖、葉、花蕾、花朵、果實，液態冷凍后保存于-72'C超低溫冰箱。試劑總RNA的 提取試劑盒(RNeasy Plant Mini Kit)購自QIAGEN公司。麗LV逆轉錄酶購自Promega公司， Taq DNA聚合酶和pMD-19T載體購自寶生物公司(大連)有限公司(TaKaRa) 。 SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (PT3269-1)購自Clontech公司，引物均由上海生工生物工程技術服務有 限公司合成。凝膠回收試劑盒購自杭州Vgene公司。序列測定均由北京華大生物技術有限公 司完成。
1. 2試驗方法
1. 2. 1總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成
取茄子不同組織用液氮碾磨后，參照RNeasy Plant Mini Kit試劑盒說明書的步驟提取 總RNA，將它們等量混合，以S叩erScript TM II反轉錄酶合成cDNA第一鏈。
采用1%凝膠電泳檢測RNA的完整性。從圖1可以清晰地看到28S和18S rRNA的2條主 帶，28S/18S的亮度比大于2，最前面的5S rRNA隱約可見。這表明總RNA純度較高，符合 試驗要求。
1.2.2獲得茄子中生長素響應因子基因
1) 由于ARFs家族基因的同源域保守性，根據已知序列的保守域設計簡并引物PI (SEQ ID N0:1)和P2 (SEQ ID N0:2)。
PI: 5'GGAAG(A)TTT(C)AGGCAT(C)ATC(T)TTTC G 3'
P2: 5' CA(T)GTC(T/A)GATTCA (G)TCCCAA(T/C)CCAACC 3'
2) 以步驟1.2. 1中獲得的茄子cDNA第一鏈為模板，P1/P2引物進行RT-PCR擴增。
試劑材料反應體積為50 u 1， 5 u 1T叫緩沖液(10X )， ； 1 u 1 dNTPs(2. 5,1 L_1)，;2 iil的Pl (10uM)，； 2 ul的P2 (10uM)，； 0.2ul; lul Tag酶(5 U. u L-l)。
反應條件為94。C預變性2min， 94。C變性30s， 58。C退火30s， 72。C延伸lmin， 35個循 環，然后72。C延伸10 min。
結果檢測PCR產物經1.0%凝膠電泳檢查，表明擴增得到一條約500bp的條帶，如圖2 所示。用PCR產物純化試劑盒將特異性擴增片段回收，與pMD-19T載體連接，轉化大腸桿菌 0 .cW力DH5a。對候選克隆進行PCR鑒定，篩選出陽性重組子，送北京華大基因公司進行測 序。測序后的準確長度為477bp，編碼130個氨基酸。其核苷酸序列為SEQ ID N0:3。
將核酸序列比對(BLASTN)表明，它與擬南芥^ /^基因的相關區段有54%的一致性，將序 列在NCBI網站上進行blast序列分析，與擬南芥v^ /^序列同源性最高。 3)利用RACE試劑盒擴增基因
根據克隆獲得的5"/a^/^基因片段序列(SEQ ID NO:3)，分別設計ARF 5'-RACE引物P3 (SEQ工D N0:4)和3'-RACE引物P4 (SEQ ID N0:5)
P3: 5'CAAACAGCATCCGGAACCTCATACC 3'
P4: 5' CCTCAAACTGTCATGCCTTCTTCGGTC 3'
以茄子不同組織的混合cDNA為RACE模板，根據Clontech公司的RACE試劑盒SMART RACE cDNA Amplification Kit (PT3269-1 )，分別做5'—-RACE和3'-RACE試驗，進行全長 cDNA的克隆，得到如圖3所示的5'-RACE和3' -RACE擴增片段。
反應體系5p1cDNA模板，5ulTaq Buffer (IOX)， 1 y 1特異引物(10 mraol L-1)， 5ix 1 10XUniversal Primer A mix (IOX)， ly ldNTPs (IO畫I L-1) ， lp 1 50X Advantage 2 Polymerase Mix,力口 dd H20至50ul。
PCR反應程序5次循環94。C30s， 72°C 3min， 5次循環94°C 30s， 70°C 30s， 72°C 3min， 25次循環94°C 30s， 68°C 30s， 72°C 3min。經擴增，5'-RACE PCR反應出現一條明 亮的特異性條帶，如圖3所示，回收并進行克隆。經測序得到1686 bp的擴增片段，其中470 bp與簡并引物克隆得到的片段的5'-末端序列重疊。于791 bp處發現起始密碼子atg，其前 端序列為5'-端非翻譯區，這表明5k^/^基因的5'-端序列己經獲得。3'-RACEPCR反應出現一 條明亮的特異性條帶，如圖3所示。克隆測序得到2261 bp的特異條帶，其中313 bp與5ia^/^ 片段的3'-末端序列重疊，在3'-RACE片段中還含有23個T堿基的寡核苷酸序列，說明已經 獲得了完整的cDNA3'-末端序列。將5'-端序列(SEQ IDNO:IO)、基因片段(SEQ ID N0:3)與 3'-端序列(SEQ ID NO: 11)進行拼接，整合后得到含有poly A尾部結構的、完整的cDNA拼 接序列，長度為3750 bp (SEQ ID N0:8)。
6DNAStar分析表明，在完整的cDNA序列3464 bp處發現終止密碼子taa; 3676-3699 bp 處發現poly A轉錄終止信號，其余序列為3'-端非翻譯區。分析表明完整的ORF序列長度為 2676bp (SEQ ID NO:12)。
4)全長cDNA的序列擴增
根據拼接完整的cDNA序列設計全長引物，擴增區域不包括cDNA的非翻譯區。
正向引物FP: 5' GGGGTTTTATACTTTTTGGGGTTGC 3' (SEQ ID NO:6)，
反向引物RP: 5' AGACTTGGCCCTTCCTCGTCTTTAG 3' (SEQ ID N0:7)
反應程序為94r預變性2min， 94。C變性30s， 58。C退火30s， 72。C延伸3min，進行35 個循環，然后72。C延伸10min。
全長cDNA的擴增提取茄子的總RNA，用引物FP、 RP按常規方法進行RT-PCR反應。 結果有明亮的特異性條帶出現如圖4所示，約為3000bp，將之回收并克隆。經測序得到2911 bp的特異片段，測序結果與拼接而成的序列一樣。0RF Finder分析整個序列編碼1個完 整的0RF (SEQ ID NO: 12)。表明茄子生長素響應因子基因的全長序列已經克隆獲得。 條帶用PCR產物純化試劑盒將特異性擴增片段回收，與pMD-19T載體連接，轉化大腸桿菌 (fU'oh')DH5a。對候選克隆進行PCR鑒定，篩選出陽性重組子，送北京華大基因公司進行測 序，獲得茄子生長素響應因子基因5VwARFS (SEQ ID NO: 8)，其全長為3750bp。
實施例2全長cDNA序列及結構域分析
新克隆的茄子5ia4《/^序列全長3750 bp，開放閱讀框2676bp，編碼891個氨基酸，其氨 基酸序列與擬南芥的ARF8 —致性為54. 7%，與水稻的0sARF8 —致性為68. 2%;氨基酸序列與 番莉的S1ARF8 —致性達到54. 4%。
SmARF8蛋白氨基酸序列分析表明，與擬南芥ARF8基因一樣，具有這個家族基因序列的 典型特征。我們將水稻0sARF8、擬南芥ARF8、黃瓜CsARF3、番茄S1ARF8及茄子SmARF8基 因氨基酸序列用clustW 1.83程序進行同源保守域分析，再用Gendoc分析。ARFs家族基因 在N-末端含有一個300 aa左右的保守域，它在ARF1基因中驗證具有DNA結合域的功能 (Ul腿sov T， Hagen G， Guilfoyle TJ. 1997a . ARF1， a transcription factor that binds to auxin response elements. Science. 1997 Jun 20:276(5320) :1865-1868 )，被稱為DNA-結合域(DBD)，能跟生長素響應基因AuxRES的啟動子序列中的保守回文重復序列TGTCNC特 異結合。氨基酸序列保守性分析結果如圖5表明，新克隆的茄子SmARF8基因在N-端序列與 其他物種的這段保守域同源性非常高，含有一個完整的N-端DNA-結合域。擬南芥的ARFs家 族基因除了 ARF3和ARF17夕卜，都擁有一個C-末端保守域(CTD)，它含有與Aux/IAA蛋R白中的區域III和IV相似的保守域，具有蛋白互作功能，能使ARF和Aux/IM蛋白形成同源 或異源二聚體(Ulmasov T, Murfett J， Hagen G， Guilfoyle TJ (1997b) Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9: 1963-1971 ; Ulmasov T， Hagen G, Guilfoyie TJ. 1999a . Dimerization and DNA binding of auxin response factors. Plant J19:309-319b., Tom J. Guilfoyle, and Gretchen Hagen. Auxin Response Factors. J Plant Growth Regul， 2001， 20:281-291.)。而ARFs家族基因含有同樣的兩個保守域III和IV，表明他們也是生 長素的響應基因。茄子SmARF8基因同樣擁有非常保守的CTD，同源性分析結果顯示與其他物 種的CTD域幾乎一致。SmARF8基因在DNA結合域和C-末端之間的區域是不保守的，但是富含 脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基。在這個區域并具有轉錄因子的特征區域核定位序列PQRNKRPR。 表明它具有ARFs家族基因的典型特征。SmARF8擁有與ARF8 —致的保守功能域，表明該基因 具有調控單性結實的功能。
實施例3不同物種ARF家族基因的系統進化樹分析
為了比較克隆得到的茄子SmARF8基因與其他物種ARFs家族基因的親緣關系，分別下 載擬南芥、水稻、黃瓜和番茄中已經公布的ARFs家族基因序列。以各基因的全長氨基酸序 列進行聯配，并用phylip軟件構建成系統進化樹。結果如圖6所示，可見SmARF8基因與 ARF8、 OsARF8、 S1ARF8、 CsARF3、 CsARF4、 OsARF6a、 OsARF6b聚集在一個分支上，其 他基因與他們都沒有聚集在一起。表明他們的親緣關系非常近。其中與調控擬南芥單性結實 的基因ARF8親緣關系非常密切，表明該基因具有調控單性結實的功能。
實施例4利用5)a^/^構建植物表達載體
以茄子cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增，所用引物為P-U (SEQIDNO:13) ， P-L (SEQIDNO:14):
P-U: 5' CAGTTTCAACATCAACAGCGAACC 3' P-L: 5'ACAAATGGAGTAACCCGAGAAG 3'
其反應條件為P-U和P-L引物分別為2(11 (10nmol'L-l) ， 5 pi Taq Buffer (10X ) ， 1 pldNTPs (2.5mmol丄-l) ， Taq酶2 U，加ddH20至50 pl。反應程序為94。C預變性2min, 94。C變性30 s， 58。C退火30 s， 72 。C延伸30 s，進行35個循環，然后72 。C延伸10 min。 將特異性擴增片段回收，分別以正向、反向錨定連接到pBSSK "11載體的內含子結構2端，構建含目的序列反向重復結構的RNA干涉中間載體。對候選克隆進行PCR鑒定，篩選出陽 性重組子。將含有內含子結構和正反基因片斷的載體片斷克隆到含超強啟動子的35S-1300表 達載體，然后電擊法將載體轉化到根癌農桿菌。
實施例5利用構建植物表達載體轉化茄子的方法(農桿菌介導法)
將轉化有1300-5V ^i FS干涉表達載體的農桿菌單菌落，在YEP液體培養基中培養過夜， 直到菌液OD6(X)值為0.1。菌液離心后，沉淀用MS基本培養基重新懸浮。杭州紅茄葉片或者 子葉外植體在MS培養基上預培養2天，在農桿菌懸浮液中浸潤5分鐘，在無菌濾紙上瀝干， 然后重置回預培養的瓶子中繼續培養48小時后，轉移到含有卡那霉素和氯霉素的MS選擇培 養基上生長，獲得愈傷組織。將愈傷組織轉移到不含NAA的MS培養基上培養，經莖分化和 伸長后，然后在V3培養基上進行生根培養，獲得茄子5V^4i FS基因被干涉表達的能單性結 實的轉基因植株。序歹!j表
<110〉浙江省農業科學院
〈120> —種植物單性結實調控基因及其應用 〈130> 參見說明書內 <160〉 14
〈170> Patentln version 3.3
〈210〉 1 <211> 21 <212〉 DNA 〈213〉 引物l 〈400〉 1
ggaarttyag gcayatyttt c 21
〈210〉 2 〈211〉 23 <212> 腿 <213> 引物2 〈400〉 2
cwg thgattc rtcccahcca acc 23
〈210〉 3
<211> 477
〈212〉 DNA
〈213〉茄子基因片段
〈400〉 3
atctggaagt tcaggcacat ctttcgcgga caaccaaaga ggcatctatt gacaacagga 60tggagtgtgt ttgtgagtgc aaaaagactt gttgcaggtg atgcggtcat ctttatctgg 120
aatgaaaaca atcaattgct tttggggatt cgacgtgcca atcgtcctca aactgtcatg 180
ccttcttcgg tcttgtcaag tgatagcatg cacattggtc tcctagctgc agcagctcat 240
gcagccgcaa ctaatagccg ctttacaata ttttacaatc caagggctag cccgtcagag 300
tttgtcatac ctcttgccaa gtatgttaaa gcagtgtatc acactcgaat ttctgttggt 360
atgaggttcc ggatgctgtt tgaaacagaa gaatcgagtg tccgaaggta catgggcaca 420
attactggca tcagtgactt agatccggtt cgctgccgac tcacactgcc gtccgga 477
<210> 4
<211> 25
〈212〉 DNA
〈213〉 5'-RACE引物
〈400〉 4
caaacagcat ccggaacctc atacc 25
<210> 5
〈211> 27
〈212〉 DNA
〈213〉 3'-RACE引物
〈400> 5
cctcaaactg tcatgccttc ttcggtc 27
〈210〉 6 〈211〉 25 〈212〉 DNA<213>正向引物 〈400〉 6
ggggttttat actttttggg gttgc 25
〈210〉 7 〈211〉 25 〈212〉 DNA 〈213〉反向引物 〈400〉 7
agacttggcc cttcctcgtc tttag 25
<210> 8 <2丄1〉 3750 <212〉 DNA
〈213〉茄子生長素相應因子基因全長序列 <400> 8
tgtcatgcct gcaggtcgac tctagactcg agggtccaga tctccagtct tctaatacga 60 ctcactatag ggcaagcagt gtatcaacgc agagtacgcg gggaagtctt attttcatgt 120 caataatgga tttttatatg attactactc tttttgtttt taataattca gaattggaaa 180 tggaaaggag tgagaaggaa cagttcccta acttagcagc attttacaat ctccagttcc 240 ttaaattcat ggggttcttt cttctgtagc tttcaatatg tgaaaagaaa atcaatcact 300 cagagaaaag aaaagaaaaa cgaaaaaagt acagctgaag agatctactt aatagcctac 360 ttgagctctt actcagtcac tatgcagtag agatcttgaa gtggccaaaa aagttgtttc 420 ttcaatactc ttactgttgc tctttagggt tttctagtta gttttacttc aagatctgtg 480 gttgtgttgc ttctgcagct tatttgaaga aaagggtatt tagggtttgt gtagtttctt 540
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gcttgccctatagtgagtxg3750<210> 9 〈211〉 891 〈212〉 PRT
<213>茄子生長素相應因子氨基酸序列 〈400〉 9
Met Arg Val Ser Ser Ser Gly Phe Asn Pro 1 5 10
Gly Glu Lys Lys Cys Leu Asn Ser Glu Leu
20 25 Pro Leu Val Ser Leu Pro Pro Val Gly Ser
35 40 Gin Gly His Ser Glu Gin Val Ala
50 55 Ala His lie Pro Asn Tyr Pro Gly 65 70 Leu His Asn Leu Thr Met His Ala 85
Ala Gin Met Thr Leu Gin Pro Leu 100
Cys Leu Leu Pro Ala Glu Leu Gly 115 120 Tyr Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ala
130 135 Phe Ser Val Pro Arg Arg Ala Ala 145 150 Tyr Ser Gin Gin Pro Pro Cys Gin
Gin Pro Glu Glu Ala Thr 15
Trp His Ala Cys Ala Gly 30
Arg Val Val Tyr Phe Pro 45
Ala Ser Thr Asn Lys Glu Val Asp 60
Leu Pro Pro Gin Leu lie Cys Gin
75 80 Asp Val Glu Thr Asp Glu Val Tyr
90 95 Ser Pro Gin Glu Gin Lys Asp Val 105 110 lie Pro Ser Lys Gin Pro Thr Asn 125
Ser Gly Thr Ser Thr His Gly Gly 140
Glu Lys Val Phe Pro Pro Leu Asp 155 160 Glu Leu lie Ala Lys Asp Leu His170 175
His lie Phe Arg Gly Gin Pro Lys Arg
185 190 Ser Val Phe Val Ser Ala Lys Arg Leu 200 205 Phe lie Trp Asn Glu Asn Asn Gin Leu 220
Asn Arg Pro Gin Thr Val Met Pro Ser 235 240 Met His lie Gly Leu Leu Ala Ala Ala
165
Gly Asn Glu Trp Lys Phe Arg 180
His Leu Leu Thr Thr Gly Trp 195
Val Ala Gly Asp Ala Val lie 210 215 Leu Leu Gly lie Arg Arg Ala 225 230 Ser Val Leu Ser Ser Asp Ser 245
Ala His Ala Ala Ala Thr Asn Ser 260
Arg Ala Ser Pro Ser Glu Phe Val 275 280 Ala Val Tyr His Thr Arg lie Ser
290 295 Phe Glu Thr Glu Glu Ser Ser Val 305 310 Gly lie Ser Asp Leu Asp Pro Val 325
Ser Val Lys Val Gly Trp Asp Glu 340
Arg Val Ser Leu Trp Glu lie Glu 355 360 Pro Ser Pro Phe Ser Leu Arg Leu 370 375
250 255 Arg Phe Thr lie Phe Tyr Asn Pro 265 270 lie Pro Leu Ala Lys Tyr Val Lys 285
Val Gly Met Arg Phe Arg Met Leu 300
Arg Arg Tyr Met Gly Thr lie Thr 315 320 Arg Trp Pro Asn Ser His Trp Arg
330 335 Ser Thr Ala Gly Asp Arg Gin Pro 345 350 Pro Leu Thr Thr Phe Pro Met Tyr 365
Lys Arg Pro Trp—Pro Ser Gly Leu 380Pro Ser Leu Thr Gly Phe Pro Asn Gly Asp Met Ala Met Asn Ser Pro 385 390 395 400
Leu Ser Trp Leu Arg Gly Asp Met Gly Asp Gin Gly Met Gin Ser Leu
405 410 415
Asn Phe Gin Gly Phe Gly Val Thr Pro Phe Met Gin Pro Arg Met Asp
420 425 430
Ala Ser Leu Leu Gly Leu Gin Pro Asp lie Leu Gin Thr Met Ala Ala
435 440 445
Leu Asp Pro Ser Lys Leu Ala Asn Gin Ser Leu Met Gin Phe Gin Gin
450 455 460
Ser lie Pro Asn Ser Ser Ala Ser Leu Ser Gin Ser Gin Met Leu Gin 465 470 475 480
Pro Ser His Ser His Gin Asn Leu lie Gin Gly Phe Ser Glu Asn His
485 490 495
Leu lie Ser Gin Ala Gin Met Leu Gin Gin Gin Leu Gin Arg Arg Gin
500 505 510
Asn Phe Asn Asp Gin Gin Gin Leu Leu Gin Pro Gin Leu Gin Gin His
515 520 525
Gin Glu Val Asn Ser Gin Phe Gin His Gin Gin Arg Thr Lys Ala lie
530 535 540
Ser Ser Leu Ser Gin Met Ala Ser Val Thr Gin Pro His Leu Ser His 545 550 555 560
Leu Pro Val Leu Ser Ser Thr Gly Ser Gin Gin Thr Phe Ser Asp Met
565 570 575
Leu Gly Thr His Val Asn Ser Ser Ser Asn Ser Asn Met Gin Ser Leu
580 585 590
Leu Ser Ser Phe Ser Arg Asp Gly Ala Pro Ala Val Leu Asn Met His<formula>formula see original document page 18</formula>Leu Leu Leu Gly Asp Asp Pro Trp Gin Glu Phe Val Asn Asn Val Trp
820 825 830
Tyr lie Lys lie Leu Ser Pro Tyr Glu Val Gin Gin Met Gly Lys Glu
835 840 845
Gly Leu Asp Leu Leu Asn Gly Val Arg Thr Gin Arg Leu Pro Gly Asn
850 855 860
Val Asn Gly Cys Asp Asp Tyr Met Asn Gin Lys Gly Ser Arg Asn Thr 865 870 875 880
Met Asn Gly lie Pro Leu Gly Ser i>eu Asp Tyr
〈210〉 10 〈211〉 1686 〈212〉 DNA
〈213〉 5'-RACE擴增片段 〈400〉 10
tgtcatgcct gcaggtcgac tctagactcg agggtccaga tctccagtct tctaatacga 60
ctcactatag ggcaagcagt gtatcaacgc agagtacgcg gggaagtctt attttcatgt 120
caataatgga tttttatatg attactactc tttttgtttt t犯taattca gaattggaaa 180
tggaaaggag tgagaaggaa cagttcccta acttagcagc attttacaa/t ctccagttcc 240
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cagag肌aag肌aa辟aaaa cgaaa朋agt scagctgaag agatctsctt肪t3gcct3C 360
ttgagctctt actcagtcac tatgcagtag agatcttgaa gtggccaaaa aagttgtttc 420
ttcaatactc ttactgttgc tctttagggt tttctagtta gttttacttc aagatctgtg 480
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tcatgcagccgccgctt"t犯gacctggtctgc郷cggccgcccatggga1620
tatcatcgstcatatgtcgccctatsgtgagtcgtattacggtaccgagctcgaatcact1680
gccgtc1686
<210> 11
<211〉 2207
〈212〉 DNA
<213〉 3'-RACE擴增片段
〈400〉 11
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cttgccaagtstgttaaagcagtgtatcacctgttggtatgaggttccgg120
20atgctgtttgatcgagtgtctgggcacsattactggcatc180
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ctgcagg卿caggcagcccagagtttctctgtggg3朋ttgaacctctg300
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ggattaccttctcttactggttttcctaatggtg由tggctatgaattctccgctctca420
tggctgcgtggtg3C3tggg卿tcaggg3atgcagtcgcttaatttccagggttttggt480
gttactccatttatgcaacca已g已atggatgcttctttgttaggcttgcaacctgacatt540
tggcagcsct灘atccatcgatcagtcccttatgcagttc600
ttcctaacagttcagcatctttgagtc8gagtcagatgttgcagccttct660
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ccacagcttcagcagcaccaggaagtg咖tcacagtttcaacatcaacagcgaaccaag840
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aaaaaaaaaagcgttgataccactgcttgccctatagtga2160
gtcgtattagaatcgtcgacctgcaggcatgc犯gctggc2207
〈210〉 12
〈211〉 2676
〈212> DNA
〈213〉 ORF編碼閱讀框序列
〈400〉 12
atgagggtgtcttcatctgggttcaatcctcagcc卿gg犯gC83C3gg60
tgcttgaattcggagctgtggcacgcttgtgcaggaccattagtatcacttccacctgta120
gg犯gc卿gtagtttattttcctcaagggcatagtgagcaggttgctgcttcaaccaac180
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ccatctggattaccttctcttactggttttcctaatggtgatatggctatgaattctccg1200
ctctcatggctgcgtggtga C3tggg卿tcagggaatgcagtcgctt犯tttccagggt1260
tttggtgttactccatttatgc犯ccaag3atggstgcttctttgttaggcttgcaacct1320
gacattxtgcaaac已atggcagcactagatccatcgaaacttgcaaatC3gtcccttatg1380
cagttccaact已acagttcagcatctttgagtxagagtcagatgttgcag1440
ccttctcattcacatcaaaatctgatccaaggcttctcagaaaaccactt幼ta/tctc3g1500
gctcagatgcttcagcagcagttgcagcgcCgtC3EL3已ttttaatgatca3C3gca已ttg1560
cttcagccacagcttcagcagcaccaggaagtgaactcacagtttcaacatcaacagcga1620
3CC33ggCC3tctccagtctctctcag已tggcttcagtt3cscagcccc3tctttctcat1680
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gtgggC33tgagtatcccctatg3cagcttc犯gttgtgtgg3tgaatcet2220
ggtttcttgcagtcctccgaaatctttgtg2280
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g朋gtg3gCttgCtCgC3tgtttgggctag犯ggcttgttggaggaccct2400gaccgagaga atgatgtcct cctcctcggt 2460
gacgatcctt ggcaggagtt cgtgaataat gtttggtaca tcaagatact ctctccatat 2520
gaagtgcagc agatggggaa agagggcctt gatcttctaa atggcgtccg aacacagagg 2580
cttcctggca atgtcaatgg atgtgatgac tatatgaacc agaagggttc ccgaaatact 2640
atgaacggga taccattggg gtcacttgac tactaa 2676
〈210〉 13
〈211〉 24
<212〉 DNA
<213〉 P-U引物1 '
〈400〉 13
cagtttcaac atcaacagcg aacc 24
<210〉 14 〈211〉 22 〈212〉 腿 <213〉 P-U引物2 <400> 14
acaaatggag taacccgaga 2權利要求
1. 一種DNA序列，其堿基序列如序列表中SEQ ID NO8所示。
2. 根據權利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列來自茄子。
3. 根據權利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列為調控單性結實的生長素響應因子基因。
4. 根據權利要求1所述的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列編碼序列表中SEQ ID N0:9的氨基酸序列。
5. —種植物表達載體，其特征在于，其含有權利要求1至3中任一項的DNA。
6. 根據權利要求5所述的載體，其特征在于，所述載體為pBSSK-in載體。
7. —種轉基因植物，其特征在于，所述轉基因植物含有權利要求所述的1至3中任一項的DNA。
8. 根據權利要求7所述的轉基因植物，其特征在于，將權利要求5所述的載體用電擊法轉化 到農桿菌中，利用農桿菌介導法將所述載體轉化到植物中。
9. 根據權利要求7至8所述任一項的轉基因植物，其特征在于，所述轉基因植物為茄子。
10. 根據權利要求7至8所述任一項轉基因植物，其特征在于，所述轉基因植物是含有調控單 性結實的生長素響應因子基因的轉基因茄子。
全文摘要
本發明公開了一種與植物單性結實相關的基因，特別涉及調控茄子單性結實的生長素響應因子SmARF8，該基因cDNA序列全長3750bp。本發明還涉及將本發明的單性結實相關基因在茄子中干涉表達的方法。本發明的基因可以使轉基因植物發生單性結實，從而提高品質，延長保鮮貯藏期，并且操作方法簡單。
文檔編號C12N15/29GK101451138SQ200810164128
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月25日 優先權日2008年12月25日
發明者包崇來, 朱琴妹, 杜黎明, 毛偉海, 胡天華, 胡海嬌 申請人:浙江省農業科學院