苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黃萎病的方法

專利名稱：：苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黃萎病的方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，尤其涉及一種苜蓿抗菌肽基因，以及應用該苜蓿抗菌肽基因提高棉花抗黃蔞病的方法。
背景技術：
：棉花黃萎病是嚴重影響棉花生長與產量形成的重要病害。棉花黃萎病的病源菌是大麗輪枝菌和黑白輪枝菌，1914年在美國的弗吉尼亞州發現，現在已經傳播到中國、前蘇聯、澳大利亞、保加利亞、希臘、秘魯、巴西、阿根廷、以色列、伊拉克、伊朗、印度、西班牙等三十多個國家和地區。我國棉黃萎病于1935年從美國引種傳入，先后在陜西涇陽、山西運城、山東高密和河南安陽等地發生危害。20世紀70年代以后，全國已有12個省市(區)發生棉黃萎病，主要分布于黃河流域棉區。1993年棉黃萎病在全國大暴發，發病面積達267萬hm2。20世紀90年代中期以后，在以新疆為主的西北內陸棉區擴展速度較快，據不完全統計，該棉區的70-80%棉田已有黃萎病出現。1997年全國因黃萎病減產10.7%，損失皮棉43萬t，價值人民幣60.5億元。至2002年全國統計棉黃萎病發病面積已達300萬hm2，占我國總棉田面積的一半以上。黃萎病的病原菌非常容易傳播，能隨空氣、種子、土壤顆粒、作物殘枝、流水及農具等到處傳播。病原菌能夠在作物病殘體上、甚至直接在土壤中長期存活達十幾年之久，且可以常年積累。目前，最有效的防治辦法就是在種棉花之前，用化學試劑處理棉種和菌土。這種防治手段不但增加棉農的種植成本，而且有農藥殘留，對環境和人體健康造成很大的威脅。由于黃萎病是維管束病害，棉株一旦被病菌侵染，沒有任何有效治療手段。因此，防治棉花黃萎病最為經濟、安全、有效的辦法就是培育和推廣抗病品種。傳統的常規育種曾經育出不少抗性品種，為我國的棉花發展做出很大貢獻。但由于病菌小種一直不斷在發生變異，病菌的傳播導致了大部分病田是多種病菌小種混生，原有的抗性品種已經不能滿足生產的需要，2003年我國棉花黃萎病又嚴重發生，造成棉花大面積減產。由于現有的陸地棉栽培品種的遺傳基礎狹窄，常規的雜交育種使得棉花品種間的遺傳變異越來越小，對棉花性狀的改良越來越難。有些海島棉和野生棉品種中有抗黃萎病基因，但是從種間和亞種間雜種選出可以適宜推廣的高產品種非常困難。利用基因工程技術將外源基因導入棉花，為棉花育種提供了新的育種途徑。目前，導入棉花的抗黃萎病基因有幾丁質酶基因、(3-1，3葡聚糖酶基因、天麻抗真菌蛋白基因、葡萄糖氧化酶基因等，轉化后代都有一定的抗性提高，但到現在為止，還沒有一個轉基因抗性品種被報道。因此，尋找新的抗黃萎病基因，將其轉化到棉花基因組中，獲得能應用于生產的轉基因品種，仍然迫在眉睫。苜蓿抗菌肽是從苜蓿種子中發現的一種新的抗菌蛋白質，具有抗晚疫病(由大麗輪枝菌引起)的能力，以及具有抵抗黑脛病菌、赤星病菌入侵的能力。實驗還證明，純化的苜蓿抗菌肽還能抑制黃色鐮刀菌、番茄早疫菌等的生長和繁殖。
發明內容本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黃萎病的方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種苜蓿抗菌肽基因，它具有SEQIDNO.l所示的基因序列。一種提高棉花抗黃萎病的方法，包括以下步驟；(1)提取苜蓿種子的RNA，反轉錄為cDNA，根據抗菌肽序列設計引物，以cDNA為模板克隆苜蓿抗菌肽基因。(2)將克隆到的苜蓿抗菌肽基因連接到中間載體pMD19中，測序分析，得到SEQIDNO.l所示的基因序列。(3)將測序后的苜蓿抗菌肽基因連接到植物表達載體質粒pCAMBIA1301中，形成重組質粒pCAMBIA1301-antiVD。(4)將重組質粒pCAMBIA1301-antiVD轉化到農桿菌LBA4404中。通過農桿菌介導法將苜蓿抗菌肽基因導入棉花。經農桿菌菌液浸染的棉花下胚軸切段在選擇培養基上誘導抗性愈傷組織，經過繼代培養，誘導出胚狀體，胚狀體發育成苗。本發明的有益效果是本發明通過農桿菌介導法將外源抗菌肽基因導入棉花基因組，結果部分轉基因植株的抗黃萎病能力得到提高，為抗黃萎病育種創建種質材料。可為其它作物的黃萎病研究提供參考，具有重要的理論和實踐意4義。圖1中，(a)是苜蓿抗菌肽基因的PCR擴增產物電泳圖，(b)為苜蓿抗菌肽基因連接入載體后經PstI和BamHI雙酶切后的電泳圖，其中，M為DL2000分子量，1為PCR擴增的alfAFP基因，2為雙酶切空質粒pMD-19載體，3為雙酶切pMD-19-antiVD載體；圖2是植物表達載體pCAMBIA1301-antiVD的結構簡圖，圖中，LB:左邊界，RB:右邊界，Nos:胭脂堿合成酶基因終止子，GUS:(3-葡萄糖甘酸酶，CaMV35S:N煙草花葉病毒35S啟動子，Hygromycin:潮霉素磷酸轉移酶.CaMV35SpolyA:35S終止子；圖3是農桿菌介導棉花下胚軸遺傳轉化及再生苗的生長發育過程照片，其中，a、農桿菌介導下胚軸后抗性愈傷的誘導，b、胚性愈傷，c、球形胚，d、子葉胚，e-f、移栽到溫室的再生植株，g-j、再生植株的開花、結鈴和吐絮；圖4是50mg/L潮霉素涂抹對照植株的葉片和轉基因植株的葉片照片，其中，左邊是對照植株的葉片，右邊是轉基因植株的葉片；圖5是接種50ml大麗輪枝菌后，病原菌在對照植株和轉基因黃萎病免疫植株維管束中的繁殖照片，其中，(a)是病原菌在對照植株維管束中的繁殖，(b)是病原菌在轉基因黃萎病免疫植株維管束中的繁殖。具體實施例方式本發明提高棉花抗黃萎病的方法，包括以下步驟1.提取苜蓿種子的RNA，反轉錄為cDNA，根據抗菌肽序列設計引物，以cDNA為模板克隆苜蓿抗菌肽基因(朋"TZ))。其中，上游引物5'-GCCGGATCCATGGAGAAGAAATCACTAGCTG-3';下游引物5'畫CGGCTGCAGTTAACATCTTTTAGTACACCAGCAG-3'。2.將克隆到的苜蓿抗菌肽基因連接到中間載體pMD19中，用于測序分析，得到SEQIDNO.l所示的基因序列。3.將測序后的苜蓿抗菌肽基因連接到植物表達載體質粒pCAMBIA1301中，形成重組質粒pCAMBIA1301-antiVD。4.將重組質粒pCAMBIA1301-antiVD轉化到農桿菌LBA4404中。通過農桿菌介導法將苜蓿抗菌肽基因導入棉花。經農桿菌菌液浸染的棉花下胚軸切段在選擇培養基上誘導抗性愈傷組織，經過繼代培養，誘導出胚狀體，胚狀體發育成苗。下面根據實施例詳細說明本發明，本發明的目的和效果將變得更加明顯。實施例1、材料植物受體材料為自育品系棉花5983，該品種有優良的農藝性狀，較高枯萎病抗性，但黃萎病抗性較差。試驗所用的質粒為pCAMBIA1301(由本實驗室保存)，該質粒的T-DNA區含有在植物中表達的GUS基因和潮霉素抗性基因，基因的表達均是由CaMV35S啟動子驅動。其中GUS基因含有內含子，只能在真核生物中表達。另外，在該質粒的多克隆位點處連接了CaMV35S啟動子和終止子，外源基因在質粒的多克隆位點插入后可利用該啟動子和終止子。試驗所用的農桿菌菌株是根癌農桿菌菌株LBA4404(由本實驗室保存)。2、PCR擴增目的基因提取苜蓿種子的RNA。參照SMARTTMPCRcDNASynthesisKit(Clontech,PaloAlto，CA，USA)試劑盒操作說明將RNA反轉錄為cDNA。根據抗菌肽(antiVD)的序列，用引物設計軟件Primer5.0設計引物。上游引物5'-GCCGGATCCATGGAGAAGAAATCACTAGCTG-3'和下游引物5'-CGGCTGCAGTTAACATCTTTTAGTACACCAGCAG-3'。引物兩端分別是BamHI和PstI兩個酶切位點序列。以反轉錄的cDNA為模板，擴增基因序歹i」，擴增片段為237bp。PCR反應為94。C預變性5min;94。C變性30s，46。C退火30s，72。C延伸30s，30個循環；72"C延伸10min。PCR產物經瓊脂糖電泳、凝膠成像儀拍照記錄后用凝膠回收試劑盒(TaKaRa，AgaroseGelDNAPurificationKitVer2.0)回收目的條帶。3、目的基因的克隆和測序將目的基因連接到載體pMD-19中，該載體含氨芐青霉素抗性并可進行藍白斑篩選(Takara)。10yl反應體系如下pMD-TEasy載體回收的DNA片段0.1pmol-0.3pmo1Ligationmix5^1去離子水補足10pl用移液器吹打連接反應液使之混勻后，16'C孵育30min。將連接好的質粒6轉化到大腸桿菌DH5a，挑選白斑，在含有50mg/L的LB培養基中培養。測序分析，得到SEQIDNO.l所示的基因序列。。4、目的片段與雙元載體連接和基因的轉化用BamHl和PstI酶切T-載體，電泳，回收目的片段。用BamHI和PstI酶切質粒pCAMBIA1301，電泳，回收已經切開的質粒。ddH209lU;目的基因片段6u1;pCAMBIA13012u1;T4DNAligasebuffer2ul;總體積共20iU。輕輕混勻后于16。C溫育lh。將連接產物轉化DH5a感受態細胞。經轉化的細菌涂于含50mg/L潮霉素的固體LB培養基平板上，37"C過夜，用牙簽挑取單菌落，在含5ml含50mg/L潮霉素的液體LB培養基中37'C過夜，用SDS堿裂解法小量制備質粒，PCR鑒定。結果在以陽性克隆為模板的擴增反應中均擴增出陰性對照沒有的237bp大小的目的基因片段(antiDV)。提取質粒DNA，轉化入農桿菌LBA4404感受態細胞，進行PCR鑒定。利用農桿菌介導棉花下胚軸的基因轉化體系，將目的基因轉入棉花。將含有表達載體的農桿菌接種于YEB培養基(含潮霉素50mg/L)，28'C震蕩培養至OD600-0.5-0.7，室溫離心10分鐘(3000rpm)。沉淀用LS液體培養基(Ph5.8)懸浮。取5-7天無菌苗下胚軸切段(3-5mm)，在制備好的菌液中浸泡10-15min，用無菌濾紙吸干表面菌液，轉入表面鋪有一層濾紙的共培養基(LS培養基中含0.1mg/LKT，0.2mg/L2，4-D，30g/L葡萄糖，7.5g/L瓊月旨，pH5.8)中，21°C黑暗條件下共培養60h。接著轉移到抗性愈傷誘導培養基(MSB培養基中含O.lmg/LKT，0.2mg/L2，4-D，40mg/L潮霉素，300mg/L羧卡，pH5.8)培養3周，誘導抗性愈傷。將抗性愈傷繼代到含20mg/L潮霉素和300mg/L羧芐的MSB培養基上增殖培養，3周/欠，繼代2次。將抗性愈傷組織接入分化培養基(MSB培養基中含0.3mg/LKT，0.5mg/LIBA,20mg/L潮霉素，300mg/L羧芐，30g/L葡萄糖，7.5g/L瓊脂，pH5.8)，用于胚性愈傷組織的誘導和體細胞胚的分化和成熟。在不加抗生素的體細胞胚的萌發培養基(1/2MSB培養基中含0.5mg/LNAA，30g/L葡萄糖，7.5g/L瓊脂，pH5.8)中生長成小苗。最后得到15株再生植株。直接移栽到溫室。5、轉化體的潮霉素抗性檢測用50mg/L的潮霉素涂抹轉抗病基因再生植株，7-10d后觀察涂抹部位的顏色。黃色或枯斑為非轉基因植株，綠色為轉基因植株。結果表明，在15株轉化植株中，有3株在涂抹處有枯斑，與對照表現相同。有12株涂抹的葉片依然保持綠色。因此，推測這12株為轉基因植株。6、轉基因植株的分子檢測7采用CTAB法提取抗潮霉素再生植株和對照植株基因組DNA，用antiVD基因引物對轉基因植株進行PCR檢測，以質粒pCAMBIA1301-antiVD為陽性對照，以對照植株DNA為陰性對照。結果表明，12個植株的DNA都擴增出與陽性對照一樣大小的目的片段，而陰性對照沒有目的條帶擴增出來。初步說明這12株再生植株為轉基因植株，分別命名為Z1至Z12。用PstI單酶切PCR陽性轉基因植株和對照植株的基因組DNA，經酶切和電泳分離后，轉移到尼龍膜上，以質粒pCAMBIA1301-antiVD為陽性對照，用antiVD基因片段做探針進行Southern印跡雜交。檢測結果表明，陰性對矗沒看檢測到雜交信號。陽性對照有很強的雜交信號。12個PCR陽性轉基因植株都有雜交信號，其中6個植株是單拷貝，6個植株有2個拷貝。Southern印跡結果說明目的基因己經成功的轉入這12個再生植株基因組中。因為大麗輪枝菌主要是從根部侵入棉花植株，如果抗病基因能在根部大量襲達，則大麗輪枝菌侵染棉花的機會就會減少很多。因此，我們主要是關心這個基因在轉化植株根部的轉錄。提取Southern印跡陽性植株的根部RNA，結果表明，RNA電泳后有明顯的兩條主帶28S和18S，無降解現象。分光光度計測定濃度后，可用于Northern雜交。雜交結果表明antiDV基因在根部大量表達。7、轉基因棉株抗病性檢測為了研究轉基因植株對棉花黃萎病的抗性，在棉株移栽30天后，將50ml菌液倒入轉基因植株和對照植株的根部。分三個時期調査植株的發病情況。調查結果如表1所示，有5株(Zl、Z4、Z5、Z10和Zll)轉化植株在整個生育期沒有發病癥狀。其余7株有不同程度的發病，且隨著植株的生長，發病情況愈來愈嚴重。到成熟期，有3株發病級別為1級(Z3、Z6和Z7)，有3株發病級別為2級(Z2、Z3和Z12)，有1株發病級別為3級(Z9)。這個結果與轉基因植株抗病性的離體分析結果基本吻合。植株提取液抑菌活性高的植株，在本試驗中的發病級別低。8表1用大麗輪枝菌接種后對照(C)和轉基因(Z1-12)植株的發病級別:<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>為了證實轉基因植株抗病性的提高與病源物大麗輪枝菌在植株體內的繁殖減少有關，將接菌后成熟期的轉基因植株和對照植株的剖桿。結果表明，對照植株莖桿的維管束中充滿了大麗輪枝菌和菌絲，而轉基因免疫植株中沒有可見的大麗輪枝菌。因此，轉基因植株抗病性的提高是由于導入了外源基因a^/DF的表達抑制了大麗輪枝菌的侵入。苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黃萎病的方法的基因序列表SEQUENCELISTING<110〉浙江大學〈120>苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黃萎病的方法<160〉1<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉218〈212>DNA<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>權利要求1.一種苜蓿抗菌肽基因，其特征在于，它具有SEQIDNO.1所示的基因序列。2.—種提高棉花抗黃萎病的方法，其特征在于，包括以下步驟；(1)提取苜蓿種子的RNA，反轉錄為cDNA，根據抗菌肽序列設計引物，以cDNA為模板克隆苜蓿抗菌肽基因。(2)將克隆到的苜蓿抗菌肽基因連接到中間載體pMD19中，測序分析，得到SEQIDNO.l所示的基因序列。(3)將測序后的苜蓿抗菌肽基因連接到植物表達載體質粒pCAMBIA1301中，形成重組質粒pCAMBIA1301-antiVD。(4)將重組質粒pCAMBIA1301-antiVD轉化到農桿菌LBA4404中。通過農桿菌介導法將苜蓿抗菌肽基因導入棉花。經農桿菌菌液浸染的棉花下胚軸切段在選擇培養基上誘導抗性愈傷組織，經過繼代培養，誘導出胚狀體，胚狀體發育成苗。3.根據權利要求2所述提高棉花抗黃萎病的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述引物包括上游引物5'-GCCGGATCCATGGAGAAGAAATCACTAGCTG-3';下游引物5'-CGGCTGCAGTTAACATCTTTTAGTACACCAGCAG-3'。4.根據權利要求2所述提高棉花抗黃萎病的方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述選擇培養基為抗性愈傷誘導培養基。全文摘要本發明公開了一種苜蓿抗菌肽基因及提高棉花抗黃萎病的方法。該方法根據抗菌肽氨基酸序列設計PCR引物，以苜蓿種子的RNA為模板，反轉錄成苜蓿抗菌肽cDNA；以cDNA為模板克隆苜蓿抗菌肽基因；將苜蓿抗菌肽基因連接到植物表達載體質粒pCAMBIA1301中，形成重組質粒pCAMBIA1301-antiVD；然后通過農桿菌介導法將苜蓿抗菌肽基因導入棉花，在選擇培養基上誘導抗性愈傷組織，經過繼代培養，誘導出胚狀體，胚狀體發育成苗后；應用本發明的方法，轉基因棉花的抗黃萎病能力得到提高。文檔編號C12N15/29GK101445801SQ200810163520公開日2009年6月3日申請日期2008年12月29日優先權日2008年12月29日發明者張海平,王學德申請人:浙江大學