專利名稱：：鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列及其方法
技術領域：
：本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列及其方法。
背景技術：
：赤霉病是小麥生產上重要的一種流行性病害。該病害主要分布在長江中下游冬麥區和東北春麥區，長江上游和華南冬麥區也常發生。該病害發生后一般減產10-20%,嚴重時達80-90%。它的危害嚴重影響小麥的產量和質量，同時病菌產生的一系列真菌毒素可引起人畜中毒。在我國,亞洲鐮孑包菌(Fwran'wm)和禾谷鐮孑包菌(Fwsan'wmgraw/"earaw)是小麥赤霉病的主要致病菌。亞洲鐮孢菌主要分布在我國南方地區，而禾谷鐮孢菌主要分布在北方地區。這兩個小種非常相近，根據多個基因序列差異對亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的鑒定較麻煩，利用已報道引物對GzTri7/fl和GzTri7/rl進行PCR擴增(Zhangetal.,2007,MycologicalResearch,967-975),不能給出擴增產物或得到161-bp產物為亞洲鐮孢菌，得到172326-bp產物為禾谷鐮孢菌，該對引物無法區分亞洲鐮孢菌和其它病菌真菌。因此，需要重新建立一套新的體系，即能快速檢測，又能準確鑒定這兩個不同的小種。該體系的建立將對兩個小種的快速檢測、分布研究及小麥赤霉病的防治具有重要意義。
發明內容本發明提供了一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列，該引物特異性高，利用該引物序列能快速、準確地鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌。一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列，包括兩組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO:l所述的堿基序列，第一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO:2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO:3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO:4所述的堿基序列。已有研究可知，亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌在遺傳背景上存在較大差異，通過對3個亞洲鐮孢菌菌抹(Fal,Fa2,Fa3)和3個禾谷鐮孢菌菌抹(Fgl,Fg2,Fg3)的cy/5L4基因測序發現，如圖1所示，亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的菌株間共存在69處核苷酸差異，其中16個核苦酸引起氨基酸變化。根據兩個菌系c少/5/J基因序列的差異，我們設計了上述兩組引物。第一組引物的正向引物3，末端堿基T與亞洲鐮孢菌菌株的特異堿基T配對，第一組引物的反向引物3，末端堿基G和倒數第二個堿基T分別與亞洲鐮孢菌菌林特異堿基CA配對。同理，第二組引物的正向引物3，末端堿基T與禾谷鐮孢菌(菌抹的特異堿基T配對，第二組引物的反向引物3，末端堿基A和倒數第二個堿基C分別與禾谷鐮孢菌菌抹特異堿基TG配對。利用第一組引物對亞洲鐮孢菌菌抹的DNA進行擴增可以得到292-bp的片斷，利用第二組引物對禾谷鐮孢菌菌抹的DNA進行擴增可以得到352-bp的片斷，利用任何一組引物對其它真菌的DNA進行擴增，不能擴增出任何產物。本發明還提供一種應用上述引物鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的方法，包括以下步驟a、提耳又待;險測菌的DNA;b、以待檢測菌的DNA為模板，使用第一組引物和第二組引物進行PCR擴增；c、PCR產物經凝膠電泳后用EB進行顯色，當凝膠上顯現292-bpDNA條帶時，說明待檢測菌為亞洲鐮孢菌。當凝膠上顯現352-bpDNA條帶時，說明待檢測菌為禾谷鐮孢菌。當凝膠上未顯現條帶時，則說明待檢測菌為其它病菌真菌。本發明提供的兩組引物和方法能快速鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌，檢測引物具有很高特異性，且整個PCR和電泳過程僅需2h。因此，本發明的引物和檢測方法可用來快速、準確、全面檢測引起小麥赤霉病的主要病原菌。圖1為本發明引物的序列圖2為引物特異性檢測中各菌抹DNA擴增后的凝膠電泳圖；圖3為檢測不同地方子囊殼DNA擴增后的凝膠電泳圖。具體實施方式所選用的菌林尖孑包錄孑包菌(Fusw/顯o平/。r應)、燕麥錄孑包菌(Fflve"acewm)、銳頂鐮孢菌(F)、半凈果鐮孢菌(F^附/fedww)、串J朱鐮孑包菌swZ)g/W/"(3ra)、黃色鐮孑包菌(Fcw/won潔)以及5個亞洲鐮孑包菌(Fwsan'wwas她c訓)菌抹(Fal,,Fa2,Fa3，Fa4,Fa5)和5個禾谷嫌孑包菌(Fw5W7'謂gramz'wear膽)菌抹(Fgl,Fg2,Fg3，Fg4，Fg5)。上述菌林均為常見的植物病原真菌，是本發明所需的試驗材料，對菌抹沒有特異性要求，可以通過常規的分離純化方法得到。提取DNA用接種針從PDA平板上刮取菌絲(100mg)，置于1.5-mLEppendorf管中，加500DNA提取裂解液(200mMTris-HCl，50mMEDTA，20mMNaCl,l%SDS,pH8.0)，用電鉆驅動玻棒充分研磨，振蕩混勻，室溫靜置10min;13200r/min4。C,離心5min;取上清液約400pL于新的1.5-mLEppendorf管中，力。750)xL無水乙醇，混和混勻，13200r/min4°C，離心5min,棄上清；沉淀用70%乙醇洗滌，室溫放置干燥5-10min,溶于30(iL無菌水中，-201:保存備用。上述的6種真菌以及待檢測的亞洲鐮孢菌菌林和禾谷鐮孢菌菌抹的DNA均采用上述方法提取。引物合成如圖1所示，根據3個亞洲鐮孢菌菌抹和3個禾谷鐮孢菌菌抹中c;^5L4基因序列，設計了2對引物Fa-F/Fa-R和Fg-F/Fg-R。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述序列可以通過常^5L方法合成，也可以委托專業生物試劑公司合成，本發明的引物由上海博彩合成。引物特異性驗證以上述提取的8種真菌的DNA為模板，用Fa-F/Fa-R和Fa-F/Fa-R兩組S1物進行PCR反應，每次反應均包含一個陰性對照(用無菌水代替DNA模板)。25反應體系1(iLDNA模板(約0.4ng)，引物各0.2pmolI—1,dNTP0.2pmoir',MgCl22mmoll:lx緩沖液(北京東勝公司生產)，聚合酶1.5U個單位，雙蒸水補足至25^L。反應條件為95。C預變性3min,94。C變性30s，55。C退火30s,72°C延伸30s,進行35個循環，最后72。C延伸5min。PCR產物用1.5。/。的瓊脂糖在1xTAE緩沖液中電泳后，用EB顯色拍照。如圖3所示，5個禾谷鐮孢菌菌株(Fgl，Fg2，Fg3,Fg4,Fg5)均能擴增到352-bp的條帶，5個亞洲鐮孢菌菌林(Fal，Fa2，Fa3，Fa4,Fa5)均能擴增到292-bp的條帶，其它病原真菌都沒有擴增到任何條帶。由此可見，上述兩組引物的特異性很高，適合鑒定亞洲鐮孢菌菌抹和禾谷鐮孢菌。檢測不同地區亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的分布/人江蘇省海安市A(大爿/H真)、江蘇省海安市B(海安鎮)、江蘇省靖江市和河南省漯河市的小麥地中收集子囊殼(每塊地約100mg)。將子嚢殼置于1.5-mLEppendorf管中，加入,1DNA提取緩沖液(1-2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，200mMTris-HCl,50mMEDTA,200mMNaCl,1%SDS和ddH20,pH8.0)，用尖頭玻棒安裝在常用的電工手電轉上研磨1min,再向離心管中加入400pl的提取緩沖液蝸旋混勻后，室溫靜置10min;將上述混合液4°C,15,000rpm條件下離心5min，再將上清液轉移到另一離心管中，然后加入750pl無水乙醇，混勻后4。C，15,000rpm條件下離心2min,棄上清；將沉淀的DNA用70。/。乙醇洗滌，室溫干燥后溶于50^tl無菌水，即為提取的DNA;將上述的DNA溶液用UNIQ-10柱式PCR產物回收試劑盒(上海生工生產)過柱純化。利用Fa-F/Fa-R和Fa-F/Fa-R兩組引物對上述田間樣品提取的DNA進行PCR擴增，反應設陰性對照，PCR反應體系同上所述。如圖3所示，江蘇海安市大公鎮和海安鎮及江蘇靖江市的子嚢殼DNA經PCR擴增后得到292-bp片段，說明這三個地方只存在小種亞洲鐮孢菌，河南省漯河市子嚢殼DNA經PCR擴增后得到352-bp和292-bp兩種片段，說明該地區同時存在亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌兩個小種。SEQUENCELISTING<110>浙江大學<120>鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列及其方法<130><160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211〉18<212>DNA<213>亞洲嫌孑包菌(Fusariumasiaticum)<400>1cagcttcctcgaagacct18<210>2<211>21<212>DNA<213>亞洲鐮孑包菌(Fusariumasiaticum)<400>2ggaccgtaaatttcttcagtg21<210>3<211>20<212>DNA<213>禾谷鐮孑包菌(Fusariumgraminearum)<400>3tatcccttatgggtcttggt20<210>4<211>21<212>DNA<213>禾谷嫌孑包菌(Fusariumgraminearum)<400>4ggaccgtaaacttcttctgca2權利要求1、一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列，其特征在于包括兩組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO1所述的堿基序列，第一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO4所述的堿基序列。2、一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌方法，包括以下步驟a、提取待4企測菌的DNA;b、以待檢測菌的DNA為模板，使用第一組引物和第二組引物進行PCR擴增；c、PCR產物經凝膠電泳后用EB進行顯色，觀測凝膠中DNA條帶大小，擴增得到292-bpDNA條帶為亞洲鐮孢菌，擴增得到352-bpDNA條帶為禾谷鐮孢菌。全文摘要本發明公開了一種鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌的引物序列及其方法，包括兩組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO1所述的堿基序列，第一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO4所述的堿基序列。本發明引物序列特異性高，能夠用于快速鑒定亞洲鐮孢菌和禾谷鐮孢菌。文檔編號C12N15/11GK101440402SQ200810163248公開日2009年5月27日申請日期2008年12月11日優先權日2008年12月11日發明者馨劉,尹燕妮,蔣金花,馬忠華申請人:浙江大學