專利名稱：具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及苯系化合物生物處理技術領域，尤其涉及一種具有降解苯系化 合物能力的解淀粉芽孢打菌及其應用。
背景技術：
苯系化合物是一類易揮發(fā)的單環(huán)芳香類化合物，包括苯、甲苯、乙苯、二
甲苯等，簡稱為BTEX，廣泛應用于石油、化工、農藥、紡織、造紙、油漆、制 鞋等工業(yè)的生產過程，是環(huán)境中分布較廣的一類有毒化合物。BTEX具有"三致 效應"，被許多國家列入優(yōu)先控制污染物，且已被確認為強致癌物質。研發(fā)廢水、 廢氣中BTEX的污染控制技術顯得十分重要和迫切。目前，生物降解技術是降 解這類物質的最有效方法之一。
采用生物法凈化廢水、廢氣中BTEX等有毒化合物的關鍵之一便是獲得具 有高效降解BTEX能力的優(yōu)良菌株。人們已經分離出了多株單環(huán)芳香類化合物 降解菌，主要有假單胞菌(i^e^fomoww)、不動桿菌"c/wetok cfe。、紅球菌 (i /zO(iococcws)、羅爾其Jf通氏菌(i a/加m'a)、產堿桿菌(嚴fl/扭"es)、黃桿菌 屬(F/avo6ac&Www)、抱并瓦毒屬真菌(C7"(io/ /H'a/op/zora)、諾卡氏菌(iVocaWa) 等。這些降解菌株僅能降解某一種或兩種苯系化合物，且大多數菌株的降解效 率有待進一步提高，而對BTEX混合物中各物質均能實現高效降解的菌株并不 多見。
經檢索有關專利文獻，僅發(fā)現有關于芽孢桿菌(萬a"7/w 6atov/m^ i^4 CGMCC iVo.M92)在厭氧條件下反硝化降解苯的報道，尚未見本發(fā)明中在好氧 條件下應用Bac/〃M am少/o/^we/a"'ms降解BTEX的報道。該降解菌的發(fā)現對 BTEX類污染物生物凈化的工程實踐具有重要意義
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種具有降解苯系化合物能 力的解淀粉芽孢桿菌及其應用。
為了實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術方案如下提供一種具有降解 苯系化合物能力的解淀粉芽孢桿菌，它的16S rDNA具有SEQ ID No. 1的序 列。該菌株在固體培養(yǎng)基中呈淡桔紅色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤，直徑為 l-2mm;菌體的形態(tài)為稍粗桿菌，長度在10pm左右；形成芽孢，芽孢為橢圓形； 好氧，革蘭氏染色陽性，接觸氧化酶陰性，能以BTEX混合物或其中的單一物 質為唯一碳源。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢 桿菌可實現高效降解BTEX混合物。
本發(fā)明的具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢桿菌于2008年10月29 日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為湖北省武漢市武昌 珞珈山武漢大學內)，保藏編號為CCTCC NO: M208181。
圖1為Sac/〃M w^/o/—,e/ac/my byf-5顯微鏡和掃描、透射電鏡照片，其中， a為革蘭氏染色顯微鏡圖片，b為芽孢染色顯微鏡圖片，c為掃描電鏡圖片，d 為透射電鏡圖片；
圖2為Bac/〃ws awy/o/z々we/ac/era byf-5的系統發(fā)育樹圖3為不同溫度下菌Bac/〃ws awy/o/z々we/ac&ra byf-5對BTEX的降解曲線
圖4為不同pH下菌Bac/〃w am_y/o/&we/ac/era byf-5對BTEX的降解曲線圖； 圖5為菌5a"7/ws awj/o/^we/ac/ms byf-5對不同初始濃度的苯的降解曲線
圖6為菌Bac/〃w amy/o/z々we/ac/ms byf-5對不同初始濃度的甲苯的降解曲線
圖7為菌萬a"7/w am少/o/Z^^/ac/era byf-5對不同初始濃度的乙苯的降解曲線
圖8為菌Sa"'〃ws amj/o/^we/acz'ms byf-5對不同初始濃度的鄰二甲苯的降解 曲線圖9為菌5ac/〃ws aw_y/o/7^e/ac/era byf-5對混合底物的降解曲線圖。
具體實施例方式
本發(fā)明提供了一種具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢桿菌(^MZ7/M
a，fo/—咖c/ms1)， 申請人:將其編號為byf-5。
所述S(3"'〃ws "附y/o/z々Me/ac/e似byf-5來源于中國石化浙江鎮(zhèn)海煉化污水處 理廠曝氣池中的活性污泥中，經馴化、分離、純化獲得。
該菌株在固體培養(yǎng)基中呈淡桔紅色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤，直徑為 l-2mm;菌體的形態(tài)為稍粗桿菌，長度在lOpm左右；形成芽孢，芽孢為橢圓形； 好氧，革蘭氏染色陽性，接觸氧化酶陰性，能以BTEX混合物或其中的單一物 質為唯一碳源，其生理生化特征如表1所示。Sac/Z/ws a^y/o/^we/ac/my byf-5的 16S rDNA具有SEQ ID No. 1的序列。
表1.5a"'〃ws aw_y/o/—咖c/ms byf-5的生理生化特征
實驗項目結果
M.R(甲基紅)+
V.P實驗+
淀粉水解酶_
吲哚實驗+
硝酸鹽還原——
明膠實驗—
H2S實驗+
葡萄糖+
乳糖 _其中，"+ "表示能利用或反應陽性；"一"表示不能利用或反應陰性 所述5腦'〃ws應y/。/—咖c/ms byf-5的16S rDNA的Genebank的登錄號為 FJ169474,已于2008年10月29日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱 CCTCC，地址為湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學內)，保藏編號為CCTCC NO: M 208181。
本發(fā)明的Baa'〃us aw_y/o/^we/ac/ms byf-5可用于污水體系中苯系化合物的 高效降解，具體方法為將Bac/〃ws amy/o/^we/ac/era byf-5 CCTCC M 208181懸浮 于含有苯系化合物的污水中，在15-35"C， pH5-9的條件下培養(yǎng)。
本發(fā)明的Bacz7/ws amy/o/z々i^/ac/era byf-5在污水中的最佳培養(yǎng)溫度為30°C ， 最佳pH為8。下面根據實施例詳細描述本發(fā)明，本發(fā)明的目的和效果將變得更加明顯。 實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例中的百分含量，如無 特別說明，均為質量百分含量。
實施例l.Bac/〃w amy/og"e/adembyf-5的分離、純化及其鑒定
1. 5ac/〃us 鵬—《w咖c z'era by f- 5的分離及純化
5 cz7/m aw_y/owe/ac/em byf-5是從浙江鎮(zhèn)海煉化污水處理廠曝氣池的活 性污泥中取樣，經馴化、分離及純化得到的革蘭氏陽性菌。具體步驟如下
(1) 污泥定向馴化
取浙江鎮(zhèn)海煉化污水處理廠曝氣池的活性污泥。活性污泥進行苯系化合物 (BTEX)定向馴化，每5天為一馴化周期，馴化3個月，直至活性污泥對苯系 化合物實現穩(wěn)定高效降解。
(2) 菌株的篩選與純化 利用苯系物降解菌篩選培養(yǎng)基對活性污泥進行菌株篩選。苯系物降解菌篩
選培養(yǎng)基成分KH2P04， (X5g; K2HP04， 0.5g; NaCL， 0.01g; NH4CL， lg; MgCl2 6H20， 0.2g; CaCL2， 0.02g; MnS04， 0. 339mg; ZnS04， 0.428mg;鉬 酸銨，0.347mg;瓊脂，15g;蒸餾水，1000ml; pH 7.2-7.4。苯系物另外分別添 加苯，200mg/l;甲苯，200mg/l;乙苯，200mg/l;鄰二甲苯200mg/l。
按照菌株分離純化的常規(guī)方法，在恒溫培養(yǎng)箱28"C培養(yǎng)2-3天，挑取平板 上長出的單菌落，得到多株純菌落。
將篩選到的多株苯系物降解菌在含有苯系化合物為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng) 基中考察菌株對苯系化合物的去除效果，通過同空白實驗的對照，結果得到了 高效降解苯系化合物的菌株byf-5。所用的培養(yǎng)基成分為苯0.1g/L，甲苯0.1g/L， 乙苯0.1g/L，鄰二甲苯0.1g/L， NH4ClO.lg/L， MgCl2 6H2O0.08g/L， K2HP04 0.25 g/L， CaCl2 2H20 0.1 g/L, pH 7.2-7.4。
2. Sac/Z/ws awj;/o《w咖c/em1 byf-5的16S rDNA鑒定
通過16S rRNA序列分析和Biolog微生物鑒定系統鑒定，確定byf-5菌為 Bacz7/w5 awy—w^/bcz'era。 具體步驟如下
采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒(V2.2，上海申能博彩生物科技 有限公司)提取5ac/〃附 awj/o^e/flc/my byf-5的DNA， 4。C保存。然后作為PCR 反應的模板，設計引物，擴增^acz'〃船a附y/o《we/ac/e似byf-5的全序列DNA， 上下游引物序列分別如下
BSF8/20: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
BSR1541/20: 5'-AAGGA GGTGATCCAG CCGCA-3'PCR反應程序設定為先94°C預變性4min;然后94°C變性1 min， 59°C 退火lmin， 72。C延伸1.5min，循環(huán)35個周期；然后72°C延伸10min;最后 4°C保持10min。將PCR產物進行測序(上海英駿)，測序得到SEQ ID No. 1的序列。
將byf-5的16S rDNA序列上傳到Genbank，獲得Genbank的登錄號 FJ169474,同時同Genbank中的基因序列進行同源性比較，發(fā)現其屬于5acz7/us 屬，然后通過系統發(fā)育樹的建立，byf-5可能為5"c,〃w5 awy/o《we/ac/era，圖2 為該菌的系統發(fā)育樹圖。為了進一步確定鑒定結果，通過各項生理生化實驗以 及Biolog微生物鑒定系統的分析，最終確定byf-5為萬a"7/ws am_y/o^e/flc/my。
實施例2. ^ac///^ a附少/ogwe/ac!'my byf-5對BTEX生物降解性能檢測
1. 不同溫度下菌5flc/〃w byf-5對BTEX的生物降解特性 在不同溫度下實施fiac///^ am_yfo/z'^e/ac/my byf-5對BTEX的降解實驗，發(fā)
現其在25-3(TC具有較高的降解苯系化合物的能力，從實際應用角度看，3(TC為 最為適宜的溫度，此時去除率最高，具體實施步驟如下
在含有苯系化合物為唯一碳源的無機培養(yǎng)基中，苯系物的終濃度為苯 50mg/L、甲苯50mg/L、乙苯50mg/L、鄰二甲苯50mg/L，加入新鮮培養(yǎng)的hl-4 的菌懸液，OD6。。為0.2，接種量為lml/50ml，分取50ml培養(yǎng)基分裝至5個250ml 的鹽水瓶中，分別置于15。C、 20°C、 25°C、 30°C、 35°C的搖床中160rpm培養(yǎng)； 另外準備5個同樣的未接菌的培養(yǎng)基分別置于對應的溫度同時培養(yǎng)，作為空白 對照。培養(yǎng)48h后，取樣氣相檢測苯系化合物的濃度，同時測定菌株的菌密度 (OD6QQ)，繪制苯系物去除率曲線圖。
結果如圖3所示，結果表明在溫度為15i:時，菌株對苯系化合物的去除率 最低。隨著溫度的逐漸提高，菌株對苯系化合物的去除率也隨之提高；在溫度 為25 3(TC時，菌株的生長和對苯系物的去除率都達到了較高的值；溫度30°C 時達到了最大值，48h對苯系物的去除率分別為苯，97.5%;甲苯，93.2%;乙苯， 76.7%;鄰二甲苯，67.5%。隨著溫度的進一步提高，菌株的生長和降解能力開 始下降。
2. 不同pH下菌Sacz7/w;y aw^/o/^we/ac/era byf-5對BTEX的降解特性 在不同pH下實施Ba"7/ws am_y/o/z々Me/ac/era byf-5對BTEX的降解實驗，
結果表明其最佳的生長降解pH值為8，具體實施方案如下
在5個250ml的鹽水瓶中加入50ml等量的無機鹽培養(yǎng)基，苯系化合物作為 唯一碳源，最終濃度同上，分別調節(jié)pH至5、 6、 7、 8、 9;同時準備5瓶相同
7的培養(yǎng)基作為空白對照。均接種lml新鮮培養(yǎng)的byf-5菌懸液，OD6oo為0.2，在 30°C， 160rpm下培養(yǎng)。分別在0h， 48h取樣，檢測培養(yǎng)基中的苯系化合物濃度 變化和菌株的菌密度(OD,)，繪制苯系物去除率曲線圖。
結果如圖4所示，在pH為5、 9時，byf-5對苯系物去除效率較差。在pH 為5的培養(yǎng)液中，溶液較澄清，表明菌株生長不好。在pH為5 9的條件下，細 菌都能以苯系化合物為唯一碳源生長，只是生長和降解速率有所不同，在pH為 8時，菌株byf-5的生長和降解速率最快，對苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯48h的 去除率分別為99.5%、 97°/。、 70.1%、 67.5%。
3. 菌8a"7/船aw>>/o/z々we/flc/e;w byf-5對不同初始濃度的BTEX的降解情況 在不同苯系物初始濃度下，實施byf-5對苯、甲苯、乙苯和鄰二甲苯四種苯
系物的降解，結果發(fā)現byf-5對苯、甲苯、乙苯和鄰—甲苯的耐受濃度為500mg/l、 300mg/l、 125mg/l、 200mg/l。具體實施方案如下
在250ml的鹽水瓶中加入50ml的無機鹽培養(yǎng)基，苯系化合物作為唯一碳源。 苯的最終濃度為25、 50、 150、 300、 500mg/l;甲苯的終濃度為25、 50、 150、 200、 300mg/l;乙苯的總濃度為25、 50、 75、 100、 125mg/l;鄰二甲苯的終濃度 為25、 50、 100、 150、 200mg/l。分別接種等量lml 006。。為0.2的菌懸液，30 °C， 160rpm培養(yǎng)，間隔一段時間取樣，繪制byf-5對苯系物的降解曲線圖。
從圖5-圖8可以看出在苯濃度低于500mg/l時，byf-5可快速地降解苯，細 菌生長良好，而高于500mg/l時，菌株受到強烈抑制；由于受甲苯在水中的溶解 度限制，甲苯的最高濃度只做到300mg/1，當甲苯濃度在300mg/1以內時，byf-5 都可快速地降解甲苯，細菌生長良好；byf-5對乙苯、鄰二甲苯的降解速度要慢 于苯和甲苯，當乙苯、鄰二甲苯濃度分別大于125mg/l、 150mg/l時，byf-5的生 長降解受到抑制，不能高效降解。
4. 菌5acz7/ws am^/o/^we/ac^ra byf-5對混合底物的降解情況
在以苯、甲苯、乙苯、鄰二甲苯四種苯系物為混合底物，實施菌5a"7/w 畫^^一e/ac/ms byf-5對BTEX的降解特性，結果表明其對三種物質的降解難 易程度為鄰二甲苯>乙苯>甲苯>苯。具體實施方案如下
在250ml的鹽水瓶中加入50ml的無機鹽培養(yǎng)基，苯系化合物作為唯一碳源， 總濃度分別都為50mg/L。接種lmlOD,為0.2的菌懸液，30°C， 160rpm培養(yǎng)。
每隔一段時間取樣，檢測培養(yǎng)基中的苯系化合物濃度和菌密度(OD6(K))，直到降
解完全。繪制苯系物的降解曲線和菌株生長圖。
結果如圖9所示，在降解初期，菌株對苯系物的降解有15-20h左右的延滯 期，同時菌株生長緩慢；在20h后，菌株開始適應該環(huán)境，進入對數生長期，
8苯系物被快速降解，從圖中可以看出，byf-5對苯和甲苯的去除速率要明顯快于 乙苯和鄰二甲苯，苯略快于甲苯；在45h時，苯被降解完全，甲苯、乙苯、鄰 二甲苯先后在52h、 60h、 65h被降解完。菌株的菌密度在45 50h達到最大值， 50h后菌株進入衰退期。具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢桿菌的16s rRNA基因序列SEQ ID No. 1表SEQUENCE LISTING <110>浙江工業(yè)大學<120>具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢桿菌及其應用 <160> 1<170> Patentln version 3. 1 <210> 1 <211> 1464 〈212〉 腿<213〉 Bacillus amyloliquefaciens <400> 1cctaataca/tgcaagtcgagcggac卿tgggagcttgctccctgatgttagcggcggac60gggtg3gtaacacgtgggtaacctgcctgta卿ctgggataactccggg■accggggc120tgcttgtttgaaccgcatgg咖ggtggcttcggctacca180cttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtg鄉(xiāng)taacggctcaccaaggcgac240gatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagact300cctacgggaggcagcagtagggaatcttccgc犯tggacgaaagtctgacggagcaacgc360cgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtt￡igggaagaaca^gtgcc420gttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactecgtgcc480agcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgt咖gggct540cgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattgg6003雄tgggg3acttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtga^tgc660gtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctga720ggagcga卿cgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacga780tgagtgctaagtgUagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcatteagcact840ccgcctggggagtacggtcgcaa卵ctg朋actcaaaggaattgacgggggcccgcacaa9009<formula>formula see original document page 10</formula>
權利要求
1、一種具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢桿菌，其特征在于，它的16SrDNA具有SEQ ID No.1的序列。保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM 208181。
2、 權利要求1所述具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢桿菌在降解BTEX混 合物中的應用。
3、 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，具體方法為將解淀粉芽孢桿菌懸 浮于含有BTEX的污水中，在15-35"C， pH5-9的條件下培養(yǎng)。
4、 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，解淀粉芽孢桿菌在污水中的最佳 培養(yǎng)溫度為30。C，最佳pH為8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有降解苯系化合物能力的解淀粉芽孢桿菌，它的16S rDNA具有SEQ ID No.1的序列，該菌株在固體培養(yǎng)基中呈淡桔紅色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤，直徑為1-2mm；菌體的形態(tài)為稍粗桿菌，長度在10μm左右；形成芽孢，芽孢為橢圓形；好氧，革蘭氏染色陽性，接觸氧化酶陰性，能以BTEX混合物或其中的單一物質為唯一碳源，可實現高效降解BTEX混合物。
文檔編號C12N1/20GK101514329SQ200810163160
公開日2009年8月26日 申請日期2008年12月18日 優(yōu)先權日2008年12月18日
發(fā)明者峰 葉, 吳石金, 張麗麗, 王家德, 陳建孟 申請人:浙江工業(yè)大學