含89k毒力島豬鏈球菌2型核酸的熒光檢測試劑盒及方法

專利名稱：含89k毒力島豬鏈球菌2型核酸的熒光檢測試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及一種含89K毒力島基因豬鏈球菌2型核酸的 Taqman-MGB雙重熒光探針PCR檢測試劑盒及纟企測方法。
(二)
背景技術：
豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，自1968年國際上首次報道 至2007年止，全世界范圍內已超過409例人感染豬鏈球菌2型(SS2 ) 導致病例發生。早在1990年^火 1991年春，我國長江三角洲某些地區就 已發生因鏈球菌引起的疾病，癥狀表現為鏈球菌中毒性休克綜合癥 (STSS)， 1998-2005年江蘇和四川SS2疫情大暴發，死亡多例，患者大多 表現為STSS,但對何種致病因子引起該病及其致病機理尚未查明。2007 年文獻報道，對來自中毒性休克綜合癥臨床病人的1998年江蘇分離株和 2005年四川分離抹分別作了全序列基因測定，.發現這兩個中國強毒林比 歐洲抹多出一段89K序列片段。闡明該致病因子可能是三次流行的SS2 的一種重要致病因子，可能是引起我國STSS病的關鍵致病島，可作為判 定菌抹毒力強弱的指標。2008年報道了沒有89K毒力島基因的SS2毒林 其毒力下降，致病性與一般SS2林相同；其動物試驗表明含89K毒力 島的SS2感染動物后，兩天內動物死亡；當敲除了 89K毒力島中的兩組 分細胞信號轉導基因SalK/SalR的SS2感染動物時，動物存活14天以上。 可見89K毒力島為SS2強毒力抹所必有的。
目前針對SS2核酸建立快診方法的有普通PCR、多重PCR及熒光定 量PCR等方法，但未見有同步檢測豬鏈球菌和89K毒力島基因的檢測方法。為了更好的研究攜帶89K致病島基因SS2菌抹感染的流行病學特征， 早期發現病人，及時救治，和有效控制這種病原菌的傳播與流行，有必要 建立一個快速、敏感且特異的檢測方法。為此，針對SS種特異性16S rRNA 基因以及89K毒力島基因序列合成TaqMan-MGB引物與探針研制了該方 法。
近幾年發展起來的熒光定量PCR技術，它利用了 PCR對脫氧核糖核 酸(DNA)的高效擴增，探針技術的高特異性和光譜技術的敏感性以及 定量特點，不僅克服了常規PCR定性檢測的不足，而且具有直觀、重復 性好、特異性強、敏感性高和易操作等優點。
熒光定量PCR技術原理熒光定量PCR是利用熒光染料在激發光的 作用下所釋放的熒光光能的變化來動態直接反映出PCR擴增產物量的變 化。因熒光信號變量與擴增產物量成正比，通過足夠靈^:的自動化熒光定 量PCR儀就可以通過對焚光信號的采集與分析來實現對初始模板的定 量。 —
常用的熒光標記方法可簡單分為兩大類1、非特異檢測一雙鏈DNA 內插式熒光染料；2、擴增序列專一檢測一主要指熒光探針和引物探針， 熒光標記的探針共有三類(1)分子信標探針；(2)雜交雙探針；(3) Taqman雙標記探針。廣泛使用的TaqMan 4笨針法是指PCR擴增時在加入 一對引物的同時另外加入一個特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性 地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5'端標記有熒光報告基團 (Reporter,R),如FAM、 HEX等，3'端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q )， 如TAMRA、 MGB等。當探針完整的時候，5'端報告基團經儀器光源激 發的熒光正好被近距離的3'端熒光基團淬滅，儀器檢測不到5'端報告基團 所激發的熒光信號(就是說5'端熒光基團的發射波長正好是3'端熒光基團的吸收波長，因而能量被吸收傳遞到3'端熒光基團而發出其它焚光)。隨
著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其5'—3' 外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會將 切割探針，釋放5'端報告基團游離于反應液中，遠離3'端熒光淬滅基團的 屏蔽，5'端報告基團受激發所發射的熒光信號就可以被探頭檢測到。也就 是說每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累 積與PCR產物形成完全同步。從儀器檢測出熒光值出峰的最低循環數
(cycle threshold, Ct)與檢測病原核酸量對數值呈線性負相關。根據熒 光定量PCR反應中的Ct值就能算出原始的模板量。
TaqMan- MGB探針則是近幾年才出現的新型探針，與一般Real-time PCR及TaqMan探針相比，其熒光本底低，分辨率更高，雜交穩定性及特 異性更強，敏感度更高，結果更精確，可以將探針的Tm值提高10。C左 右等優點。

發明內容
本發明是根據上述原理，設計適合含89K毒力島豬鏈球菌2型的特 異性引物和特異性探針，提供一種Taqman-MGB雙重熒光4果針PClU企測 含89K毒力島豬鏈球菌2 型的基因快速檢測試劑盒及檢測方法。
本發明采用的技術方案是
一種含89K毒力島基因豬鏈球菌2型核酸的Taqman-MGB雙重熒光 探針PCR檢測試劑盒，主要包括特異性擴增引物及特異性探針、PCR緩 沖液、脫氧三磷酸核苦混合物(dNTP)和DNA聚合酶，
所述特異性擴增引物及特異性探針為
16S rRNA上游引物序列為5，- AGCGCAGGCGGTTTGA-3，；
16 S rRNA下游引物序列為
5 ，- ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA -3';
16S rRNA特異性探針序列為
5，- FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC -MGB-3，；
89K上游引物序列為
5,-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA畫3，；
89K下游引物序列為
5，- CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA誦3';
89K特異性探針序列為
5,- HEX-CATGGGAGATATAAAGAAC陽MGB陽3，； 其中FAM、 HEX為報告熒光基團，MGB為修飾基團。 如果需要達到定量檢測的效果，所述試劑盒還可包括豬鏈球菌種特異 性16S rRNA和89K毒力島部分基因克隆質粒標準，所述豬鏈球菌種特異性 16S rRNA部分基因才示準序歹寸為5，- agcgcaggc ggtttgataagtctgaagtaaaagg ctgtgg cttaaccatagta cgctttggaaactgt -3 ，；所述89K毒力島部分基因標準序歹'J 為5，- ataa aaataccgctgtt ggatggagcatgggagatataaagaacgttgcaaaacaattcggtgt agacg -3，。以梯度濃度的標準品進行熒光4企測，Cycler threshold value ( Ct 值)與樣品中核酸模板量對數值呈線性負相關，可以通過繪制標準曲線計 算出待測樣品中SS2核酸含量。克隆質粒標準品以豬鏈球菌種特異性16S rRNA和含89K毒力島基因豬鏈球菌種DNA為模板，分別擴增16SrDNA 、 89K毒力島基因目的片段，將擴增產物克隆至pMD18-T載體上，轉化至 DH5a大腸桿菌中，挑取陽性克隆增殖后提取質粒DNA進行序列測定以鑒定插入序列，并測定質粒DNA濃度進行拷貝數的換算。
本發明關鍵在于特異性引物和熒光探針的設計，以及克隆質粒標準序 列的設計，試劑盒中的其他組分，比如DNA聚合酶、PCR緩沖液、脫氧 三磷酸核苷混合物等，均可參照本領域常規試劑盒組成。通常的，PCR 反應液通常按如下組成配制(終濃度)1 x PCR buffer、 0.3~0.5 n M的引 物、0.1 0.3 juM的熒光探針、1 5U的DNA聚合酶、0.2 0.4mM的dNTPs, 通常取2 ia L的模板，反應總體積通常為20 50 ji L。
本發明中，所述DNA聚合酶等基礎試劑為premix EX Taq DNA聚合酶 試劑，是采用探針法進行Real Time PCR的廣譜試劑。試劑中已經將DNA 聚合酶、反應用Buffer、 dNTP等試劑預混在一起，是一種2x濃度的試劑， 進行實驗時，PCR^應液的配制十分方便簡單。試劑中的DNA聚合酶使 用了改良后的HotStart法。該試劑盒中還附帶有ROX Reference Dye,可用 于需要Dye的Real Time PCR擴增儀。ROX Reference Dye II濃度為50x,添 加量為0.5pL ( PCR^應液總體積25 ju L )。
所述脫氧三磷酸核苦混合物為dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP物質的量
比l: 1: 1: l的混合物。
所述空白對照用配置反應體系的DEPC水代替模板。
本發明還涉及一種含89K毒力島基因豬鏈球菌2型核酸的Taqman -MGB雙重熒光探針PCR檢測方法，所述方法包括
(1) 提取待測樣品DNA;
(2) 取特異性擴增引物及特異性探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷 混合物和DNA聚合酶，分別加入空白對照或待測樣品DNA配成 PCFL良應液，進行PCR擴增反應，反應管置于定量熒光PCR儀進行熒光檢測；所述特異性擴增引物及特異性探針為
16S rRNA上游引物序列為
5,- AGCGCAGGCGGTTTGA陽3 ，；
16SrRNA下游引物序列為
5'畫ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA -3，；
16S rRNA特異性探針序列為
5，- FAM畫AGTCTGAAGTAAAAGGC -MGB-3，；
89K上游引物序列為
5 ，-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA -3';
89K下游引物序列為
5，- CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA-3，；
89K特異性探針序列為
5，- HEX-CATGGGAGATATAAAGAAC -MGB -3，；
其中FAM、 HEX為報告熒光基團，MGB為修飾基團； (3)選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調整取3 15個循環的熒光信
號為闊值線；若待測樣品熒光增長曲線超過閾值線，并呈良好
的對數增長，則判斷為陽性。 為達到定量檢測的效果，可同時以豬鏈球菌種特異性16S rRNA和89K 毒力島部分基因克隆質粒作為標準在與樣品DNA相同條件下進行PCR擴 增反應，以克隆質粒拷貝濃度的對數值為橫坐標、標準品Ct值為縱坐標分 別繪制標準曲線；根據樣品DNA測得的Ct值，對照相應標準曲線，獲得 樣品DNA的拷貝濃度；所述豬鏈球菌種特異性16S rRNA部分基因標準序 歹ll為5，- agcgcaggc ggtttgataagtctgaagtaaaaggctgtgg cttaaccatagta cgctt tggaaactgt -3，；所述89K毒力島部分基因標準序列為5，- ataa aaataccgctgttg gatggagcatggga gatata aagaacgttgcaaaacaattcggtgt agacg -3'。
所述PCR^良應液涉及可按照常規進行。具體的，所述PCR^應液主要 成分如下
PCR緩沖液終濃度為lxDNA聚合酶0.5-5酶活力單位/反應dNTP終濃度為0》-0.4mM
16SrDNA上游引物終站L度為0.1'
16SrDNA下游引物終沐L度為0丄 0.3jiM
16SrDNA探針終沐L度為0丄、0.3 jaM
89K上游引物終濃渡為0.3'
89K下游引物終濃度為0.3'
89K探針終沐渡為0.4'-0.6(iM
待分析樣本DNA終濃.度為10 105ng/jiL
溶劑為DEPC水。
所述PCR擴增反應條件如下:95。C變性10s,l個循環；
60。C退火20s擴增，45個循環。 優選的，所述方法如下
(1) 取待測病人的呼吸道咽拭子、血液或體液，提取待測樣品DNA;
(2) 取所述的特異性擴增引物及特異性探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸 核苦混合物和DNA聚合酶，分別加入空白對照或待測樣品DNA配成 PCR反應液，進行PCR擴增反應，反應管置于定量熒光PCR儀于60。C 進行下進行雙點焚光檢測；所述PCR^應液組成如下
premix EX Taq i式劑
終濃度為lx
16SrDNA上游引物
終濃度為0.2(iM
16SrDNA下游引物
終濃度為0.2pM
16SrDNA探針
終濃度為0.2pM
89K上游引物
終濃度為0.4pM
89K下游引物
終濃度為0.4pM
89K探針
終濃度為0.48^M
待分析樣本DNA
終濃度為10 102ng/jaL
溶劑為DEPC水；
對于部分需要Dye的Real Time PCR擴增儀。上述PCR^應液中 還需要添加ROX Reference Dye II ，添加量為0.5jiL/25 |i L反應液總體積。
所述PCR擴增反應條件如下95。C變性10s, l個循環；95。C變性 5s, 60。C退火20s擴增，45個循環； (3)選擇熒光檢測模式FAM熒光，基線調整取3 15個循環的熒光信號， 以樣品DNA的兩項Ct值均< 37并且擴增曲線呈S型為陽性判定原 則其中兩項Ct值均〈35且擴增曲線良好可直接判定為陽性，任意 一項Ct值在35 ~ 37之間則重復進行PCR擴增和焚光檢測，兩次4企測
均能得到良好S型擴增曲線則判定為陽性。 本發明有益效果主要體現在 1、早期診斷PCR可直接檢測病原體核酸，在SS2發病早期癥狀不典型 時期，就可以檢測出是否含有含89K毒力島豬鏈球菌2型特異性基因，為及早隔離、確診和治療提供方便；
2、 取樣簡單方便可取潛伏期或發病早期含89K毒力島豬鏈球菌2型患 者呼吸道咽拭子、血液、體液等標本進行4企測；
3、 與傳統的基因擴增技術相比，本發明提供的檢測方法省時省力，可在 2小時左右完成4全測；
4、 靈敏度高特異性強，由于采用了兩套特異性基因擴增和特異性基因探 針雜交結合的四重技術，診斷的靈敏度更高，特異性更強；
5、 采用計算機實時監測技術，在實驗進程中即可判斷是否含有病原基 因，且實驗結果的判斷方便準確；
6、 可實現病原核酸的定量分析，利用已知拷貝數、含有89K毒力島豬鏈 球菌2型基因重組質粒為標準品制作標準曲線，可對原始標本中的病 原含量進行定量分析。
(四)


圖1為含89K毒力島豬鏈球菌2型TaqMan-MGB雙重熒光定量PCR方 法標準品擴增曲線；
圖2為含89K毒力島豬鏈球菌2型TaqMan-MGB雙重熒光定量PCR方 法標準曲線；
圖3為TaqMan-MGB雙重熒光定量PCR對人感染含89K毒力島豬鏈球 菌2型臨床標本的檢測。
(五)
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述,但本發明的保護范圍 并不僅限于此
實施例1:利用本發明所述的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法對浙江省1份疑 似SS2病人應急樣本進行檢測，結果陽性，見圖3。 (1 )標準曲線測定
① 標準溶液獲得
以豬鏈球菌種特異性16S rRNA和含89K毒力島基因豬鏈球菌種 DNA為模板，分別擴增16SrDNA、 89K毒力島基因目的片段，將擴增 產物克隆至pMD18-T載體(Takara公司)上，轉化至DH5a大腸桿菌中， 挑取陽性克隆增殖后提取質粒DNA進行序列測定以鑒定插入序列，并測 定質粒DNA濃度進行拷貝數的換算。
取前述克隆質粒標準品101Q copies/ml,按10倍稀釋制作109 101 copies/ml梯度溶液。
② 標準曲線的繪制
PCR反應液終濃度組成如下
premix EX Taq ;式劑(2x ) ( Takara 7>司) 12.5|il,
16S rDNA上游引物 0.2^M,
16S rDNA下游引物 0.2jiM，
16SrDNA探針 0.2|iM,
89K上游引物 0.4pM，
89K下游引物 0.4pM，
89K探針 0.48(_iM,
ROX Reference Dye II 0.5^iL 克隆質粒標準梯度溶液 4pL DEPC水補足至25iiL;
16反應條件為95。C變性10s, 1個循環；95。C變性5s， 60。C退火20s 擴增，45個循環。在6(TC進行雙點熒光^r測。
標準品的擴增曲線見圖1 (圖中從左至右，擴增的基因拷貝數依次10 倍稀釋)，實心圓標示的"S"型曲線是兩個特征基因重組質粒107拷貝/ 反應時的檢測結果；實心正方形、實心三角形、實心菱形和星形的"S，， 型曲線的重組質粒濃度分別是106、 105、 104和103拷貝/反應。根據標準 品Ct值，以克隆質粒拷貝濃度的對數為X軸，CT值為Y軸，制得標準 曲線見圖2。 (2)樣本檢測
(1 )提取樣品病毒RNA;取浙江省2008年疑似SS2感染患者的血 液應急樣本用DNA提取試劑盒[Takara寶生物(大連)工程有 限7>司],^是耳又DNA;
(2)熒光PCR擴增4企測 PCR反應液終濃度組成 -
premix EX Taq酶(2x ) 12.5|il，
16SrDNA上游引物 0.2^M，
16S rDNA下游引物 0.2pM,
16SrDNA探針 0.2pM,
89K上游引物 0.4|iM,
89K下游引物 0.4pM,
89K探針 0.48(iM,
ROX Reference Dye II 0.5 |iL
血液應急樣本提取DNA (約1 OOng/ |i L ) 4pLDEPC水補足至25pL;
反應條件為95。C變性10s, 1個循環；95。C5s, 60。C退火20s擴增， 45個循環。在6(TC進行雙點熒光檢測。
(3)實時熒光PCR過程中，Cycler threshold value (Ct值)與樣品中 核酸才莫板量對數值呈線性負相關，可以通過標準曲線(圖2)計 算出樣品中SS2核S吏含量。樣品擴增曲線見圖3,熒光增長曲線 超過閾值線，并呈良好的S型增長，判斷為陽性，左邊的(Ct 值約26)"S，，型曲線是病人血液應急樣本的SS2菌16SrRNA基 因測定陽性結果；右邊的(Ct值約30) "S"型曲線為是病人血 液應急樣本的89k毒力島基因測定陽性結果。序列表—ST25. txt
SEQUENCE LISTING 〈110>浙江省疾病預防控制中心
<120〉含89K毒力島豬鏈球菌2型核酸的熒光檢測試劑盒及方法
<130>
<160> 8
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 16
<212> 醒
<213> Unknown
<220>
<223〉人工序列 <400〉 1
agcgcaggcg gtttga 16
〈210〉2
〈211〉26
〈212〉腿
<213>UnknoTO
<220>
〈223〉人工序列
<400〉2
acagtttcca aagcgtacta tggtta 26
<210〉 3
<211> 17
<212〉 DNA
<213> Unknown
<220〉
<223>人工序列
<■〉 3
agtctgaagt aaaaggc 17
<210>4
<211>24
<212〉DNA
<213>Unknown
<220>
<223〉人工序列
<400〉4
ataaaaatac cgctgttgga tgga 24
<210>5
<211>23
<212>腿
〈213〉Unknown
<220>
<223〉人工序列
<400>5
cgtctacacc gaattgtttt gca 23
<210> 6 〈211> 19 <212> DNA序列表—ST25. txt
<213> Unknown <220>
<223> 人工序列 <400〉 6
C3tgggagat ataaagaac 19
<210〉 7 <211〉 68 <212> 腿
<213> Streptococcus suis <400> 7
agcgcaggcg gtttgataag tctgaagtaa aaggctgtgg cttaaccata gtacgctttg 60 gaaactgt 68
<210> 8 <211> 69 <212〉 DNA
<213〉 Streptococcus suis <400〉 8
ataaaaatac cgctgttgga tggagcatgg gagatataaa gaacgttgca aaacaattcg 60 gtgtagacg 69
權利要求
1. 一種含89K毒力島基因豬鏈球菌2型核酸的Taqman-MGB雙重熒光探針PCR檢測試劑盒，主要包括豬鏈球菌種特異性擴增引物及特異性探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，其特征在于所述特異性擴增引物及特異性探針為16S rRNA上游引物序列為5’-AGCGCAGGCGGTTTGA-3’；16SrRNA下游引物序列為5’-ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA-3’；16S rRNA特異性探針序列為5’-FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC-MGB-3’；89K上游引物序列為5’-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA-3’；89K下游引物序列為5’-CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA-3’；89K特異性探針序列為5’-HEX-CATGGGAGATATAAAGAAC-MGB-3’；其中FAM、HEX為報告熒光基團，MGB為修飾基團。
2. 如權利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括豬鏈球菌種 特異性16S rRNA和89K毒力島基因片段標準品，所述豬鏈球菌種特異性 16S rRNA基因片賴:標準品序列為5 ，- agcgcaggc ggtttgataagtctg aagt aaaaggctgtgg cttaaccatagtacgctttggaaactgt畫3，；所述89K毒力島片l爻才示準品 序歹'J為5，國ataa aaataccgctgttggatggagcatgggagatataaagaacgttgcaaaaca att cggtgtagacg -3，。
3. 如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述脫氧三磷酸核苷混合 物為dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP物質的量比l: 1: 1: l的混合物。
4. 一種含89K毒力島基因豬鏈球菌2型核酸的Taqman-MGB雙重熒光探針 PCR4僉測方法，所述方法包括(1) ^是耳又4寺測才羊品DNA;(2) 取特異性擴增引物及特異性4笨針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷 混合物和DNA聚合酶，分別加入空白對照或待測樣品DNA配成 PCRA應液，進行PCR擴增反應，反應管置于定量熒光PCR儀進 行熒光檢測； '所述特異性擴增引物及特異性探針為16S rRNA上游引物序列為5 ，- AGCGCAGGCGGTTTGA-3 ，；16 S rRN A下游引物序列為5 ，- ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA -3';16S rRNA特異性探針序列為5，- FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC畫MGB醫3，；89K上游引物序列為5 ,畫ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA國3 ，；89K下游引物序列為5，- CGTCTACACCGAATTGTTTTGCA -3，；89K特異性探針序列為5，- HEX畫CATGGGAGATATAAAGAAC畫MGB -3，； 其中FAM、 HEX為報告焚光基團，MGB為修飾基團； (3)選擇熒光檢測模式FAM和HEX熒光，基線調整取3~ 15個循環的 熒光信號為閾值線；若待測樣品的兩條熒光增長曲線均超過閾值 線，并呈良好的對數增長，則判斷為陽性。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于所述方法同時以豬鏈球菌種特異 性16S rRNA和89K毒力島基因片段標準品在與樣品DNA相同條件下進 行PCR擴增反應，以標準品擴增產物拷貝濃度的對數值為橫坐標、標準 品Ct值為縱坐標繪制標準曲線；根據樣品DNA測得的Ct值，對照相應 標準曲線，獲得樣品DNA擴增產物的拷貝濃度；所述豬鏈球菌種特異 性16S rRNA基因才示準品序列為5，- agcgcaggc ggtttgat aagtctgaagtaaaag gctgtgg cttaaccatagtacgctttggaaactgt -3 ，；戶斤述89K毒力島才示準品序歹l]為 5， - ataa aaataccgctgttggatggagcatgggagatat aaag aacgttg caa aacaattcggtgt agacg畫3'。
6. 如權利要求4或5所述的方法，其特征在于所述PCR良應液主要成分如PCR緩沖液終濃度為DNA聚合酶0.5~5酶活力單位/反應16SrDNA上游引物終濃度為0.1 0.3jiM16SrDNA下游引物終濃度為0.1 0.3|iM16SrDNA探針終濃度為0.1~0.3(iM89K上游引物終濃度為Q.3 0.5(iM89K下游引物終濃度為0.3 0.5pM89K探針 終濃度為0.4 0.6pM脫氧三磷酸核苷混合物 終濃度為0.2 0.4mM待分析樣本DNA 終濃度為10~105ng/|aL溶劑為DEPC水。
7. 如權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述PCR擴增反應條件如下 95。C變性10s， l個循環；95。C變性5s, 60。C退火20s擴增，45個循環。
8. 如權利要求5所述的方法，其特征在于所述方法如下(1) 取待測病人的呼吸道咽拭子、血液或體液，提取待測樣品DNA;(2) 取所述的特異性擴增引物及特異性探針、PCR緩沖液、脫氧三磷 酸核苦混合物和DNA聚合酶，分別加入空白對照或4寺測樣品DNA 配成PCR^應液，進行PCR擴增反應，反應管置于定量熒光PCR 儀于60'C進行下進行雙點熒光4企測；所述PCR^應液組成如下premix EX Taq i式劑16SrDNA上游引物16SrDNA下游引物16SrDNA探針89K上游引物89K下游引物89K探針待分析樣本DNA溶劑為DEPC水；所述PCR擴增反應條件如下:終濃度為lx 終濃度為0.2(oM 終濃度為0.2|iM 終濃度為0.2pM 終濃度為0.4|iM 終濃度為0.4jiM 終濃度為0.48&M 終濃度為10 102ng/jaL95T變性10s, l個循環；95。C變性5s， 60。C退火20s擴增，45個循環； (3)選擇熒光檢測模式FAM和HEX熒光，基線調整取3 15個循環的 熒光信號，以樣品DNA的兩項Ct值均〈37并且擴增曲線呈S型為 陽性判定原則其中兩項Ct值均<35且擴增曲線良好可直接判定 為陽性，任意一項Ct值在35 ~ 37之間則重復進行PCR擴增和熒光 檢測，兩次檢測均能得到良好S型擴增曲線則判定為陽性。
全文摘要
本發明提供了一種Taqman-MGB雙重熒光探針PCR檢測含89K毒力島豬鏈球菌2型的基因快速檢測試劑盒及檢測方法。所述試劑盒的特異性擴增引物及特異性探針為16S上游引物5’-AGCGCAGGCGGTTTGA-3’；16S下游引物5’-ACAGTTTCCAAAGCGTACTATGGTTA-3’；16S特異性探針5’-FAM-AGTCTGAAGTAAAAGGC-MGB-3’；89K上游引物5’-ATAAAAATACCGCTGTTGGATGGA-3’；89K下游引物5’-CGTCTACACCGAATT GTTTTGCA-3’；89K特異性探針5’-HEX-CATGGGAGATATAAAG A AC-MGB-3’；其中FAM、HEX為報告熒光基團，MGB為修飾基團。本發明方法取樣方便簡單，檢測速度快，靈敏度高、結果準確，可用于SS2發病早期診斷。
文檔編號C12Q1/14GK101440400SQ20081016303
公開日2009年5月27日 申請日期2008年12月4日 優先權日2008年12月4日
發明者朱水榮, 王志剛 申請人:浙江省疾病預防控制中心