專利名稱：：一種微型仿生支架反應器的制作方法
技術領域：
：本發明屬于臨床醫學、生物醫學與再生醫學領域，涉及組織工程與人工器官技術，具體涉及一種微型仿生支架反應器。
背景技術：
：目前的藥效與藥理研究基于動物模型、體外原代細胞模型和永生化細胞系模型三種，動物模型存在實驗周期長、效率低，個體差異大以致結果誤差過大，且不利于動物保護等缺陷。此外種屬差異也是動物模型的致命弱點。永生化細胞系雖具有培養簡單且穩定，效率高成本低等優勢，但永生化細胞系相比原代培養細胞在結構和功能上均有較大區別，如用于體內實驗時，尚存在致瘤性的潛在危險。最近，利用原代細胞模型進行體外藥物研究正日益受到國內外學者的重視。它具有所需細胞量少，無種屬和個體差異的優點，實驗結果可重復性佳。目前常用的體外細胞模型主要有孔板、培養瓶和平皿培養等二維方式，該方法操作簡單，成本低廉，但缺乏類似體內的三維環境，難以長時間維持細胞活性與功能，無法真正模擬體內細胞的生物學功能，因而無法廣泛應用。而三維培養方法如中空纖維生物反應器，雖能長時間維持培養細胞的功能，模擬肝臟環境，但結構復雜，體積龐大，操作復雜，實驗成本較高。尤其不適于小型化的藥物代謝研究和高通量的藥物篩選。同時實驗室研究細胞培養條件和合成細胞代謝產物，需要一種小型化和價廉、適合進行實驗室條件優化和篩選的裝置。這些要求對于工業化生產用的大型中空纖維反應器顯然無法滿足。為此，操作簡單、成本低廉且易于放大的實驗室細胞培養方法已成為當前細胞模型研究的重點，對臨床細胞治療的前期研究也具有十分重要的意義。
發明內容為克服現有藥物研究與細胞治療模型的不足，本發明設計了一個全新的模擬人體肝臟結構的微型仿生支架反應器。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是本發明的一種微型仿生支架反應器，包括傳氧硅膠封套，l片以上的三維多孔支架，傳氧硅膠封口；三維多孔支架裝在聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套中，傳氧硅膠封套兩端用傳氧硅膠管封口。所說的微型仿生支架反應器的直徑為5-20mm,長度為10-50mm。所說的傳氧硅膠管封口直徑為l-4mm。所說的三維多孔支架材料是其分子量為5—10萬單位的聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)、左旋聚乳酸(PLLA)或藻酸鹽。所說的三維多孔支架為2_10片。所說的三維多孔支架片直徑為4一19mm。所說的三維多孔支架片厚度徑為l一4mm。所說的三維多孔支架的孔徑為50—500nm。所說的三維多孔支架設有特定管腔1-10個，孔徑為200-500nm。所說的特定管腔為孔徑200-500nm的圓形管腔，該管腔是在三維支架中激光打孔而成，無其它材料，主要用于提供內皮細胞生長和誘導微血管生成。本發明的優點本發明的支架極大地簡化了常用生物反應器的結構與操作。以最大限度模擬了培養細胞的體內微環境。明顯促進培養細胞的生長與代謝，維持培養細胞的長期生物學功能。可廣泛應用于各種細胞培養尤其是原代細胞，同時非常適用于進行藥物代謝和篩選研究。圖1為本發明的實施例的結構示意圖。圖2為本發明的實施例1的兩組細胞的生長曲線圖。圖3為本發明的實施例1的白蛋白(ALB)的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)結果圖。圖4為本發明的實施例l的尿素(Urea)的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)結果圖。圖5本發明的實施例2的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測白蛋白(ALB)的結果圖。圖6本發明的實施例2的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測尿素的結果圖。具體實施例方式以下通過實施例進一步對本發明進行描述如附圖l所示，本發明包括包括傳氧硅膠封套l，l片以上的三維多孔支架2，傳氧硅膠管封口3;三維多孔支架2裝在傳氧硅膠封套1中，傳氧硅膠封套1兩端用傳氧硅膠管封口3。具體實施例1(微型仿生支架反應器和單層貼壁法培養大鼠肝細胞的比較)傳氧硅膠封套1長15mm，三維多孔支架2材料為PLGA，PLGA分子量為7萬單位。多孔支架2直徑9mm,厚度為3mm,孔徑為100—200nm，設有特定管腔6—8個，孔徑為400nm，4片多孔支架2組疊而成。傳氧硅膠管封口3直徑為2mm。特定管腔是在三維支架中激光打孔而成，無其它材料，主要用于提供內皮細胞生長和誘導微血管生成。將常規分離得到的活性高于90%到的大鼠原代肝細胞以107CellS/ml密度接種至含15%FBS的DMEM(購自Irwitrogen公司)的培養基中，用注射器將細胞注入PLGA三維多孔支架中，每片支架的細胞量為106cellS，在常溫下以1000g的離心力離心5分鐘，使細胞均勻分散至支架。在37。C、5%C02條件下培養過夜使細胞粘附于多孔支架，然后在無菌條件下將含有細胞的4片多孔支架層層疊起，裝入傳氧硅膠封套后，在37°"5%C02條件下繼續培養。每間隔2—3天置換新鮮培養基，共分化培養2周。將同批分離的大鼠肝細胞以106cellS/ml接種至培養瓶進行單層貼壁培養，每瓶細胞量為10Vells，培養條件與上述相同。各重復3組，每隔2天分別收集微型仿生支架反應器內和單層貼壁培養的細胞、細胞支架復合體及培養液上清，檢測肝細胞代謝功能和分析生長曲線。結果如下圖2-4:圖2表示了兩組細胞的生長曲線結果結果顯示，人工肝臟組大鼠原代肝細胞成活時間達60天，而對照組僅存活28天。圖3表示白蛋白(ALB)的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)結果結果顯示人工肝臟組分泌的白蛋白明顯高于對照組。圖4表示尿素(Urea)的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)結果結果顯示人工肝臟組合成的尿素明顯高于對照組。由圖2—4表明，相比普通單層貼壁培養法，利用微型仿生支架反應器進行肝細胞培養可明顯延長原代肝細胞的體外培養時間，培養肝細胞的代謝功能也明顯高于對照組。說明了本發明所具有的明顯優勢。具體實施例2(微型仿生支架反應器和單層貼壁法分化大鼠骨髓間質干細胞(BMSCs)至肝細胞的比較)傳氧硅膠封套1長15mm，三維多孔支架2材料為PLGA，PLGA分子量為7萬單位。多孔支架2直徑9mm，厚度為3mm，孔徑為100—200nm，設有特定管腔6—8個，孔徑為400mn，4片多孔支架2組疊而成。傳氧硅膠管封口3直徑為2mm。將實驗室常規分離到活性高于90%的大鼠BMSCs按107cellS/ml密度接種至含肝細胞生長因子的IMDM(購自Irwitrogen公司)培養基中，用注射器將細胞注入PLGA三維多孔支架中，每片支架的細胞量為106cellS，在常溫下以1000g的離心力離心5分鐘，使細胞均勻分散至支架。在37。C、5。/。C02條件下培養過夜使細胞粘附于多孔支架，然后在無菌條件下將含有細胞的4片多孔支架層層疊起，裝入傳氧硅膠封套后，在37。C、5%C02條件下繼續培養。每間隔一天置換新鮮培養基，共分化培養3周。將同批分離的BMSCs以106cells/ml接種至培養瓶進行單層貼壁培養，每瓶細胞量為106cells，培養條件與上述相同。各重復3組，每隔一周分別收集人工肝臟內和單層貼壁培養的細胞、細胞支架復合體及培養液上清，檢測肝細胞的特異性功能基因及表達產物，比較兩組分化成肝細胞的時間與分化肝細胞的功能。結果如下圖5-6:圖6圖5表示了酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的結果結果顯示微型仿生支架反應器組在一周后即檢測到ALB和尿素，而對照組在第二周檢測到，且微型仿生支架反應器組明顯高于對照。由圖6表明，相比普通單層貼壁分化培養法，利用微型仿生支架反應器進行肝細胞分化可明顯縮短分化時間，分化肝細胞的代謝功能明顯比前者強。說明了本發明所具有的明顯優勢。具體實施例3(微型仿生支架反應器用于藥物代謝的研究)傳氧硅膠材料封套1長15mm，三維多孔支架2材料為PLGA，PLGA分子量為7萬單位。多孔支架2直徑9mm,厚度為3mm,孔徑為100—200nm，設有特定管腔6—8個，孔徑為400nm，4片多孔支架2組疊而成。傳氧硅膠管封口3直徑為2mm。將常規實驗室分離到活性高于90%的大鼠肝細胞按10^dls/ml密度接種至含15。/。FBS的DMEM(購自Irwitrogen公司)的培養基中，利用注射器注射至微型仿生支架反應器內的PLGA三維多孔支架中，每片支架的細胞量為106cellS，在常溫下以1000g的離心力離心5分鐘，使細胞均勻分散至支架。在37°C、5%(:02條件下培養過夜使細胞粘附于多孔支架，然后在無菌條件下將含有細胞的4片多孔支架層層疊起，裝入傳氧硅膠封套后，在37。C、5%C02條件下培養。將同批分離的大鼠肝細胞以106Cells/ml接種至培養瓶進行單層貼壁培養，每瓶細胞量為106Cells，培養條件與上述相同。各重復3組，培養48小時后，各組加入5pg/ml的安定溶液，收集加入安定后0分鐘(即加入安定藥液后立即收集)與經過2小時的藥物代謝的細胞培養上清，用HPLC法測細胞培養上清中安定的含量，結果如表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表1結果表明，微型仿生支架反應器組代謝安定的能力明顯強于單層貼壁培養組，說明肝細胞在微型彷生支架內的生物學功能明顯生長環境明顯好于常規單層貼壁培養法。說明了本發明比常規貼壁培養法更適用于藥物代謝研究。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。權利要求1、一種微型仿生支架反應器，其特征在于包括傳氧硅膠封套，1片以上的三維多孔支架，傳氧硅膠封口；三維多孔支架裝在聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套中，傳氧硅膠封套兩端用傳氧硅膠管封口。2、根據權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于微型仿生支架反應器的直徑為5-20mm,長度為10-50mm。3、根據權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的傳氧硅膠管封口直徑為l-4mm。4、根據權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的三維多孔支架的材料為其分子量為5—10萬單位的聚乳酸/乙醇酸共聚物、左旋聚乳酸或藻酸鹽。5、根據權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的三維多孔支架為2—10片。6、根據權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的三維多孔支架片直徑為4一19mm，厚度徑為l一4mm，孔徑為50—500nm。7、根據權利要求1所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的三維多孔支架設有特定管腔1-10個，孔徑為200-500nm。8、根據權利要求7所述的一種微型仿生支架反應器，其特征在于所說的特定管腔為孔徑200-500nm的圓形管腔，該管腔是在三維支架中激光打孔而成。全文摘要本發明公開了一種微型仿生支架反應器，包括傳氧硅膠封套，1片以上的三維多孔支架，傳氧硅膠封口；三維多孔支架裝在聚乙醇酸或聚乳酸羥基乙酸封套中，傳氧硅膠封套兩端用傳氧硅膠管封口。本發明的有益之處在于本發明的支架極大地簡化了常用生物反應器的結構與操作。以最大限度模擬了培養細胞的體內微環境。明顯促進培養細胞的生長與代謝，維持培養細胞的長期生物學功能。可廣泛應用于各種細胞培養尤其是原代細胞，同時非常適用于進行藥物代謝和篩選研究。文檔編號C12M3/00GK101423798SQ20081016261公開日2009年5月6日申請日期2008年12月4日優先權日2008年12月4日發明者君李,李蘭娟申請人:浙江大學