專利名稱：：發酵制備l-氨基酸的方法
技術領域：
：本發明涉及L-氨基酸
技術領域：
，尤其涉及一種發酵制備L-氨基酸的方法。
背景技術：
：L-氨基酸廣泛應用于飼料工業、保健食品和醫藥工業。自1956年日本協和發酵公司用發酵法生產谷氨酸以后，氨基酸的發酵生產發展很快，到目前為止，絕大多數氨基酸已能用發酵法和酶法生產。近年來，隨著經濟的發展，人民生活水平的逐步提高，人們對健康方面給于越來越多的關注，L-氨基酸的需求量也在逐年上升。但是大多數L-氨基酸的發酵產酸水平較低，生產成本較高，抑制了L-氨基酸的應用。因此，提高L-氨基酸的產酸率具有非常重要的現實意義。中國專利CN101235401公開了一種發酵制備L-氨基酸的方法，為了提高收率和降低成本，它以甜菜堿磷酸鹽為發酵助劑，取得了較好的效果。但是，以甜菜堿磷酸鹽為發酵助劑，由此制得的L-氨基酸中必然含有磷的成分，在安全性要求較高的保健食品和醫藥行業，往往不能直接應用。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種發酵制備L-氨基酸的方法，以提高L-氨基酸的收率并降低生產成本，由此制得的L-氨基酸，可直接應用在安全性要求較高的保健食品和醫藥行業。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是發酵制備L-氨基酸的方法，包括用于培養種子培養基的步驟，用于將發酵菌接種于所述種子培養基得到種子的步驟，用于培養發酵培養基的步驟，用于將所述種子接入所述培養發酵培養基進行發酵的發酵步驟，在所述發酵培養基的培養步驟中或在所述的發酵步驟中用鹽酸甜菜堿、無水甜菜堿或一水甜菜堿作為發酵助劑。其中，所述發酵助劑在發酵液中的濃度為0.05~2.5g/dl。由于在所述發酵培養基的培養步驟中或在所述的發酵步驟中用鹽酸甜菜3堿、無水甜菜堿或一水甜菜堿作為發酵助劑，明顯提高了L-氨基酸的收率，降低了生產成本，而且鹽酸甜菜堿、無7jC甜菜堿或一水甜菜堿都不含有磷成分，因而由其生產的L-氨基酸可直接應用在安全性要求較高的保健食品和醫藥行業。具體實施例方式在未特別注明的情況下，以下實施例培養基中各組分含量的單位均為g/dl，g/dl是發酵行業中慣用的單位，dl表示分升,ldl=100ml。種子培養基葡萄糖3，玉米漿3,豆濃2,K2HP040.15,MgS04'7H200.04，尿素0.2,pH調至7.0-7.2,在115。C下，加熱15分鐘進行滅菌。將黃色短桿菌ATCC14067接種于5L種子罐中，在32。C下，振蕩培養9小時。谷氨酸發酵培養基葡萄糖14，糖蜜0.1,Na2HPO40.16,KC10.12,MgS047H200.08，FeS04*4H200.0002，MnS040.0002，維生素20mug/l。取上述培養基6份，每份3L，在6份培養基的發酵液中分別添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的鹽酸甜菜堿，調整pH至7.0。將每一份3L培養基放入一個5升的發酵罐中，在115。C下，加熱15分鐘進行滅菌。其中，鹽酸甜菜堿的結構式分子式C5H14N02C1;分子量153.61;物理性能白色至微黃色結晶性粉末，無氣味，味酸澀，具吸潮性，極易在每個發酵罐中接入300ml按上述培養得到的種子，通氣培養，溫度為34°C。在培養過程中，采用氨水調節培養基的pH,使其維持在7.2,同時，持續實施例1:溶于水。補加重量百分比濃度70%的葡萄糖水溶液，使糖濃度控制在1-2g/dl(按葡萄糖計算)。發酵培養30小時后，停止加入葡萄糖，再過2小時后，發酵完畢。測定培養基中積累的谷氨酸含量，結果見表1。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例2:種子培養基葡萄糖3，玉米漿3，豆濃2，K2HP040.15，MgS04'7H200.04，尿素0.2，pH調至7.0-7.2，在115。C下，加熱15分鐘進行滅菌。將黃色短桿菌ATCC14067接種于5L種子罐中，在32。C下，振蕩培養9小時。L-谷氨酸發酵培養基:葡萄糖14，糖蜜0.1,Na2HP040.16，KC10.10,MgS04'7H200.08,FeS04'4H200.0002，MnS040.0002，維生素20mug/1,調整pH至7.0。取上述培養基5份，每份3L,將每一份3L培養基放入一個5升的發酵罐中，在115。C下，加熱15分鐘進行滅菌。在每個發酵罐中接入300ml按上述培養得到的種子，通氣培養，溫度為34。C。在培養過程中，采用氨水調節培養基的pH,使其維持在7.2,同時，持續補加重量百分比濃度70%的葡萄糖水溶液，使糖濃度控制在1-2g/dl(按葡萄糖計算)。分別在發酵培養的0、3、8、14和18小時，按照0.15g/dl的比例添加鹽酸甜菜堿，培養30小時后，停止加入葡萄糖，再過2小時后，發酵完畢。5測定培養基中積累的谷氨酸含量，結果見表2。表2.<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例3:種子培養基葡萄糖2.5，(NH4)2S040.5,KH2PO40.1,MgS04'7H200.05，玉米漿3.5-4.0,CaC031.0，pH調至7.0-7.2,0.IMpa壓力下滅菌20分鐘。將黃色短桿菌ATCC14067接種于5L種子罐中，在31。C下，振蕩培養12h。L-賴氨酸的發酵培養基葡萄糖18,(NH4)2SO450，KH2P040.1，KC10.12，MgS04*7H200.5，玉米漿0.5-1.5,L-蘇氨酸0.4,CaC034.0。取上述培養基6份，每份3.6L,在6份培養基的發酵液中分別添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的鹽酸甜菜堿，調整pH至7.0-7.2，將每一份3.6L培養基放入一個7升的發酵罐中，0.07Mpa壓力下滅菌8分鐘。在每個發酵罐中接入360ml按上述培養得到的種子，通氣培養，溫度為30€。在培養過程中，采用氨水調節培養基的pH，使其維持在6.7,同時，持續補加70%的葡萄糖水溶液，使糖濃度控制在3-4g/dl(按葡萄糖計算)。發酵培養72小時，L-賴氨酸的產量見表3。表3.<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4:種子培養基葡萄糖2.5，(NH4)2S040.2,尿素0.2，KH2P040.15,MgS047H200.04,FeS(WH200.001,MnS04'4H200.001，維生素lOOmug/l，生物素30(kug/l,調整pH至7.0，滅菌。將黃色短桿菌FERM-P4164接種于5L種子罐中培養12小時。L-蘇氨酸的發酵培養基:葡萄糖8，KH2P040.25,MgS04'7H200.04,(NH4)2S042.0，MnS04'4H200.001，FeS04'4H200.001，生物素50mug/l，維生素B,5mug/l。取上述培養基6份，在6份培養基的發酵液中分別添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的鹽酸甜菜堿，調整pH至7.0。在114。C下，蒸汽滅菌15分鐘。按1。/。的接種量將上述培養好的種子液分別接入一個10L發酵罐中，發酵培養36小時，L-蘇氨酸的產量見表4。表4鹽酸甜菜堿的添加量(g/dl)L-蘇氨酸的量(g/dl)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例5:種子培養基葡萄糖2.5，(NH4)2S040.5，玉米漿3，KH2P040.1，MgSO7H200.05，CaC031，調整pH至7.0，滅菌。將谷氨酸4奉桿菌FERM-P7274接種于5L種子罐中，在3(TC下培養24小時。L-精氨酸的發酵培養基:葡萄糖12.5，(NH4)2S043.0,KH2P040.15,MgS047H200.05,玉米漿1，CaC033.0。取上述培養基6份，在6份培養基的發酵液中分別添加O.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的鹽酸甜菜堿，調整pH至7.0，在114。C下，蒸汽滅菌15分鐘。按10°/的接種量將上述培養好的種子液分別接入一個IOL發酵罐中，發酵培養96小時，L-精氨酸的產量見表5。表5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>實施例6:種子培養基蔗糖3.0，KH具O.15，MgS(WH200.04,FeS04'7H200.001，MnS04*4H200.OOl,醋酸銨0.3,尿素0.2，豆餅水解液0.2，VH0.2mg，VB,0.3mg,調整pH至7.0，在每個500ml的三角瓶中裝入55ml培養基，0.075Mpa壓力下滅菌20分鐘。將黃色短桿菌FERM-P3672接種于三角瓶中，在31。C下振蕩培養45小時。L-異亮氨酸的發酵培養基:葡萄糖14.5,(NH4)2S042.5,KH2P040.22,K2HP040.1,MgS04*7H200.04，FeS04*7H200.0015,MnS04'4H200.0015,豆餅水解液0.2，VH0.01mg/dl，VB!0.25mg/dl，Met3mg/dl。取上述培養基6份，在6份培養基的發酵液中分別添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的鹽酸甜菜堿，調整pH至7.1,在0.075Mpa壓力下，蒸汽滅菌20分鐘。按10%的接種量將上述培養好的種子液分別接入一個5L發酵罐中，發酵培養80小時，L-異亮氨酸的產量見表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例7:種子培養基葡萄糖3.0,玉米漿3,酵母粉0.5,KH2PO40.1,MgS04*7H200.04，MnS04*4H200.001,VHO.01mg/dl，VB!0.02mg/dl,調整pH至7.0，在每個500ml的三角瓶中裝入30ml培養基，0.IMpa壓力下滅菌15分鐘。將黃色短桿菌FERM-P512接種于三角瓶中，在32。C下振蕩培養16小時。L-纈氨酸的發酵培養基:葡萄糖8，(NH4)2S040.6,KH2PO40.12,MgS04'7H200.O4,MnS04*4H200.001，蛋氨酸0.05,豆餅水解液2,玉米漿2.5,VH0.Olmg/dl,VB,0.02mg/dl。取上述培養基6份，在6份培養基的發酵液中分別添加O.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的鹽酸甜菜堿，調整pH至7.0，在0.075Mpa壓力下，蒸汽滅菌15分鐘。按10%的接種量將上述培養好的種子液分別接入一個IOL發酵罐中，發酵培養72h,L-纈氨酸的產量見表7。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例8:種子培養基葡萄糖3.0,(NH4)2S040.5，玉米漿4.0,豆餅水解液2.0,KH2P040.l,MgS04'7H200.04,FeS04,7H200.001,MnS04MH200.001,VH0.02mg/dl,VB!0.03mg/dl,調整pH至7.0,0.075Mpa壓力下滅菌15分鐘。將谷氨酸棒桿菌FERM-P7128接種于500ml三角瓶中，在32。C下振蕩培養16小時。L-色氨酸的發酵培養基:葡萄糖13，(NH4)2S044，KH2P040.1,MgS(WH200.04，MnS04MH200.001，FeS04'7H200.001,豆餅水解液2.5,玉米漿2.2，VH0.005mg/dl,VB!0.01mg/dl。取上述培養基6份，在6份培養基的發酵液中分別添加O.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的鹽酸甜菜堿，調整pH至7.0,在0.075Mpa壓力下，蒸汽滅菌15分鐘。按10%的接種量將上述培養好的種子液分別接入一個5L發酵罐中，發酵培養，L-色氨酸的產量見表8。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>0.31.20實施例9:種子培養基葡萄糖3,玉米漿3,豆濃2,K2HP040.15，MgS04*7H200.04，尿素0.2,pH調至7.0-7.2，在115。C下，加熱15分鐘進行滅菌。將黃色短桿菌ATCC14067接種于5L種子罐中，在32。C下，振蕩培養9小時。另外，谷氨酸發酵培養基葡萄糖14，糖蜜0.1,Na2HP040.16，KC10.12,MgS04*7H200.08,FeS04*4H200.0002,MnS040.0002，維生素20mug/l。取上述培養基6份，每份3L，在6份培養基的發酵液中分別添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的無水甜菜堿，調整pH至7.0,分別將一份3L培養基放入一個5升的發酵罐，在115。C下，加熱15分鐘進行滅菌。其中，無水甜菜堿的結構式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>分子式C5HN02;分子量117.05;物理性能白色結晶性粉末，無氣味，味甜，具吸潮性，極易溶于水。在每個發酵罐中接入300ml按上述培養得到的種子，通氣培養，溫度為34°C。在培養過程中，采用氨水調節培養基的pH，使其維持在7.2,同時，持續補加重量百分比濃度70%的葡萄糖水溶液，使糖濃度控制在l-2g/dl(按葡萄糖計算)。發酵培養30小時后，停止加入葡萄糖，再過2小時后，發酵完畢。測定培養基中積累的谷氨酸含量，結果見表9。表9.<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>0.113.40.1512.70.212.50.2511.70.311.2實施例10:種子培養基葡萄糖3，玉米漿3，豆濃2，K2HP040.15，MgS04'7H200.04，尿素0.2,pH調至7.0-7.2,在115。C下，加熱15分鐘進行滅菌。將黃色短桿菌ATCC14067接種于5L種子罐中，在32。C下，振蕩培養9小時。另外，谷氨酸發酵培養基葡萄糖14，糖蜜0.1,Na2,40.16,KC10.12,MgS04'7H200.08,FeS04MH200.0002,MnS040.0002，維生素B,20mug/l。取上述培養基6份，每份3L,在6份培養基的發酵液中分別添加0.05、0.1、0.15、0.2、0.25和0.3的一水甜菜堿，調整pH至7.0,分別將一份3L培養基放入一個5升的發酵罐，在115。C下，加熱15分鐘進行滅菌。其中，一7jc甜菜堿的結構式o分子式C5H13N03;分子量135.16;物理性能白色至微黃色結晶性粉末，無氣味，味甜，具吸潮性，極易溶于水。在每個發酵罐中接入300ml按上述培養得到的種子，通氣培養，溫度為34°C。在培養過程中，采用氨水調節培養基的pH，使其維持在7.2,同時，持續補加重量百分比濃度70%的葡萄糖水溶液，使糖濃度控制在1-2g/dl(按葡萄糖計算)。發酵培養30小時后，停止加入葡萄糖，再過2小時后，發酵完畢。測定培養基中積累的谷氨酸含量，結果見表io。表10.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>本發明不局限于上述實施例，根據底物的不同，發酵條件也有所改變。發酵溫度控制在20-4(TC的范圍之內，優選28-40。C。pH值控制在7.0-7.2。發酵在有氧條件下進行，需要攪拌或振蕩。發酵時間l-7天。對于氨基酸的分離純化，可釆用離子交換方法。本發明適用的L-氨基酸包括L-谷氨酸，L-賴氨酸，L-精氨酸，L-異亮氨酸，L-纈氨酸，L-蘇氨酸，L-組氨酸，L-苯基丙氨酸，L-色氨酸，L-絲氨酸，L-鳥氨酸，L-瓜氨酸，L-酪氨酸和L-亮氨酸。本發明適用的碳源包括糖類如葡萄糖，蔗糖，果糖，麥芽糖，糖蜜，粗糖，糖化的淀粉液；脂肪酸類如乙酸，丙酸，苯曱酸；有機酸類如丙酮酸，檸檬酸，琥珀酸，富馬酸，蘋果酸；醇類如乙醇，丁醇。本發明適用的氮源包括有機氮源如豆濃，玉米漿，尿素，酵母粉，豆餅水解液；無機氮源如疏酸銨，氯化銨，硝酸銨，醋酸銨，液氨，氨水。本發明的發酵培養基可以使用以下各種無機鹽磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鉀鹽、鈉鹽、鐵鹽、錳鹽以及其他微量金屬鹽。本發明的發酵培養基可以使用以下各種維生素生物素、硫胺素、煙酰胺等。本發明適用于以下各種相應氨基酸的發酵菌L-谷氨酸發酵菌如雙歧桿菌ATCC14020，黃色短桿菌ATCC14067,乳酸發酵短桿菌ATCC13869,乳酸發酵短桿菌FERM-P5012,嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870,谷氨酸棒桿菌ATCC13032等；L-賴氨酸發酵菌如黃色短桿菌ATCC14067，黃色短桿菌FERM-P1708,谷氨酸棒桿菌FERM-P1709，乳酸發酵短桿菌FERM-P1712,乳酸發酵短桿菌FERM-P1711，黃色短桿菌ATCC21475，谷氨酸棒桿菌ATCC12416,乳酸發酵短桿菌ATCC1470,醋麩酸棒狀桿菌ATCC11472等；L-谷氨酸鹽發酵菌如黃色短桿菌FERM-P4272，嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870，黃色短桿菌FERM-BP662，醋麩酸棒狀桿菌ATCC13870,谷氨酸棒桿菌FERM-BP663等；L-精氨酸發酵菌如黃色短桿菌FERM-P4948,谷氨酸棒桿菌FERM-P7274,黃色短桿菌NRRL12235，醋麩酸棒狀桿菌NRRL12239等；L-苯基丙氨酸發酵菌如乳酸發酵短桿菌FERM-P5417，黃色短桿菌FERM-P1916,谷氨酸棒桿菌ATCC21670，檸檬酸節桿菌ATCC21422，乳酸發酵短桿菌ATCC21420,嗜乙酰乙酸才奉桿菌ATCC21421,黃色短4干菌NRRL12269;L-蘇氨酸發酵菌如大腸埃希氏菌FERM-P4900，谷氨酸棒桿菌FERM-P5835,黃色短桿菌FERM-P4164,乳酸發酵短桿菌FERM-P4180，黃色短桿菌ATCC21269,嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC21270等；L-異亮氨酸發酵菌如黃色短桿菌FERM-P3672,乳酸發酵短桿菌FERM-P4192,谷氨酸棒桿菌FERM-P756，谷氨酸棒桿菌FERM-P757,谷氨酸棒桿菌FERM-P758，黃色短桿菌FERM-BP759,黃色短桿菌FERM-BP760等；L-組氨酸發酵菌如黃色短桿菌FERM-P2317,乳貌t酵短桿菌FERM-P1565,谷氨酸棒桿菌ATCC14297,乳酸發酵短桿菌ATCC21086，嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC21407,黃色短桿菌ATCC21406，枯草芽孢桿菌FERM-BP217，檸檬酸節桿菌ATCC21412等；L-纈氨脧發酵菌如乳^酵短桿菌FERM-P1845,黃色短桿菌FERM-P512，乳酸發酵短桿菌FERM-P1968,大腸桿菌NRRL12285等；L-絲氨酸發酵菌如乳酸發酵短桿菌FERM-P1371;L-鳥氨酸發酵菌如乳酸發酵短桿菌FERM-P5936，谷氨酸棒桿菌FERM-P5644，檸檬酸節桿菌ATCC21040，谷氨酸棒桿菌ATCC13232等;L-瓜氨酸發酵菌如谷氨酸才奉桿菌FERM-P5643，黃色短桿菌FERM-P1645等；L-酪氨酸發酵菌如谷氨酸棒桿菌FERM-P5836,黃色短桿菌FERM-P7914，枯草芽孢桿菌FERM-P6758等；L-色氨酸發酵菌如枯草芽孢桿菌FERM-P5286，乳酸發酵短桿菌FERM-P7127,黃色短桿菌FERM-P2551,谷氨酸棒桿菌FERM-P7128,黃色短桿菌ATCC2"27,黃色短桿菌FERM-BP114，枯草芽孢桿菌FERM-BP208，黃色短桿菌FERM-BP475，谷氨酸棒桿菌，枯草芽孢桿菌FERM-BP200等；L-亮氨H酵菌如乳酸發酵短桿菌FERM-P1769，黃色短桿菌FERM-P420,谷氨酸棒桿菌FERM-P1966，黃色短桿菌FERM-BP755，谷氨酸棒桿菌FERM-BP756,谷氨酸棒桿菌FERM-P757,黃色短桿菌FERM-BP759等。權利要求1.發酵制備L-氨基酸的方法，包括用于培養種子培養基的步驟，用于將發酵菌接種于所述種子培養基得到種子的步驟，用于培養發酵培養基的步驟，用于將所述種子接入所述培養發酵培養基進行發酵的發酵步驟，其特征在于在所述發酵培養基的培養步驟中或在所述的發酵步驟中用鹽酸甜菜堿、無水甜菜堿或一水甜菜堿作為發酵助劑。2、根據權利要求l所述的發酵制備L-氨基酸的方法，其特征在于所述發酵助劑在發酵液中的濃度為0.05~2.5g/dl。全文摘要本發明公開了一種發酵制備L-氨基酸的方法，包括用于培養種子培養基的步驟，用于將發酵菌接種于所述種子培養基得到種子的步驟，用于培養發酵培養基的步驟，用于將所述種子接入所述培養發酵培養基進行發酵的發酵步驟，在所述發酵培養基的培養步驟中或在所述的發酵步驟中用鹽酸甜菜堿、無水甜菜堿或一水甜菜堿作為發酵助劑。本發明可明顯提高L-氨基酸的收率，降低生產成本，由其生產的L-氨基酸可直接應用在安全性要求較高的保健食品和醫藥行業。文檔編號C12P13/04GK101423851SQ20081016001公開日2009年5月6日申請日期2008年11月7日優先權日2008年11月7日發明者劉世普,吳品芳,馬興群申請人:濰坊祥維斯化學品有限公司