專利名稱：產霍亂毒素霍亂弧菌環介導等溫擴增快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種利用環介導等溫擴增(LAMP)技術進行菌樣的快速檢測的方法， 具體是一種產霍亂毒素霍亂弧菌環介導等溫擴增快速檢測方法。
背景技術：
霍亂弧菌(Vibrio cholerae)屬于弧菌科、革蘭氏陰性菌，菌體細小呈現彎曲 狀，是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病，曾在世界 上引起多次大流行，主要表現為劇烈的嘔吐、腹瀉、失水，死亡率甚高。根據菌 體(0)抗原的不同，霍亂弧菌可分出200個以上的0血清群(0 serogroups),但 僅發現01和0139群霍亂弧菌能引發霍亂。1992年以前，僅01群霍亂弧菌 (V.cholerae 01)的兩個生物型，即古典生物型(Classical biotype)和埃爾 托生物型(El Tor biotype)引發了七次霍亂世界大流行，而對01群以外的其他 血清群，統稱為非01群霍亂弧菌(V.cholerae non-01),這些弧菌廣泛分布于自 然界水體中， 一般不致病或僅引起散發性腹瀉病例和腸道外感染。1992年10月以 后，印度首次發生了由非01群霍亂弧菌引起的霍亂大暴發，其病原被鑒定為0139 血清群霍亂弧菌(V.cholerae 0139)，這個新確認的0139血清群與其他非01群霍 亂弧菌的最大不同點，是它能產生與01群霍亂弧菌相同的霍亂毒素(Cholera toxin, CT)，所引起的霍亂在臨床和流行病學上也與01群霍亂弧菌所致霍亂基本相 同。因此，世界衛生組織確認霍亂應包括古典霍亂、埃爾托霍亂和0139霍亂，并 同樣按《國際衛生條例》中有關霍亂的規定報告和處理。霍亂弧菌主要通過水、 食物、日常生活接觸和蒼蠅等不同途徑傳播或蔓延，其中水作用最為突出。霍亂 弧菌經口進入人體后，在小腸定位繁殖，并產生毒素，由于毒素作用于機體而產 生一系列反應，導致霍亂癥狀的發生。
現有霍亂弧菌的檢測方法主要有常規分離鑒定法、普通PCR檢測法、熒光定量 PCR檢測法、膠體金免疫層析試驗法等，常規方法耗時長，膠體金免疫層析試驗法 靈敏度較差，PCR雖可彌補上述不足，但它的成本又較高。環介導等溫擴增方法特 異性好、靈敏度高，可以進行快速檢測，目前尚未見用環介導等溫擴增方法檢測 霍亂弧菌的報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種產霍亂毒素霍亂弧菌環介導等溫擴增快速檢測方法， 以克服現有技術的不足，從而為食品安全提供科學的依據和指導作用。
本發明的主要原理為(1)特殊設計一組可以識別靶DNA六個不同序列的兩個
內引物(上游內引物和下游內引物)和兩個外引物(上游外引物和下游外引物)，
內引物包含靶DNA的正義鏈和反義鏈；(2)其中一個內引物首先和靶DNA雜交，隨 后的鏈置換DNA合成在具有高度鏈置換活性的DNA聚合酶的參與下由一個外引物啟 動，釋放出單鏈DNA，并作為由雜交到靶的另一端的一個內引物和一個外引物啟動 的DNA合成模板，產生一個原始的莖環DNA; (3)內引物以原始莖環DNA做模板，啟 動鏈置換DNA的合成，產生一個原始的莖環DNA和一個新的由兩倍莖長度的莖環 DNA; (4)在等溫條件下，內引物以莖環DNA為模板，通過鏈置換形成多個含有靶 DNA重復序列的莖環DNA，在一小時內該循環反應可使靶DNA累積到109拷貝，可通過 熒光染料來觀察擴增結果。
本發明涉及的產霍亂毒素霍亂弧菌環介導等溫擴增快速檢測方法，其中包括的 試劑如下(1) - (4):
(1)環介導等溫擴增(LAMP)反應液 其中包括10XThermopol反應緩沖液、1.0 — 1.4 mmol/L dNTP、 4—8mmol/L 硫酸鎂(MgS04)、 0. 8—1.6nmol/L上游引內物(FIP)、 0. 8 —1. 6)jmol/L下游內引 物(BIP)、 0.2—0. 3iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0, 3ymol/L下游外引物(B3) 和l一1.5mol/L甜菜堿； 上游內引物
5- TGAATCCACGGCTCTTCCCT-TGGTTATGGATTGGCAGG -3、
下游內引物
5-GGTTGTGGGAATGCTCCAAG-ACTTTGGGTTTTTTCATCGC -3 、 上游外引物5-GATATTGCTCCAGCAGCA-3 、 下游外引物5-CGTCAAGGAATTTTACACCTAG-3 、
其中混合物dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP =2:1:1:1。
其中所述的10XThermopol反應緩沖液中含有200 mmol pH8.8的三羥基甲基氨 基甲垸一鹽酸(Tris—HC1)、 100mmol/L氯化鉀(KC1)、 100 mmol/L硫酸銨((NH4) 2S04)、 20咖ol/L硫酸鎂(MgS04)和1^曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) UNG酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8 U /|jL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述環介導等溫擴增(LAMP)反應液每管共有22pL，其最佳組成為2. 5pL
10XThermopol反應緩沖液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP (四種脫氧核糖核酸的混合物)、
4.0|jL 10iJmol/L上游內引物(FIP)、 4. OpL 10iJmol/L下游內引物(BIP)、 0. 5pL 10iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 5yL 1Onmol/L下游外引物(B3)、 2pL 100 mmol/L MgS04、 5yL 5M甜菜堿和2. 1hL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
使用上述方法檢測產霍亂毒素霍亂弧菌，依次包括下列步驟(1) _ (3):
(1) 待檢樣品或細菌DNA的提取
提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D加。/0D28。在1.6-2.0范圍內，濃度 在10-100 ng/ijL范圍內。
(2) 進行產霍亂毒素霍亂弧菌的環介導等溫擴增反應
a. 在裝有22pL lamp反應液的反應管中加入2(jl待檢模板dna,和O. 5jjL的UNG 酶，于恒溫水浴上50。C放置3 min， 95。C放置3 — 5 min，立即置于冰上1一3 min;
B. 在反應管中加入1IJL Bst DNA聚合酶，并于水浴鍋中恒溫水浴上60—65t: 擴增反應45—90 min;
C. 將水浴調到80—85卩終止反應，3—5min后取出待檢；
(3) 顯色檢測；
在待檢的每個反應管中加入lpL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應液顏 色變為綠色，說明待檢樣品含有或為產霍亂毒素霍亂弧菌。
本發明是根據產霍亂毒素霍亂弧菌ctxA基因的六個序列設計了兩個特異性內
引物和兩個特異性外引物，該保守基因序列為產霍亂毒素霍亂弧菌所共有，以保 證檢測不同來源的產霍亂毒素霍亂弧菌的可靠性。本發明采用環介導等溫擴增技 術，該技術特異性強，與pcr檢測方法有相同的高靈敏度，但不需要昂貴的pcr儀， 只需普通的水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方法來觀察，使用熒光染料來觀 察即可，簡單而快速，特別適用于基層醫療機構。
具體實施例方式
下列實施例進一步說明本發明，但不應當作對本發明的限制。 實施例l
按下列配方制作產霍亂毒素霍亂弧菌的環介導等溫擴增反應液 (1) LAMP反應液
含有2.5ijL 10XThermopol反應緩沖液、1. 4yL 25mmol/L dNTP (四種脫氧核 糖核酸的混合物)、4.0pL 10fJmol/L上游內引物(FIP)、 4. 0pL 10jJmol/L下游內引 物(BIP)、 0.5pL 10pmol/L上游外引物(F3)、 0. 5|JL 10jjmol/L下游外引物(B3)、 2yL 100 mmol/L MgS04、 5|JL 5M甜菜堿和2. lpL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中所述的上游內引物
5-TGAATCCACGGCTCTTCCCT-TGGTTATGGATTGGCAGG誦3 、
下游內引物
5- GGTTGTGGGAATGCTCCAAG-ACTTTGGGTTTTTTCATCGC國3、
上游外引物5-GATATTGCTCCAGCAGCA-3、
下游外引物5- CGTCAAGGAATTTTACACCTAG -3
其中混合物dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。
(2) UNG酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8U /|jL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料SYBR GREEN I。 按照以下(1) - (3)程序進行檢測
(1) 樣品DNA的提取
檢測菌種01血清型霍亂弧菌(V.choleraeOl)，菌種來源中國疾病預防控制中 心傳染病預防控制所，編號GD98204。
使用北京天根生物工程公司的細菌核酸提取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0D26。/ 0D28。能夠達到1.8,濃度達到20 ng/|jL0
(2) 進行01血清型霍亂弧菌的環介導等溫擴增反應
A. 在裝有22yL LAMP反應液的反應管中加入2ijL待檢模板DNA，和O. 5ijL的UNG 酶，于恒溫水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置5 min，立即置于冰上l min;
B. 在各反應管中加入l |jL Bst DNA聚合酶，并于恒溫水浴上65 'C擴增反應1 小時；
C. 將水浴調到80 'C終止反應，3 min后取出待檢；
(3) 顯色檢測
在待檢的每個反應管中加入1JJL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應液顏 色變為綠色，說明待檢樣品為01血清型霍亂弧菌。 實施例2
按下列配方制作產霍亂毒素霍亂弧菌的環介導等溫擴增試劑盒 (1) LAMP反應液
含有2. 5|jl lOXThermopol反應緩沖液、1. 4|jL 25 mmol/l dNTP、 4.0 |jl 1Onmol/L上游內引物(FIP)、 4. 0 |jL 10 1Jniol/L下游內引物(BIP)、 0. 5 |JL 10(Jmol/L 上游外引物(F3)、 0.5 |JL 10 pmol/L下游外引物(B3)、 2|jL 100 mmol/L MgS04、 5pL 5mol/L甜菜堿和2. 1|jL ddH20 (滅菌雙蒸水)。
其中所述的上游內引物、下游內引物、上游外引物、下游外引物同上。
上述混合物dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。
(2) UNG酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8U /|jL;
(4) 顯色劑為10X的熒光染料DNAGreen。 按照以下(1) - (3)程序進行檢測
(1) 樣品DNA的提取
檢測菌種0139血清型霍亂弧菌(V.cholerae0139)，菌種來源中國疾病預防控 制中心傳染病預防控制所，編號JS9803。
使用大連寶生物工程公司的植物核酸提取試劑盒提取樣品DNA， DNA 0D260/ 0D280能夠達到L8，濃度達到20 ng/|jL。
(2) 進行0139血清型霍亂弧菌的環介導等溫擴增反應
A. 在裝有22pL LAMP反應液的反應管中加入2pL待檢模板DNA,和O. 5pL的UNG 酶，于恒溫水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上l min;
B. 在各反應管中加入lpLBstDNA聚合酶，并于恒溫水浴上65'C擴增反應1 h;
C. 將水浴調到8(TC終止反應，3 min后取出待檢；
(3) 顯色檢測
在待檢的每個反應管中加入llJL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應液顏 色變為綠色，則待檢樣品也為0139血清型霍亂弧菌。
核苷酸序列表
〈110〉山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
〈120〉產霍亂毒素霍亂弧菌環介導等溫擴增快速檢測方法
〈160〉 4
〈210> 1
〈211〉 38
〈212〉 DNA
〈213〉人工序列
〈221〉 prim—bind
〈222〉 (1)…(38)
〈400〉 1
TGMTCCACGGCTCTTCCCT-TGGTTATGGATTGGCAGG 38
〈210〉 2 〈211〉 40 <212〉眺 〈213〉人工序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (1)…(40) 〈400〉 2
GGTTGTGGGAATGCTCCMG-ACTTTGGGTTTTTTCATCGC 40
〈210〉 3 <211> 18 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (l)... (18) <400> 3
GATATTGCTCCAGCAGCA 18
〈210〉 4 〈211> 22 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈221〉 prim—bind 〈222〉 (1)…(22) 〈400〉 4
CGTCMGGMTTTTACACCTAG 2權利要求
1. 環介導等溫擴增檢測產霍亂毒素霍亂弧菌的試劑，其特征是該試劑包括(1)-(4)(1)環介導等溫擴增反應液包括10×Thermopol反應緩沖液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—8mmol/L硫酸鎂(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引內物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游內引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜堿；其中10×Thermopol反應緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷—鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X—100；其中上游內引物5-TGAATCCACGGCTCTTCCCT-TGGTTATGGATTGGCAGG-3；下游內引物5-GGTTGTGGGAATGCTCCAAG-ACTTTGGGTTTTTTCATCGC-3；上游外引物5-GATATTGCTCCAGCAGCA-3；下游外引物5-CGTCAAGGAATTTTACACCTAG-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)顯色劑為10％的熒光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 環介導等溫擴增檢測產霍亂毒素霍亂弧菌的試劑，其特征是上述的 dNTP內的四種脫氧核糖核酸的質量比為d,:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
3. 利用權利要求1中所述的試劑進行等溫快速檢測產霍亂毒素霍亂弧 菌的方法，其特征是依次包括(1) - (3)下列步驟(1)待檢樣品或細菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26。/ 0D咖在1. 6-2. 0范圍 內，濃度在10-100 ng/uL范圍內； (2) 進行產霍亂毒素霍亂弧菌的環介導等溫擴增反應A. 在裝有22ixLLAMP反應液的反應管中加入2iiL待檢樣品模板DNA，和 0.5uL的麗G酶，于恒溫95 。C放置3 —5min，立即置于冰上1 —3 min;B. 再在反應管中加入luL Bst DNA聚合酶，并于恒溫65 'C擴增反應45 —90 min;C. 將溫度調到80 。C終止反應，3 — 5 min后取出待檢；(3) 顯色檢測在每個反應管中加入1PL顯色劑，直接用肉眼觀察顏色變化，反應液 顏色變為綠色，說明待檢樣品含有或為產霍亂毒素霍亂弧菌。
全文摘要
本發明涉及一種產霍亂毒素霍亂弧菌環介導等溫擴增快速檢測方法。其中的試劑包括環介導等溫擴增反應液、Bst DNA聚合酶、顯色劑；其中的反應液含有反應緩沖液、dNTP、硫酸鎂、上游內引物5-TGAATCCACGGCTCTTCCCT-TGGTTATGGATTGGCAGG-3、下游內引物5-GGTTGTGGGAATGCTCCAAG-ACTTTGGGTTTTTTCATCGC-3、上游外引物5-GATATTGCTCCAGCAGCA-3、下游外引物5-CGTCAAGGAATTTTACACCTAG-3和甜菜堿；檢測產霍亂毒素霍亂弧菌的方法包括細菌DNA的提取、產霍亂毒素霍亂弧菌的環介導等溫擴增、顯色檢測。本發明的優點是快速、特異性強、靈敏度高而且成本低。
文檔編號C12Q1/68GK101386885SQ200810157500
公開日2009年3月18日 申請日期2008年10月15日 優先權日2008年10月15日
發明者劉云國, 靜 唐, 姜英輝, 健 張, 房保海, 李正義, 祝素珍, 楠 賀, 賈俊濤, 趙麗青, 雷質文, 馬維興 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心