專利名稱：褐點石斑魚鰭細胞系的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種利用褐點石斑魚鰭組織細胞建立鰭細胞系的方法——褐點石斑魚 鰭細胞系的構建方法。
背景技術：
褐點石斑魚(i:/ /"e;^e/"sykscog"加m力是廣泛分布于印度洋和太平洋的熱帶、亞 熱帶海域的一種具有較高經濟價值的名貴海水養殖魚類。近年來，我國的石斑魚養殖 規模越來越大，但傳染性病毒病也隨之開始廣泛傳播，致使其死亡率逐年上升，造成 了重大的經濟損失。査清魚類病毒的感染途徑和病毒與細胞的相互作用機理是從根本 上預防和解決石斑魚等眾多海洋經濟魚類病毒病的關鍵，而魚類細胞系正是研究病毒 感染途徑、感染機理以及研制病毒疫苗的重要研究體系，也是該領域的研究熱點和主 攻方向之一。
目前，還未有建立褐點石斑魚組織細胞系的相關報道，也沒有通過相應細胞系大 規模生產病毒疫苗的成功報道。顯然，盡快建立褐點石斑魚組織細胞系是為魚類病毒 學等相關研究奠定基礎，為魚類病毒的分離、鑒定、繁殖、病毒疫苗制備以及病毒與 宿主細胞相互作用等研究創造條件，從而為石斑魚養殖業帶來巨大的經濟效益是非常 必要的。
發明內容
本發明的目的就是利用褐點石斑魚鰭組織，提供一種褐點石斑魚鰭細胞系的構建 技術，以彌補現有技術的不足。
本發明的構建方法首先對鮮活褐點石斑魚分別用濃度均為1000單位/毫升的青 霉素和鏈霉素的高雙抗海水和75%酒精消毒處理，置于超凈工作臺中取下鰭組織，以 75%酒精再次消毒，磷酸緩沖液漂洗后剪成大致1 mm3的組織塊；用濃度為0.5 %透 明質酸酶和0.2%11型膠原酶對鰭組織塊聯合消化1~2小時，并離心收集鰭組織塊；用 含有5%胎牛血清和0.05^ 0.15。^的羧甲基殼寡糖的pH值為7.0-7.4的DMEM/F12培 養液充分懸浮，均勻接種于25毫升培養瓶中，24'C下正置干貼16~20小時后，每瓶 加入5毫升褐點石斑魚鰭細胞專用增殖培養液，置22 24'C生化培養箱中培養，每隔 3~5天半量更換褐點石斑魚鰭細胞專用增殖培養液一次；待褐點石斑魚鰭細胞長成單 層后，使用濃度為0.1%~0.3%胰蛋白酶溶液消化，經褐點石斑魚鰭細胞專用培養液懸 浮后，按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培養。
所述的褐點石斑魚鰭細胞專用增殖培養液配方為含有20%胎牛血清的pH值為 7.0~7.4的DMEM/F12培養液，并添加占該培養液0.05%。~0.15%)比例的羧甲基殼寡糖。
為了促進褐點石斑魚鰭細胞的分裂和快速增殖，進一步又添加了 0.01%。~0.02%。的人堿 性成纖維細胞生長因子和0.02%。~0.04%。的I型人胰島素樣生長因子。
本發明的主要特點是細胞系可以連續傳代，因此能提供出大量的褐點石斑魚鰭 細胞；細胞系既可為魚類病毒學等多種相關研究提供理想的體外研究，又可為魚類病 毒提供一個理想的體外繁殖體系。經這種方法所構建的鰭細胞系現已傳至第61代。
具體實施例方式
將上述本發明的方法按照基本步驟進行詳述如下
1、 褐點石斑魚鰭組織塊的制備鮮活褐點石斑魚于濃度均為1000單位/毫升的青 霉素和鏈霉素的高雙抗海水中暫養24小時后于75%酒精中消毒1 2分鐘。于超凈工 作臺中無菌取下鰭組織，再次用75 %酒精漂洗0.5 1分鐘，用磷酸緩沖液漂洗2遍后 在含有5。/。胎牛血清的DMEM/F12培養液中，將鰭組織剪成約lmm3的組織塊；800轉 /分鐘離心收集鰭組織塊，加入0.5 %透明質酸酶和0.2 %11型膠原酶聯合消化1~2小時； 1000轉/分鐘離心收集組織塊；用含有5%胎牛血清和0.05%。~0.15%。的羧甲基殼寡糖的 pH值為7.0 7.4的DMEM/F12培養液充分懸浮，均勻接種于25毫升培養瓶中；將培 養瓶放入24'C培養箱中，正置干貼16 20小時。
2、 褐點石斑魚鰭細胞專用培養液的配制取常規配制的DMEM/F12培養液(pH 7.0-7.4) 3.0亳升，加入羧甲基殼寡糖0.15~0.3毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔 濾膜過濾除菌，加入1毫升胎牛血清，補加常規配制的DMEM/F12培養液至5.0毫升， 即為本發明的褐點石斑魚鰭細胞專用培養液。
為了促進褐點石斑魚鰭細胞的分裂和快速增殖，在上述專用培養液的基礎上又添 加了 0.01%。~0.02%。的堿性成纖維細胞生長因子和0.02%。~0.04%。的人I型胰島素樣細胞 生長因子。
4、 褐點石斑魚鰭細胞原代培養的啟動將每瓶干貼后的鰭組織中加入5毫升的上 述專用培養液，于22 24'C培養；鰭細胞遷出后，每間隔3~5天，除去舊培養液，以 去除未貼壁的組織和死細胞，加入5毫升新鮮的褐點石斑魚鰭細胞專用培養液；
5、 褐點石斑魚鰭細胞的傳代培養待褐點石斑魚鰭細胞長成單層后，吸出培養瓶 中的培養液，向每個培養瓶中加入1毫升濃度為0.1%~0.3%的胰蛋白酶溶液，靜置消 化0.5 1.5分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，將剛剛吸出的5毫升舊培養液加回，用滴管吹打 培養瓶底制成褐點石斑魚鰭細胞懸液；從每個培養瓶中分別取出2.5毫升鰭細胞懸液， 分別加入到新的培養瓶中，每個培養瓶補加上述專用培養液2.5毫升，使之最終體積 至5毫升；待褐點石斑魚鰭細胞再次長成單層后，仍以上述的相同方法進行傳代培養。
實施例1
將鮮活褐點石斑魚放入濃度均為1000單位/毫升的青霉素和鏈霉素的高雙抗海水 中暫養24小時后于75 %酒精中消毒2分鐘，進行首次消毒；用棉球擦拭魚體表后取沖液玻璃培養皿中，用鑷子夾取浸有磷酸緩沖液的棉球順 著鰭條的方向充分擦拭鰭組織，清除鰭組織表面黏液；再于75%酒精中漂洗1分鐘， 進行二次消毒；將鰭組織用磷酸緩沖液漂洗2遍，充分洗去酒精后，轉入含有5%胎牛 血清DMEM/F12培養液的青霉素小瓶中剪成1立方毫米的組織塊；800轉/分鐘離心收 集鰭組織塊，加入0.5 %透明質酸酶和0.2 %11型膠原酶聯合消化2小時；1000轉/分 鐘離心收集組織塊；用含有5%胎牛血清和0.05%。的羧甲基殼寡糖的pH值為7.2的 DMEM/F12培養液充分懸浮，均勻接種于25平方厘米培養瓶中；將培養瓶放入22°C 培養箱中，正置干貼16小時。
取常規配制的DMEM/F12培養液(pH7.2) 3毫升，加入羧甲基殼寡糖0.3毫克， 完全溶解后用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入l毫升胎牛血清，補加常規配制的 DMEM/F12培養液至5.0毫升，即為褐點石斑魚鰭細胞專用培養液。在上述專用培養 液中又添加了 0.01%。人堿性成纖維細胞生長因子，更有利于褐點石斑魚鰭細胞的分裂 和快速增殖。將每瓶干貼后的鰭組織中加入5毫升的上述專用培養液，于22'C培養； 鰭細胞遷出后，每間隔3天，除去舊培養液，以去除未貼壁的組織和死細胞，加入5 毫升新鮮的褐點石斑魚鰭細胞專用培養液。待鰭細胞長成單層后，吸出培養瓶中的培 養液，向每個培養瓶中加入1毫升濃度為0.1%的胰蛋白酶溶液，靜置消化1.5分鐘； 吸去胰蛋白酶溶液，將剛剛吸出的5毫升舊培養液加回，用滴管吹打培養瓶底制成褐 點石斑魚鰭細胞懸液；從每個培養瓶中分別取出2.5毫升鰭細胞懸液，分別加入到新 的培養瓶中，每個培養瓶補加上述專用培養液2.5毫升，使之最終體積至5毫升；待 褐點石斑魚鰭細胞再次長成單層后，仍以上述的相同方法進行傳代培養。
實施例2
將鮮活褐點石斑魚放入濃度均為1000單位/毫升的青霉素和鏈霉素的高雙抗海水 中暫養24小時后，于75 %酒精中消毒1.5分鐘，進行首次消毒；然后將魚轉入超凈 工作臺中；用棉球擦拭魚體表后取下鰭組織，置于盛有磷酸緩沖液玻璃培養皿中，用 鑷子夾取浸有磷酸緩沖液的棉球順著鰭條的方向充分擦拭鰭組織，清除鰭組織表面黏 液；再于75%酒精中漂洗0.5分鐘，進行二次消毒；將鰭組織用磷酸緩沖液漂洗2遍， 充分洗去酒精后，轉入含有5%胎牛血清DMEM/F12培養液的青霉素小瓶中剪成1立 方毫米的組織塊；800轉/分鐘離心收集鰭組織塊，加入0.5%透明質酸酶和0.2%11型 膠原酶聯合消化1.5小時；1000轉/分鐘離心收集組織塊；用含有5%胎牛血清和0.1%> 的羧甲基殼寡糖的pH值為7.4的DMEM/F12培養液充分懸浮，均勻接種于25平方厘 米培養瓶中；將培養瓶放入24'C培養箱中，正置干貼20小時。
將每瓶干貼后的鰭組織中加入5毫升的pH值為7.4的褐點石斑魚鰭細胞專用培養 液，其中添加了 0.02%。的人堿性成纖維細胞生長因子和0.02%。的人I型胰島素樣細胞 生長因子，有利于褐點石斑魚鰭細胞的貼壁、分裂和快速增殖。于24"C培養；鰭細胞 遷出后，每間隔4天，除去舊培養液，以去除未貼壁的組織和死細胞，加入5毫升新
鮮的褐點石斑魚鰭細胞專用培養液；待褐點石斑魚鰭細胞長成單層后，吸出培養瓶中 的培養液，向每個培養瓶中加入1毫升濃度為0.3%的胰蛋白酶溶液，靜置消化0.5分 鐘；吸去胰蛋白酶溶液，將剛剛吸出的5亳升舊培養液加回，用滴管吹打培養瓶底制 成褐點石斑魚鰭細胞懸液；從每個培養瓶中分別取出2.5毫升鰭細胞懸液，分別加入 到新的培養瓶中，每個培養瓶補加上述專用培養液2.5毫升，使之最終體積至5毫升； 待褐點石斑魚鰭細胞再次長成單層后，仍以上述的相同方法進行傳代培養。
實施例3
將鮮活褐點石斑魚放入濃度均為1000單位/毫升的青霉素和鏈霉素的高雙抗海水 中暫養24小時后，于75 %酒精中消毒1分鐘，進行首次消毒；然后將魚轉入超凈工 作臺中；用棉球擦拭魚體表后取下鰭組織，置于盛有磷酸緩沖液玻璃培養皿中，用鑷 子夾取浸有磷酸緩沖液的棉球順著鰭條的方向充分擦拭鰭組織，清除鰭組織表面黏液； 再于75 %酒精中漂洗0.5分鐘，進行二次消毒；將鰭組織用磷酸緩沖液漂洗2遍，充 分洗去酒精后，轉入含有5%胎牛血清DMEM/F12培養液的青霉素小瓶中剪成1立方 毫米的組織塊；800轉/分鐘離心收集鰭組織塊，加入0.5%透明質酸酶和0.2%11型膠 原酶聯合消化1小時；1000轉/分鐘離心收集組織塊；用含有5%胎牛血清和0.15%0的 羧甲基殼寡糖的pH值為7.2的DMEM/F12培養液充分懸浮，均勻接種于25平方厘米 培養瓶中；將培養瓶放入24'C培養箱中，正置干貼18小時。
將每瓶干貼后的鰭組織中加入5毫升的褐點石斑魚鰭細胞專用培養液，其中添加 了 0.01%。的人堿性成纖維細胞生長因子和0.04%。的人I型胰島素樣細胞生長因子，以 滿足褐點石斑魚鰭細胞的最佳增殖條件。24'C培養；鰭細胞遷出后，每間隔5天，除 去舊培養液，以去除未貼壁的組織和死細胞，加入5毫升新鮮的褐點石斑魚鰭細胞專 用培養液；待褐點石斑魚鰭細胞長成單層后，吸出培養瓶中的培養液，向每個培養瓶 中加入1毫升濃度為0.25%的胰蛋白酶溶液，靜置消化1分鐘；吸去胰蛋白酶溶液， 將剛剛吸出的5毫升舊培養液加回，用滴管吹打培養瓶底制成褐點石斑魚鰭細胞懸液； 從每個培養瓶中分別取出2.5毫升鰭細胞懸液，分別加入到新的培養瓶中，每個培養 瓶補加上述專用培養液2.5毫升，使之最終體積至5毫升；待褐點石斑魚鰭細胞再次 長成單層后，仍以上述的相同方法進行傳代培養即可。
權利要求
1.一種褐點石斑魚鰭細胞系的構建方法，首先對鮮活褐點石斑魚分別用濃度均為1000單位/毫升的青霉素和鏈霉素的高雙抗海水和75％酒精消毒處理，置于超凈工作臺中取下鰭組織，以75％酒精再次消毒，磷酸緩沖液漂洗后剪成大致1mm3的組織塊；用濃度為0.5％透明質酸酶和0.2％II型膠原酶對鰭組織塊聯合消化1～2小時，并離心收集鰭組織塊；用含有5％胎牛血清和0.05‰～0.15‰的羧甲基殼寡糖的pH值為7.0～7.4的DMEM/F12培養液充分懸浮，均勻接種于25毫升培養瓶中，24℃下正置干貼16～20小時后，每瓶加入5毫升褐點石斑魚鰭細胞專用增殖培養液，置22～24℃生化培養箱中培養，每隔3～5天半量更換褐點石斑魚鰭細胞專用增殖培養液一次；待褐點石斑魚鰭細胞長成單層后，使用濃度為0.1％～0.3％胰蛋白酶溶液消化，經褐點石斑魚鰭細胞專用培養液懸浮后，按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培養；所述的褐點石斑魚鰭細胞專用增殖培養液配方為含有20％胎牛血清的pH值為7.0～7.4的DMEM/F12培養液，并添加占該培養液0.05‰～0.15‰比例的羧甲基殼寡糖。
2、如權利要求l所述的構建方法，其特征是在上述褐點石斑魚鰭細胞專用 增殖培養液中又添加占該培養液0.01%。~0.02%。比例的人堿性成纖維細胞生 長因子和占該培養液0.02%。~0.04%。比例的I型人胰島素樣生長因子。
全文摘要
本發明涉及一種褐點石斑魚鰭細胞系的構建方法，它是以褐點石斑魚鰭組織為材料，采用濃度為0.5％透明質酸酶和0.2％Ⅱ型膠原酶聯合消化法啟動原代培養，在含胎牛血清、堿性成纖維細胞生長因子、Ⅰ型胰島素樣生長因子和羧甲基殼寡糖的pH值為7.0～7.4的DMEM/F12培養液中培養；采用胰蛋白酶消化法進行傳代培養；由本發明構建的褐點石斑魚細胞系，目前已傳至第61代，其工藝科學合理，可望應用于魚類病毒的分離、鑒定、繁殖、病毒疫苗制備，以及病毒與宿主細胞相互作用等方面研究。
文檔編號C12N5/06GK101372682SQ200810157499
公開日2009年2月25日 申請日期2008年10月15日 優先權日2008年10月15日
發明者姜國建, 楊洪收, 樊廷俊, 魏云波 申請人:中國海洋大學