專利名稱：基于RNAi技術的多基因聯合基因治療的質粒載體的制作方法
基于RNAi技術的多基因S^基因治療的質粒載體
fe^領域l本發明屬于生物醫藥技術與惡幽中瘤的基因治療技術領域。
背景S^惡倒中瘤本質上是一種多基因異常疾病，由于多數原癌基因和抑癌基因屬于信號轉
導通珞中的重要組分，通過撒活一種或多種原癌基因的,及抑癌基因的突變缺^;人而{動中瘤細
M3S了正常生長調控機制，自^^彌殖和侵襲、出現惡性表型。近乎所有棚中瘤的發病機理 均涉及了原癌基因的過皿和抑癌基因的突變等多環節、多通珞的異常(Mischel PS, et al. Brain Pathol,2003 ;13:52-61)。目前，有^M瘤的針病理學機制與惡腿展的研究中，以表皮生長因 子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)為代表的受體酪氨^"激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)信號轉導^^^ 瘤的惡腿^31程中據 作用，已日益穀咲注。EGFR由3個 主要區域鄉賊 一個N端細鵬卜區域， 一個疏冰的跨膜區和一個C端細胞內區敏細胞結構域內 包括酪氨酸激酶結構嫩卩ATP結合位點；細鵬卜結構是多種多肽生長因子的配體結合點；其: 要的配體是表皮生長因子(EGF)和轉移生長因子a (TGFa) (Sasaki AT,et al. J Cell BioU004，167:505-518.)。針遺傳學研究表明EGFR的突變、擴增與過敏題'I4I^瘤、尤 其是原發IWM母細M早期和主要M事件；細M卜配體結合區與EGF和TGFa結合形成同源 ^M二聚體，可以導致細胞內酪氨酸^ll被激活；或當EGFRM卜區缺失突變、不需與配體結 合而^^活，貝雌內區酪氨酸殘基自磷酸化轉為活,式導致激酶級聯反應。i^ll^主要艦 下游的磷酸磷脂W3羥纖酶(Phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)鵬和Ras鵬^M 瘤的發生、^Mil程中，作用。
近年的研究發現， 一些小的雙鏈RNA (double-stranded RNA， dsRNA)可以高效、特異地促使體 內特定基因mRNA降解，誘使細胞出現特定基因缺失的表型，這種技術即RNA干擾(RNA interference, RNAi)。在RNAi作用的起始階段中夕卜源性或內源性的雙鏈RNA被Dicer酶切割為 19 21bp的小^T擾RNA片段(small interfering RNAs ， siRNAs);隨后siRNA與核酶復合 物結合后形成RNA誘導沉默復激(RNA induced silencing complex, RISC ); RISC激活后通 過MS配對定位到同源mRNA ,本上并切割mRNA，從而部分或完全抑制目的基因的皿
3(Zhang H, et al. EMBO J， 2002;21:5875-5885. Kawasaki & et al..Nucleic Acids Res, 2003;31:981-987.)。
另一方面，細胞在RNA,性RNA聚合Hf乍用下，可以siRNA為弓,、以mRNA為模板，合 成出mRNA的互補鏈，從而使mRNA也變成了 dsRNA，然后在Dicer酶的作用下再次被,成 siRNA。 S^f 生成的siRNA也具有誘發RNAi的作用，通MS^^反應，細胞內的siRNA大 娥加，顯著增加了對基因敲的抑制。
從RNAi的作用機制中可見，這種基因毅調筋法屬于緑后的調節并具有明顯優勢RNAi 基因抑制效果確切，細微量的siRNA即可使其編碼致病基因，的賴下降90。/。以上、甚至可 以達到基因敲除的效果；其次，RNAi抑制具有嚴格的序列特異性，治療的針對性強，因而細此 項技術f辦同,制同一基因的多個耙點或多個不同基因而頓相互干擾；同時，RNAi的作用 具有級^^大 她和高穿透性頓合惡倒中瘤的實驗研究；此外，RNAi序列i鄉啲特異性即或 對由野生型點突變形成的癌基因也能夠產生準確有效的封閉效果而對野生型基因沒有影響 (Zhen，etal.IntJOncol.2007Nov;31(5):llll-7.)。頓多種月中瘤細鵬實驗中也證實腫瘤細胞中均 ^^著RNAi的機制，化學合成、質紛病毒或其他方式介導的RNAi可以有效地抑制內源性RNA 的敏(Gondi CS,et al. Clin Cancer Res. 2007 Jul 15;13(14):4051-60. Gondi CS，,et al. Neuron Glia Biol. 2004May;l(2):165-176)。因此，RNAi技術御中瘤的基因治療上具有光明的應用前景，并被認為是 反義基因治療時代之后的又一個劃時代的進步。由于RNAi的研究在近幾年出現了突破Sa展， 它纖三次被Science評為年度十大科學漲ltt一 (2001-2003 )。
發明內容本發明目的是Jlf共一種基于RNAi技術的多基因K^基因治療質粒載體。 本發明提供的體內抑帝MM瘤生長的方^^基于RNAi技術的^基因治療質粒載體，運用該 方法可以在大鼠的實驗割牛下抑制人激^M瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡。 1)本發明MI了四種用于產生siRNA的DNA序列 DNA序列1 SEQ IDNO.l
5'"GArCCAGGAAnAAGAGAAGCAACAl|3SC^SArGTTGCTrCTCnAAITCCl|TnTJX^SKA-3' SEQEDNO.2
3'"GTCCTTAAITCTCTrCGTrGTAMi6TJd^TACAACGAAGAGAArrAAGGA^5IIS^R3T[TCGA -5,DNA序列2 SEQ IDNO.3
5'"GATCCGCGTGArGAGTTGCACGGTGGAGGTGAGG^^^歡CTCACCTCCACCGTGCAACTCArCACGCi SEQ IDNO.4 AAAAAACTCGAGTTCGA-5'
DNA序列3 SEQ IDNa5
5'^GATCCGTGGAATGAACCACTGGAArn^ll^^AAAITCCAGTGGTrcArrCO5i]fiflHi0i:ClgiA-3， SEQ IDNO.6
3'^GCACCTTACITGGTGACCTrAA^^(:CTr(lrnAAGGTCACCAAGTAAGGTiJi^l^A0^TrCGA-5'
DNA序列4 SEQ IDNO.7
5'-GATCCAGGGACCAGTACATGAGGACI^;^ft離GTCCTCArGTACTGGTCCCnil]^^^lA-3' SEQ DDNO.8
3'<}TCCCTGGTCArGTACTCCTGA|C|||^l6crCAGGAGTACArGACCAGGGAAAAAAA#TCGAGTrCGA-5，
包含戰四組DNA序列的組合的質粒為本發明的微范圍，具懶口下質粒為DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/Pgenesil-l 。質粒DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列 3、 DNA序列4/Pgenesil-1的通用結構如圖2示。質粒構建方法為如下，最終在Pgenesil-l中形成 的酶切位點JI頃序為一HindlII""DNA序列HamHI~U6啟動^^coRHDNA序列2"^amHI""U6啟動子 ^coRHDNA序列3~^amHI~U6啟動^fix)RHDNA序列4~BamHI""U6啟動^BssHn"^XbaUotl
2))本發明在發明1的基礎上將DNA序列-1 、DNA序列2、DNA序列3、DNA序列4/ Pgenesil-l 質粒的EGFP切除，插入人源PTEN或者p53或者Cx43基因.(上^^種基因序列可以在公共 庫中Si旬，非本發明發現)。包含戰四組DNA序歹啲樹可組合以及與人源PTEN或者p53赫 Cx43基因組合的質粒為本發明的微范圍。具體質粒為DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源PTEN或者p53或者Cx43基0/Pgenesil-l 。
本發明的優點和積極鄉
本發明與傳統 點和多靶點抑癌基因治療相比，基于RNAife^:、靶向EGFR信號通珞的 ^基因治療的質粒在體外倉魄著的提高基因治療的效果。
圖l質粒構建圖譜，在Pgenesil-l中形成的酶切位點",為"Hindffl""DNA序列l"BamHI"U6啟 動:^~EcoRI"^DNA靜!J2"^amH^"U6啟動:？^coRI~^DNA序列34amHI~U6啟動子^coRI"DNA序 列4^amHI"U6啟動T^ssHn—XbahHSfoth^stl。
圖2是酶切鑒定分析目的基因片段DNA序列1+2與目的基因片段DNA序列連接^C力。
圖3是酶切鑒定分析目的基因片段K^RNAi與Cx43 ^iiM禾iai接成功。
圖4是酶切鑒定分析目的基因片段g RNAi與PTEN ^iiM禾鏈接成功。
圖5是酶切鑒定分析目的基因片段K^RNAi與p53 ^iM豐i^接成功。
圖6 U251裸鼠皮下荷瘤模型組織病理分析結果。(1對照組；2:對照^粒組;3: - 8:不同組合
治療組)
具體m^;
實施例l針對癌基因的多基因RNAi質粒載體的構建構建一鋪體編碼4條siRNA的質 粒載體。
一. 實驗材料
1.目的基因EGFR、 PDKpllO、 K-RAS。 DNA序列14。所用麟T4DNALigase 、 Sacl 、 Sail 、 EcoRI 、 Pstl、 Xbal、 Hindm、 Bamffl等(購自NEB公司)。 表l、設計用于RNAi的目的基因序列
序列編碼GenBankNO.
SEQ IDNO.l畫"005228
SEQ IDNO.2畫都228
SEQ EDNO.3麗都228
SEQ IDNO.4NiVWX)5228
SEQ IDNO.5畫006219.1
SEQ IDNO.6畫006219.1
SEQ IDNO.7M54968
SEQ IDNO.8M54968
2.線性化的PEGFP6-1、 Pgenesil-l、 PEGFP6-3、 PEGFP64質粒載體 ①PEGFP6-1的MCS如下
—Hindm—Insert DNA—BamHI—U6啟動^"EcoRI—Sac1—Kpnl—Sall—BssHH— XbaI~NotI—Psd—② Pgenesil-l的MCS如下
^indm—Insert DNA~^amHI~U6啟動^-^coRI—Sail—Xbal—
③ PEGFP6-3的MCS如下 ^indffl~~InsertDNA~BamHI~U6啟動^"BssHIF"Xbal"Notl"-Pstl—
PEGFP64的MCS如下
~ilindffl—Insert DNA~^amHI~U6啟動^^coRFHPst1— 用BamHI和Hindm雙酶切以上四種質粒，1 % Agase 繊電泳回收大片段，即為線 性化質粒載體；以上四種質粒載體除MCS不同外，其余序列完t樣。 3.所用麟T4DNALigase 、 Sacl 、 Sail 、 EcoRI 、 Pstl、 Xbal、 Hin孤、BamHI等(購 自NEB公司)。 二.實驗方法
1. 單鏈目的基因片段的退，接
各用50ul annealing buffer溶解戰合成20D單鏈目的基因片段。 各取2ul (即2ulDNA序列l-l+2ulDNA序列l隱2) +16ul畫alingbuffer混勻。 94。C水浴退火自然7鄉體溫。 各取lul退妒物9ul H20做100倍稀釋。
2. 稀釋退火片段分別與線性化PEGFP64、 Pgenesil-l、 PEGFP6-3、 PEGFP64質粒載體的連接。
鵬連接反應如下
DNA序列1稀Pii火片段與PEGFP6-1載體的連接 DNA序列2稀5^I火片段與Pgenesil-l載體的連接 DNA序列3稀釋退火片段分別與PEGFP6-1 、 PEGFP64載體的連接 DNA序列4 ^PM火片段與PEGFP6-3載體的連接 鵬連接反應餅如下
稀糨火片段 M 7線性鵬立載體 lul
10 XLigase Buffer M
T4DNALigase M H20 6ul
22。C^JC浴反艦夜。
3. 各取5ul過夜連接產物轉化感受態細胞DH5 a ，分別涂布a Kan^抗性(終濃度為 20ug/ml)的LB平肚，37。C恒溫節^l夜。
4. 從齡培養皿上^t兆取3個單克隆離接種于3ml含Kanar抗性(終濃度為20ug/ml)的 LB培養液中，37。C恒溫搖床(250rpm)培養過夜。
5. 用試劑盒小量提M粒(中鼎公司)，M別l鵬切鑒定
①DNA序列1質豐姻EcoRI做酶切鑒定
DNA 8.5ul 10 xH Buffer M EcoRI 0.5ul 37DjC浴反應3h
1 %Agase MK電泳，電泳圖譜如下
經酶切分析因為質粒載體PEGFP6-1里面本來只有一個EcoRI的酶切位點，而DNA序
列1-2質粒能被EcoRI酶切出一條約400bp的DNA條帶，說明目的基因片段已，入到
質粒載體PEGFP6-1里。
②DNA序列2、 DNA序列4質粒分別用Sacl做酶切鑒定
DNA 8.5ul 10XLBuffer lul Sacl 0.5ul 37。C^C浴鵬3h
1 %Agase ; 電泳，電泳圖i普如下
經酶切分析因為質粒載體Pgenesil-1和PEGFP6-3里面本來是沒有Sacl的酶切位點的，
而DNA序列2-6、 DNA序列4-14質粒均育灘被Sacl所酶切，說明目的基因片段
已經分別插入到戰兩個質粒載體里。③DNA序列3質粒分別用Sail做酶切鑒定 DNA 8.5ul 10 xH Buffer lul Sail 0.5ul 37。C^C浴反應3h
1^AgaseM^電泳，電泳圖譜如下
6. 挑取克隆正確的質粒轉化菌液DNA序列1-2、 DNA序列24、 DNA序列3-8、 DNA序列
4-14去測序。
經測序結果分析均為插入正確的克隆質粒，而皿ftfc^^設計標準。
7. 質粒DNA序列l-2、 DNA序列2"6的SacI+SalI雙酶切分別回收大片段和小片段
DNA 5ul
10 xL Buffer 2ul
Sacl lul
H20 12ul
各加入2ul5MNacl，混勻，再加入51ul酒精，混勻。
—70。C職方燈15 miiU5000rpm離心15mir^
70%酒精^^滌^^，然后用17ulH20充分溶解。
辦用Sal^酶切
上步反應物 17ul
10 xH Buffer 2ul Sail M
37。C^浴反艇夜。
1^Agase凝膠電泳
用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回收DNA序列1-2大片段和DNA序列2>6小片段(U6啟
動子+DNA序列2約400bp)
8.質粒DNA序列3-8、 DNA序列4~14的SacI+XbaH雙酶切分別回收大片段和小片段微用Sacl酶切
DNA 5ul
10 xL Buffer 2ul
Sacl lul H20 12ul
37。C水浴反艦夜。
加入2ul5MNacl，混勻，再加入51ul酒精，混勻。
—70。C職驢15 miiU5000rpm離心15我
70%酒精洗滌兩遍，然后用15ulH20充分溶解。
鵬用XbaI酶切
上步反應物 15ul
10 xM Buffer 2ul
0.1%BSA 2ul Xbal M
37DJC浴反艦夜。
r^Agase凝膠電泳
用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回收DNA序列3-8大片段和DNA序列4-14小片段(U6啟 動子+DNA序列4約400bp)
9.回收小片段與回收大片段的連接-
① DNA序列1-2回收大片段與DNA序列2-6回收小片段的連接
② DNA序列3-8回收大片段與DNA序列114回收小片段的連接
連接反應餅如下
回收小片段 4ul
回收大片段 4ul
10 x Ligase Buffer 1 ul
T4DNALigase lul
22。K浴反艦夜。10. 各取5ul過夜連接產物轉化感受態細胞DH5 a ，分別涂布于含Kana'抗性(終濃度為 20ug/ml)的LB平feJ:， 37。C恒溫箱培養過夜。
11. 從齡i歸皿上^M取3個單克隆離接種于3ml含Kanar抗性(終濃度為20ug/ml)的
LB培養液中，37。C恒溫搖床(250ipm)歸過夜。
12. 用試劑盒小量提M粒(中鼎公司)，并用BamHI做酶切鑒定
DNA 8.5ul 10 xK Buffer lul BamHI 0.5ul 37DjC浴鵬3h
13. 質粒DNA序列1+2-1 、 DNA序列3+44的Sall+Pstl雙酶切分別回收大片段和小片段(約
800bp)
DNA 6ul
10 xH Buffer 2ul
Sail lul Pstl M H20 編
37。C水浴^^1夜。 lXAgaseMI^電泳
用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回收DNA序列1+2-1大片段和DNA序列3+44小片段 (DNA序列3+U6啟動子+DNA序列4+U6啟動子約800bp)
14. 質粒DNA序列1+2-1 、 DNA序列3-10的Sall+Pstl雙H切分別回收大片段和小片段(約
400bp)
DNA 6ul
10 xH Buffer 2ul
Sail lul Psil lul H20 lOul
37。C^C浴反艦夜。 1^Agase繊電泳
15. 回收小片段與回收大片段的連接
1①DNA序列1+2-1回收大片段與DNA序列3+44回收小片段的連接
②DNA序列1+2-1回收大片段與DNA序列3-10回收小片段的連接
連接反應餅如下
回收小片段 4ul
回收大片段 4ul
10 x Ligase Buffer ltd
T4DNALigase lul
22X^JC浴反艦夜。
16. 各取5ul過夜連接產物轉化感受態細胞DH5 a ，分別涂布于含Kan^抗性(終濃度為 20ug/ml)的LB平肚，37。C恒溫箱培微夜。
17. 從^h培養皿上^t兆取3個單克隆離接種于3ml含Kan^抗性(終濃度為20ug/ml)的
LB培養液中，37。C恒溫搖床(250ipm)歸過夜。
18. 用試劑盒小量提取質粒(中鼎公司)，并用Hin孤+Pstl做酶切鑒定
DNA 7ul
10 xM Buffer 2ul
Hindffl 0.5ul
Pstl 0.5ul
H20 10ul
37。C水浴鵬3h
實施例2 DNA序列-1 、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源PTEN或者p53或者 Cx43基0/PgenesiM的構建 1、合成PCR引物
P53-l: 5'- CTAGCTAGCTAGCCGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGAr-3' P53國2: 5'- GAAGATCTTCTTCAGTCTGAGTCAGGCCC^rcTGT陽3, CX43-1: 5'-CTAGCTAGCTAGCCACCATGGGTGACTGGAGCGCCTTAG-3' CX43-2: 5'陽CCGCTCGAGCTTCAGATCTCCAGGTCArCAGGCCGA-3' PTEN-1: 5'-GGGGTACCCGCCACCATGACAGCCATCATCAAAGAGAT-3'PTEN-2: 5'-CCGCTCGAGCGGTTCAGACTnTGTAAnTGTGTATG-3'
表2、設計用于PCR弓胸的基因序列
序列編碼GenBankNO.
P53畫000546.3
Cx43NP 000156.1
PTENNP 000305.3
2、 DNA質粒Pcp53-SN3、 PbluescriptR《x43、 pGz21 &Xz-PTEN
3、 所用麟TaqHS、 Nhel、 Xhol、 BglH、 Kpnl
1 、用TP53基因分別^f^i^體里的EGFP基因
①PCR擴增TP53基因分別以TP53-1、 TP53-2為上下游弓物，以質粒Pcp53-SN3為禾鎌， 90°C 45s 58°C 45s 72°C 60s 30 cycles PCR擴增TP53基因。
PCR反應餅
10xPCR Buffer5ul
10mMdNTPMix2ul
10uMTP53-llul
10uMTP53-2lul
T叫HS0.5ul
Pcp53國SN30.5ul
mo40ul
PCR反應結束后，1 % Agarose凝膠電泳回收目的TP53基因片段，用膠回收試劑盒回收， 用30ul鵬艦。
②質粒Pgenesil-l、 HK+HK、 DNA序列1+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4、基因
TP53的Nhel和BglH酶切
Q5fe用Nhel酶切
DNA 5ul
10 xM Buffer 2ul
Nhel lul H20 12ul
37。C^浴S^1夜。 各加入2ul5MNacl，混勻，再加入51ul酒精，混勻。—70。C職體30 miiU5000ipm離心15min^
用70%酒精洗滌沉淀兩次，然后各用17ul H20充分溶解。
辦用BglH酶切
上步反應物 17ul
10 xH Buffer 2ul BglH lul
37。C水浴反艦夜。
1 %Agarose 電泳，用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回M粒Pgenesil-l、 HK+HK、 DNA 序列l+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4、基因TP53 Nhel+BglH大片段。
③ 基因TP53分別與質粒Pgenesil-l、 HK+HK、 DNA序列l+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序 列1+2+3+4
Nhel+BglH酶切回收大片段的連接
其連接反應餅如下
回收TP53基因片段 4ul
回t&M申，切大片段 4ul
10 x Ligase Buffer lul T4DNALigase lul
22。C水浴反艦夜。
④ 各取5ul連接產鵬化感受態細胞DH5 a ，分別涂布矜Kanaf抗性的LB平敬匕37°C 恒溫培離咅養過夜。 ,
從齡培養皿上^t兆取3個單克隆m^種于3ml含Kanar抗性的LB培養液中，37t恒
齟娜t^夜。
⑥用試劑盒小量提M粒(中鼎公司)，并分另,Nhel+Bgffl做酶切鑒定 酶切反應綠.
DNA 7ul 10 xM Buffer 2ul Nhel 0.5ulBglH 0.5ul H20 lOul
37。C水浴反應3h. 2、用CX43基因分別割mii載體里的EGFP基因
① PCR擴增CX43基因分別以CX43-1、 CX43-2為上下游引物，以質粒PbluescriptR《x43 為豐鎌，90°C 45s 58°C 45s 72°C 60s 30 cycles PCR擴增CX43基因。
10xPCR Buffer 5ul 10mMdNTPMix 2ul 1隨CX43隱1 lul l隨CX43-2 lul TaqHS 0.5ul PbluescriptR"Cx43 0.5ul H20 40ul
PCR反鵬束后，1 %Agarose ;繊電泳回收目的CX43基因片段，用膠回收試劑盒回收， 用30ulH20 i 。
② 質粒Pgenesil-l、 HK+HK、 DNA序列l+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4、基因 CX43的Nhel和Xhol酶切
DNA 5ul
10 xM Buffer 2ul
Nhel lul
H20 12ul
37。C^C浴反艦夜。
各加入2ul5MNacl，混勻，再加入51ul酒精，混勻。
—70。C》錄t^a 30 miiU5000rpm離心15min^
用70%酒精洗滌沉淀兩次，然后各用17ulH20充分溶解。
②再用XhoI酶切
上步破物 17ul
10 xH Buffer 2ul Xhol lul
1537。C^C浴反艦夜。
1 % Agarose凝膠電泳，用膠回收i式劑盒(中鼎公司)分別回收質粒Pgenesil-1 、 HK+HK、 DNA 序列1+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列l+2+3W、基因CX43 Nhel+Xho1酶切大片段。 ③基因CX43分別與質粒Pgenesil-l、 HK+HK、 DNA序列l+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序 列1+2+3+4
Nhel+Xho1酶切回收大片段的連接
其連接反應餅如下
回收CX43基因片段 4ul
回頓,切大片段 4ul
10 x Ligase Buffer lul
T4DNALigase M
22。C水浴反艦夜。
④ 各取5ul連接^轉化感受態細胞DH5 a ，分別涂布矜Kanar抗性的LB平feJ:， 37°C 恒溫培養箱培微夜。
⑤ 從^H錄皿上^t兆取3個單克隆^^種于3ml含Kanar抗性的LBi咅鎌中，37'C恒 溫搖床培養過夜。
⑥ 用試劑盒小量提M粒(中鼎公司)，將別用Nhel+XhoI做酶切鑒定
酶切反應餅
DNA 7ul
10 xM Buffer 2ul
Nhel 0.5ul Xhol 0.5ul H20 編
37。C^C浴反應3h 3、用PTEN基因分別替f^^體里的EGFP基因
①合成DNA引物片段tdEGFP-l、 tdEGFP-2的退火
分別用50ul annealing buffer溶解20D的tdEGFP-l 、 tdEGFP-2 DNA弓|物對應各取2ul (即2ul tdEGFP-l+2ul tdEGFP-2) +16ul annealing buffer混勻 94。C退火自然7細輕溫。 取M退^物+99ul H20做100倍##
② 質粒PgenesiM、 HK+HK、 DNA序列1+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4的NheI 和XhoI酶切
微用NheI酶切
DNA 5ul
10 xM Buffer 2ul
Nhel lul H20 12ul
37。C^C浴反磁夜。
各加入2ul5MNacl，混勻，再加入51ul酒精，混勻。
—70。C職方燈30 miiU5000ipm離心15min^
用70%酒精洗滌沉淀兩次，然后各用17ul H20充分溶解。
鵬用XhoI酶切
上步鵬物 17ul
10 xH Buffer 2ul Xhol lul
37T^JC浴反磁夜。
1 % Agarose ; 電泳，用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回iW粒Pgenesil-l 、 HK+HK、 DNA 序列l+2、 DNA序列1+2+3、 DNA序列1+2+3+4 Nhel+Xhol酶切大片段。
③ 稀糊^tl tdEGFP分別與賺Pgenesil-l 、 HK+HK、 DNA序列1+2、 DNA序列1+2+3 、 DNA序列1+2+3+4 Nhel+Xhol酶切回收大片段的連接
其連接反應餅如下
^ii^tl tdEGFP 4ul 回M^K切大片段 4ul10 xLigase Buffer lul T4DNALigase M
22。C7條反艦夜。
④各取5ul連接產鵬化感受態細胞DH5 a ,分別涂布矜Kanar抗性的LB平fei:， 37°C 恒溫培養箱培養過夜。
從^t培養JULh^t兆取3個單克隆離接種于3ml含Kanar抗性的LB培鎌中，37'C恒
溫搖形歸過夜。
◎用試劑盒小量提M粒(中鼎公司)，并分別用NM+XhoI做酶切鑒定 酶切反應餅
DNA 7ul
10 xM Buffer 2ul
Nhel 0.5ul Xhol 0.5ul H20 編
37X^浴反應3h..
其亞克隆成功的質粒分別命名為質粒tdPgenesil-l、 tdHK+HK、 tdDNA序列l+2、 tdDNA 序列1+2+3、 tdDNA序列l+2+3M ⑦PCR擴增PTEN基因分別以PTEN-1 、 PTEN-2為上下游弓l物，以質粒pGz21 &Xz-PTEN 為賺，90°C 45s 55°C 45s 72°C 60s 30cycles PCR擴增PTEN基因。 PCR反應餅
PCR Buffer 5ul lOmMdNTPMix 2ul
l隨PTEN-l lul
10uMPTEN匿2 lul
TaqHS 0.5ul
pGz21&Xz-PTEN 0.5ul
H20 40ul
PCRfe!^束后，1 % Agarose ;繊電泳回收目的PTEN基因片段，用膠回收試劑盒回收， 用30ulH20 。
⑧質粒tdPgenesil-1 、 tdHK+HK、 tdDNA序列1+2、 tdDNA序列1+2+3、 tdDNA序列1+2+3+4、基因PTEN的Kpnl和Xhol酶切:
DNA 5ul
10xLBuffer 2ul
Kpnl lul
H20 12ul
37X^K浴SiSai夜。
各加入2ul5MNacl，混勻，再加入5M酒精，混勻。
—70。C職方燈30 miiU5000rpm離心15mii^
用70%酒精洗滌沉淀兩次，然后各用17ul H20充分溶解。
辦用XhoI酶切
上步反應物 17ul
10 xH Buffer 2ul Xhol M
37。C水浴反艇夜。
lXAgaroseMK電泳，用膠回收試劑盒(中鼎公司)分別回TO粒tdPgenesil-l、 tdHK+HK、 tdDNA序列1+2、 tdDNA序列1+2+3、 tdDNA序列1+2+3+4、基因PTEN Kpnl+Xho1
大片段。
⑨基因PTEN分別與質粒tdPgenesil-l、 tdHK+HK、 1dDNA序列l+2、 tdDNA序列1+2+3、 tdDNA序列l+2+3W Kpnl+Xho1酶切回收大片段的連接
其連接反應餅如下
回收PTEN基因片段 4ul
回M粒酶切大片段 4ul
10 x Ligase Buffer lul
T4DNALigase M
22。C7K浴反腿夜。
⑩各取5ul連接J^^化感受態細胞DH5a，分別涂布矜Kanar抗性的LB平社，37°C
19恒溫i^fl培養過夜。
從^^培養皿上^t兆取3個單克隆離接種于3ml含Kanar抗性的LB培鎌中，37'C恒 溫搖鵬養過夜。
用試劑盒小量提頓粒(中鼎公司)，將另偶Kpnl+XhoI做酶切鑒定 酶切反應餅
DNA 7ul
10 xM Buffer 2ul
Kpnl 0.5ul Xhol 0.5ul H20 編
370K浴反應3h
實施例3 、 DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源PTEN或者p53或 者Cx43基g/Pgenesil-l質粒的療效實驗
材料施
一、 材料
1. Alif臓母細鵬細胞腦。
2. 轉染齊偽Lipofectamine2亂
3. BALB/c-nu (SPF)雌性裸小鼠，4^6周齡，體重15-18克，期0只，購自中國醫學科學院 醫學實驗物研娜實驗t/mW場。飼養餅SPF級無菌層鵬中，恒溫(22°C-25°C)、 恒濕(55±5%)飼養，所用食物和7娥滅菌處理。
二、 方法
1. 細胞培養
細胞基及培養斜牛含10T。FBS的DMEM培養基，培養基的總體積約為i歸瓶容積的1/10， 培#^牛為37°C， 5%C02翻閏線。
2. 瘤細脫懸液擬中
對數生長期的U251 ，母細M細,0.125Q/。^l^削七，1000rpmX10 ^H中常溫離心去上 清，以PBS離心洗滌2次;計算細鵬，調整細胞濃輕5 X 107/ml，將細脫懸浮于 清DMEM培鎌中，第iJ鵬脫懸液。然后用帶6甜頭的注射翻取細胞懸液200m1，接種于裸鼠雙側腋 部、鼠鼷部皮下。該組接種裸鼠3只，為第一代荷瘤裸鼠，用于再進行裸鼠腫瘤異條植。
3. 瘤組織鵬種
經細胞接種成功的移禾離(直徑約7mm)，進行裸鼠腫瘤異儲植。斷5^b死荷瘤裸鼠，在 無菌割牛下，解剖切鵬當大小棚中瘤組織，立即方M^JflL清DMEM中，修剪腫瘤組織，去除 月旨肪和柳中瘤組織，并用^ifDMEM洗滌，將其剪成lmm3大小的瘤組織塊#^種用。接 種前，用碘ST和75%乙醇消毒接種部位的艦，先用消毒的剪刀在要接種的裸鼠左側鼠鼷部艦 處剪一小口，而后用無菌鑷夾取一小瘤±央，沿^JK破口，入皮下接種。最后，75%乙醇消毒皮 膚破口。
4. 動物鄉
第一代荷瘤裸鼠的腫瘤鄉紐異條植，倉g在裸鼠中形成生^M穩定的腫瘤。本研^ffl穩 定鵬的第八代荷瘤裸鼠的皮下腫瘤作為瘤源。64只動物隨機分為8組，每組8只，分別是U251 對照組、空itM粒治療組(1)、單EGFR靶點的RNAi治療組(2)、 EGFR聯合PDGCB的RNAi 治療組(3)、 EGFR、 PDGCB和K-RAS^RNAi治療組(4)、 EGFR、 PK3CB和KRAS^ RNAi與Cx43聯合治療組(5)、 EGFR、 PK3CB和KRAS ^ RNAi與p53聯合治療組(6)、 EGFR、 PK3CB和KRASi^RNAi與PTEN^治療組(7)。
5. 療效i離
1)治療時機的選銀
瘤組織i^^種約兩周后，待皮下腫瘤^f只長至5(M00mm3時，即腫瘤直徑在5mm左右時， 原位ait質粒-Lipofectamine2000混，，進行腫瘤的治療實驗。
2)治;l ^法，時間間隔及劑量M—次治療開始，每四^it行一次治療，連續3次。具體 方法如下(1)濃度為2|ig^l的質粒5^1和10pl Lipofectamine2000混勻后，室^J文置30min。 (2) 裸鼠皮下腫瘤1~1.5011范圍內局部^|^鵬、酒精消毒。(3)無菌微量湖器吸取，g朗中瘤5證 左右m，皮下潛行到中瘤，多點緩慢激，每只裸鼠每次激總量為15^質粒-Lipofectamine2000 混恤6. 腫瘤生長情ME察瘤組織±^^種約一周后，可看到裸鼠皮下成瘤，每隔3天用游l^尺測
量一瀏中瘤的長徑(a)及寬徑(b)，腫瘤^R計算公式如下V氣ab2y2
7. 實驗結果與傳統鞭點和多靶點抑癌基因治療相比，基于RNAi技術、靶向EGFR信 號通珞的 ^基因治療的質粒在體外會濕著的提高基因治療的效果。
表3、不同治療會朋中瘤^f只增^dim平均值(mm3沃)
4天6天8天10天12天14天16天18天20天
第一組33.372745.39767 73795.6731113.1197131.1238257.0371346.6458462.(5841
第二組35 408242.119151.920257.891264.225892.7096134.1889173.439241.8206
第HM33.262539.160850.967666.441779.747(5105.3349137.3S25164.1943199.9723
第四組17.105218.124720.154421.985923.733230.143544.5卯170.6204103.0814
第五組27.972330.179134.31237 1(57841.482553.833581.255103.(5201141 3729
第六組12.955413.833415.582116 233216.750221.20429.743646.627562.3419
第七組10.750812.515912.783215.392515.3(54419.905328.24444.817467.0014
第一組Pgenesil-l對照質粒治療組
第Z^a:質粒DNA序列-1 、 DNA j^!j 2/ Pgenesil-l質粒治療組
第蓬質粒DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列3 Pgenesil-l質粒治療組
第四組質粒DNA序列-1、 DNA靜U2、 DNA序列3、 DNA序列4/Pgenesil-1質粒治療組
第5M:質粒DNA序列-1、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源Cx43基H/PgenesiM質粒治療組
第六組質粒DNA序列-1 、 DNA序列2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源PTEN Pgenesil-l質粒治療組
第憤賺DNA序列-1、 DNA劍2、 DNA序列3、 DNA序列4/人源p53/Pgenesil-1質粒治療組序列表
〈110〉天津醫科大學總醫院
〈120〉基于RNAi技術的多基因g基因治療的質粒載體
<腸8
〈210> 1
〈211〉 68
〈212〉 DNA
〈213〉 AX序列
<■> 1
gatccaggaa ttaagagaag caacatttca agacgatgtt gcttctctta attccttttt 60 tgaattca 68
<210> 2 <211> 69 〈212〉薩 <213> AX序列 <■> 2
gtccttaatt ctcttcgttg taaagttctg ctacaacgaa gagaattaag gaaaaaaact 60
taagttcga 69
<210> 3
〈211〉85
<212〉 DNA
23<213> AX序列 〈 3
gatccgcgtg atgagttgca cggtggaggt gaggttcaag acgcctcacc tccaccgtgc 60 aactcatcac gcttttttga gctca 85
〈210>4 <211〉 85 〈212〉 DNA 〈213〉 AX序列 <400>4
gcgcactact caacgtgcca cctccactcc aagttctgcg gagtggaggt ggcacgttga 60
gtagtgcgaa aaaactcgag ttcga 85
<210> 5
〈211〉 70
〈212〉 DNA
〈213〉 AX序列
<400> 5
gatccgtgga atgaaccact ggaatttcta tggaacaaat tccagtggtt cattccattt 60 tttgtcgaca 70
<210> 6 <211> 70〈212> DNA <213> AX序列 〈400〉 6
gcaccttact tggtgacctt aaagatacct tgtttaaggt caccaagtaa ggtaaaaaac 60 agctgttcga 70
〈210〉 7 <211> 69 <212> DNA <213〉 AX序列 〈400〉 7
gatccaggga ccagtacatg aggactttca agacgagtcc tcatgtactg gtcccttttt 60 ttgagctca 69
<210〉 8 〈211> 69 〈212> DNA 〈213〉 ADW 〈400> 8
gtccctggtc atgtactcct gaaagttctg ctcaggagta catgaccagg gaaaaaaact 60 cgagttcga 69
權利要求
1、一種基于RNAi技術的多基因聯合基因治療質粒載體，其特征是聯合應用2個以上RNAi序列，采用基因重組技術構建siRNA質粒載體為下述情況之一1)序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1為正義鏈、SEQ ID NO.2為反義鏈，SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈；2)序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1為正義鏈、SEQ ID NO.2為反義鏈，SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.5為正義鏈、SEQ ID NO.6為反義鏈；3)序列表中的SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈，SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.5為正義鏈、SEQ ID NO.6為反義鏈；4)序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1為正義鏈、SEQ ID NO.2為反義鏈，SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈，SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.5為正義鏈、SEQ ID NO.6為反義鏈；5)序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1為正義鏈、SEQ ID NO.2為反義鏈，SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈，SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.7為正義鏈、SEQ ID NO.8為反義鏈；6)序列表中的SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈，SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.5為正義鏈、SEQ ID NO.6為反義鏈，SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.7為正義鏈、SEQ ID NO.8為反義鏈；7)序列表中的SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.1為正義鏈、SEQ ID NO.2為反義鏈，SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.3為正義鏈、SEQ ID NO.4為反義鏈，SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.5為正義鏈、SEQ ID NO.6為反義鏈，SEQ IDNO.7/SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.7為正義鏈、SEQ ID NO.8為反義鏈。
2、 根據權利要求1所述的質粒載體，，征在于J^^《iM—種質粒載,切除EGFR后置 換成為PTEN、 p53赫Cx43。
3、 根據權利要求1或2戶腿的質粒載體，，征在于具有圖1戶標的物理圖譜。
全文摘要
本發明公開了一種基于RNAi技術的聯合基因治療質粒載體。目的是通過該質粒載體同時抑制人膠質瘤細胞EGFR、PI3K p110亞基和Kras等三種癌基因表達，同時恢復抑癌基因(如PTEN，或者Cx43，或者p53)的表達。具體應用方法是應用RNAi技術阻斷上述三種癌基因在膠質瘤細胞中的表達，并恢復抑癌基因(如PTEN，或者Cx43，或者p53)的表達。本發明提供了四組siRNA序列，并提供基于RNAi技術的聯合基因治療siRNA質粒的構建方法。本方法將癌基因的RNAi治療與抑癌基因的過表達治療聯合應用，將可以通過埋植、立體定位注射、靜脈注射和頸動脈注射等方法，實現抑制實人膠質瘤生長的效果。
文檔編號C12N15/63GK101492690SQ20081014569
公開日2009年7月29日 申請日期2008年8月13日 優先權日2008年3月4日
發明者康春生, 張安玲, 浦佩玉, 王廣秀, 賈志凡, 強 黃 申請人:天津醫科大學總醫院