專利名稱：：棉花專用復合抗重茬微生態制劑及其專用菌株與應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及棉花專用復合抗重茬微生態制劑及其專用菌株與應用。
背景技術：
：棉花是人民衣著、紡織工業的主要原料和出口創匯的重要產品，關系國際民生，意義重大。但是，近年來由于農業種植結構的調整，重茬種植現象十分普遍，使得棉花重荏病害普遍發生，棉花枯、黃萎病以及立枯病、猝倒病等苗期病害，尤以棉花枯萎病和黃萎病危害嚴重。棉花枯萎病和黃萎病(簡稱"兩萎病")，屬植物檢疫性病害之一。它是棉花病害中致病性強，危害損失較重，也是限制老棉區重病田高產穩產的重要病害。由于自從推廣雜交棉或抗蟲雜交棉以來，農業推廣單位放松了思想警覺，忽視對棉花"兩萎病"的檢疫制度，頻繁引調種子(特別在病疫區引調)，致使帶病種子迅速傳播蔓延，特別是長期連作的老棉田，"兩萎病"已上升為棉花高產穩定的主要障礙因素，嚴重影響棉花生產的持續發展。一般年份發病率40%50%，嚴重年份發病率達70%以上，常年因"兩萎病"造成的損失在20%30%，嚴重年份可達60%以上，且棉花品質顯著下降。
發明內容本發明的目的是提供一種棉花專用復合抗重茬微生態制劑及其專用菌株與應用。本發明所提供的復合抗重茬微生態制劑，是以枯草芽孢桿菌KTBOOlCGMCCNo.2564和綠色木霉KTF001CGMCCNo.2562為活性成分的制劑。其中，所述枯草芽孢桿菌KTB001CGMCCNo.2564和綠色木霉KTF001CGMCCNo.2562的集落形成單位數目比為(10-30):(1-10)。所述枯草芽孢桿菌KTB001CGMCCNo.2564的芽孢的含量具體可為50億cfu/克制劑；所述綠色木霉KTF001CGMCCNo.2562的厚垣孢子的含量具體可為5億cfu/克制劑。本發明的復合抗重茬微生態制劑可以是固體或者液體制劑。可加入吸附劑將所述復合抗重茬微生態制劑制成固體制劑，所述吸附劑具體可為輕質碳酸鈣和/或草炭。所述固體制劑的粒度優選為0.09mra。本發明的復合抗重茬微生態制劑所選用的菌株是從棉花重茬病重田的健康植株體內和根內篩選出的高效微生物菌株，采用現代生物工程技術加工制備而成的微生態制劑，具有防病增產的效果。經田間試驗，本發明的復合抗重茬微生態制劑能夠有效控制棉花立枯病、枯萎病和黃萎病的發生，防治效果分別達到44.8%、50.4%和61.9%，死亡苗數下降；且該復合抗重茬微生態制劑還有促生增產的作用效果，且增產效果顯著，達到15.6%。此外，還可以改善棉花品質，絨長、衣分均有所提高。所以，在棉花上使用本發明的復合抗重茬微生態制劑是一項投資小、效益高、無污染的高產穩產的新措施，很好的緩解了棉花多年重茬難以解決的問題，可大面積推廣應用。這不僅可以減少化肥和農藥的使用量，而且降低化肥和農藥的污染及其有害物質的殘留。因此，本發明的復合抗重茬微生態制劑，不僅有利于增加棉花產量，提高棉花品質，增強棉花抗逆性等功效，而且還可以改良土壤，減少環境污染，為今后生產優質棉花提供保障。具體實施例方式實施例l、復合抗重茬微生態制劑的制備1.控制棉花重茬病的菌株的獲得從棉花重茬重病田的健康植株體內和根中分離篩選獲得2株控制棉花重茬病的高效菌株——綠色木霉(7」ri'c力oofei7!7aWriWe)KTF001和枯草芽孢桿菌(Saci7hss曲DKTBOOl。綠色木霉(rWc力oflferaaw'nWe)KTF001和枯草芽孢桿菌(&ciW^wZti7is)KTB001的分離和篩選方法如下(1)分離綠色木霉分離平板培養基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，加水1000ml，丙酸鈉lg。然后分裝克氏瓶或試管，置于滅菌鍋內，在O.llMPa壓力，121"下滅菌30min，冷卻后制成斜面備用。枯草芽孢桿菌分離平板培養基(牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基)牛肉膏0.3g/100ml，蛋白胨O.5g/100ml，NaCl0.5g/100ml，瓊脂2g/100ml。將瓊脂加熱溶化后用NaOH或Hcl調pH值至7.0-7.2,然后分裝克氏瓶或試管，置于滅菌鍋內，在0.llMPa壓力下滅菌30min，冷卻后制成斜面備用。在棉花重茬重病田選擇健康植株的根、莖、葉等組織，用蒸餾水沖洗干凈，用70%的酒精浸30s，然后用2g/100mlNaClO處理15min，無菌水沖洗3次，最后一次無菌水沖洗液涂營養瓊脂(NA)平板，28。C培養3-5d，檢測表面滅菌是否徹底，每處理3次重復。取經檢驗表面滅菌徹底的材料剪碎，取lg加適量無菌水研碎，將上清液稀釋到10—、振蕩均勻(枯草芽孢桿菌上清液放入80。C的水中處理20分鐘)，梯度稀釋到10—3，取0.1ml分別接種到綠色木霉分離平板培養基和枯草芽孢桿菌分離平板培養基上，涂布均勻。置于28-30。C恒溫箱中培養3-5d，待單菌落長出后，純化，轉管，保存。(2)篩選分別接種棉花重茬病原菌(棉花枯、黃萎病以及立枯病、猝倒病的病原菌)于PDA平板中央，將待測木霉和芽孢桿菌接種于平板四周，每皿在4個方位各接種1株，重復3次，進行初篩；取拮抗性明顯的菌株，再進行單株與病原菌對峙培養，采取一邊接木霉或芽孢桿菌，一邊接病原菌的對峙培養法進行復篩。結果得到2株對棉花重茬病原菌具有拮抗作用的菌株，命名綠色木霉KTF001和芽孢桿菌KTBOOl。綠色木霉KTFOOl和枯草芽孢桿菌KTBOOl的鑒定方法如下綠色木霉KTF001在PSA平板上，菌落初呈白色絨狀，后期出現輪狀的菌絲密實產孢區，顏色為綠色至深綠色，分生孢子梗呈環狀排列次級分枝單個或以2-3個為一組，大角度伸出，分枝彎曲或波狀，瓶頸基部縊縮，中部較寬，從中部以上變窄形成長頸，產孢細胞大小為長8.0-12.0微米，寬2.5-3.0微米，分生孢子呈球形，表面有刺，大小為2.5-4.8微米，經形態學鑒定綠色木霉KTFOOl為綠色木霉(Wc力c^ei7a3K2>_zU。提取枯草芽孢桿菌KTB001的基因組DNA，分別以530F和1494R，67F和1387R為引物對進行PCR擴增，530F:5'GTGCCAGCMGCCGCGG3'，1494R:5'GGYTACCTTGTTACGACTT3';67F:5，CAGGCCTAACACATGCAAGTC3'，1387R:5'GGGCGGTGATGTACAAGGC3'。引物對530F/1494R擴增出約l-kb的片段，引物對67F/1387R擴增出約1.3kb的片段，將得到的DNA純化后，連接到pMD-18T載體上，轉化大腸桿菌DH5a，藍白斑篩選，得到含有插入片段的轉化子，進行iboRI和歷V^III酶切驗證，測序，拼接所得到的序列，BLAST比對結果發現KTBOOl與枯草芽孢桿菌的16SrDNA的序列保持很高的同源性(96%以上)，分析細菌的16SrDNA的系統發生樹狀圖也確定了此菌株的初步分類學的地位，與BLAST比對結果保持一致，在此基礎上，進行屬內的各種生理、生化指標的檢測，KTB001菌體桿狀，長2-3微米，寬0.8-0.9微米，革蘭氏反應陽性，芽孢橢圓或柱狀，中生或近中生，孢囊不膨大，原生質中不含有P-羥基丁酸鹽顆粒；7g/100ralNal中生長，石芯牛奶不產酸，pH5.7生長，v.p陽性，水解淀粉，可產酸，與葡萄糖反應產氣，N(V還原N02—，不能厭氧生長，接觸酶陽性，與同種其它菌株相比菌體較寬。枯草芽孢桿菌KTBOOl為枯草芽孢桿菌綠色木霉(7>j'c/c^e/7ffaKTF001已于2008年06月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.2562。枯草芽孢桿菌(勘cW^ASM力z^7&)KTB001已于2008年06月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為CGMCCNo.2564。2.復合抗重茬微生態制劑的制備復合抗重茬微生態制劑經液體深層發酵法制成粉劑，主要步驟為原菌種活化一菌種擴大培養一種子罐培養一發酵罐培養一后處理。A.原菌種活化和菌種擴大培養(1)枯草芽孢桿菌(^Saci"iAs卯Z"2i's)KTB001CGMCCNo.2564培養基制備牛肉膏O.3g/100ml，蛋白胨O.5g/100ml，NaCl0.5g/100ml，瓊脂2g/100ml。將瓊脂加熱溶化后用NaOH或HCl調pH值至7.0-7.5，然后分裝克氏瓶或試管，置于滅菌鍋內，在12卜125。C，0.11-0.14MPa壓力下滅菌30min，冷卻后制成斜面備用。(2)綠色木霉(7^'c力oofer鵬w'nVe)KTF001CGMCCNo.2562培養基制備PDA培養基，然后分裝克氏瓶或試管，置于滅菌鍋內，在121-125°C，0.11-0.14MPa壓力下滅菌30min，冷卻后制成斜面備用。(3)菌種活化與擴大培養用培養基在無菌條件下從原菌種斜面上挑取少許菌苔，置放試管斜面內進行劃線，然后置28-3(TC溫箱內培養，枯草芽孢桿菌(5acj77wswZz^h\s)KTB001CGMCCNo.2564培養24h，綠色木霉(7^'c力oder/A3w'wVe)KTF001CGMCCNo.2562培養48h，經檢査無雜菌、菌體生長整齊；最后置28-30。C溫箱內培養，枯草芽孢桿菌(^g""^幼/z^7A)KTB001CGMCCNo.2564培養24h，綠色木霉(7^'c力od/er鵬w'nVe)KTF001CGMCCNo.2562培養48h，肉眼觀察，菌苔豐滿，涂片、染色檢査無雜菌，孢子整齊，作為發酵生產的菌種。B.種子罐培養(1)枯草芽孢桿菌(j^ci'L"ss^fi7i's)KTB001CGMCCNo.2564種子罐培養基豆餅粉0.5g/100ral、魚粉0.3g/100ml、玉米粉0,5g/100ml、葡萄糖0.3g/100ml，豆油0.2-0.3g/100ml或泡敵0.3g/100ml，pH值7.0-7.5。(2)綠色木霉(r—r/cAocferazaw>2^e)KTF001CGMCCNo.2562種子罐培養基蔗糖21g/L，牛肉膏3g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂1.5g/L，用Na0H或HC1調pH值至6.0-6.5。(3)空發酵罐滅菌發酵罐使用前清洗干凈，排除污物，在121-125"，0.11-0.14MPa下，滅菌30min。(4)種子罐裝料分別按照(1)和(2)的培養基裝料，投料量不超過罐容積70%。(5)種子罐滅菌裝好料后，在121-125°C，0.11-0.14MPa下，滅菌30min，冷卻至3(TC后即接種。(6)懸浮液制備在無菌條件下將每個克氏瓶斜面菌種加100ml無菌水，把菌苔刮下制成孢子懸浮液。(7)接種將(6)制備的綠色木霉(7^'c力oofei7i7awhVe)KTF001CGMCCNo.2562或枯草芽孢桿菌(&"7kKTB001CGMCCNo.2564的懸浮液，按1%的比例接種于冷卻至3(TC的種子罐內進行培養。(8)種子罐培養枯草芽孢桿菌(萬ac^/hs幼力z^7A)KTB001CGMCCNo.2564接種后在溫度為28-3CTC，轉速220rpra攪拌條件下，培養8-10h;綠色木霉(7Wc/ooferaaw>_zVe)KTF001CGMCCNo.2562接種后在溫度為29-30°C轉速160rpm，培養3-4天。C.發酵罐發酵(1)枯草芽孢桿菌(萬a"W^OT/;"h's)KTB001CGMCCNo.2564發酵罐培養基玉米粉15g/L，黃豆餅粉20g/L，魚粉5g/L，淀粉4g/L，CaC0310g/L，K2HPa,1.0g/L，MgS0,7H200.lg/L，(NH4)2S04lg/L，ZnS048H200.5g/L，用NaOH或HC1調PH值7.0-7.5。(2)綠色木霉(7^'c力oofer鵬FiwVe)KTF001CGMCCNo.2562發酵罐培養基蔗糖21g/L，牛肉膏3g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂1.5g/L，用NaOH或HC1調pH值至6.0-6.5。(3)空發酵罐滅菌發酵罐使用前清洗干凈，排除污物，溫度121-125'C，壓力0.11-0.14Mpa，滅菌30min。(4)發酵罐裝料分別按照(1)和(2)的培養基裝料，投料量不超過罐容積70%。(5)發酵罐滅菌裝好料后，溫度121-125。C，壓力0.11-0.14Mpa下滅菌30min，冷卻至3(TC后即接種。(6)接種將種子罐培養的綠色木霉(7^'c力ode/7^KTF001CGMCCNo.2562或枯草芽孢桿菌(^aci""s卯/7"h's)KTB001CGMCCNo.2564菌液按發酵培養基量的lml/100ml接種于冷卻至3(TC的發酵罐內進行培養。(7)發酵培養枯草芽孢桿菌(^3ciW^犯力&7j's)KTB001CGMCCNo.2564發酵攪拌速度180-200轉/min，罐壓0.05MPa;通氣量(每分鐘進出體積之比)1:1.3;發酵培養周期為12-18小時，在芽孢70%形成，個別芽孢開始脫落時，即放罐，這時雜菌污染<0.3%含菌量〉1.0Xl(VVfu/g;綠色木霉(7yic/oofer鵬Ki>iWe)KTF001CGMCCNo.2562發酵攪拌速度160轉/min，罐壓O.lMPa;流量50L/min，發酵培養周期為3-4天，厚垣孢子70%形成，即可放罐，這時雜菌污染〈0.3%含菌(厚垣孢子)量〉5.0X10Scfu/ml。D.后處理(l)吸附劑枯草芽孢桿菌采用粒度為0.09ran的輕質碳酸鈣為吸附載體，綠色木霉采用普通草炭為吸附載體，加入量分別按下列公式計算。發酵液體積X發酵液含菌量芽孢桿菌吸附劑的量=-X80%—(1/2投入的吸附載50億cfu/g體總量)發酵液體積X發酵液含菌量綠色木霉吸附劑的量=-X80%—(1/2投入的吸附載5億cfu/g體總量)(2)壓濾按(1)計算的量向C中步驟7得到的發酵液中加入吸附劑，機械攪拌3-6h，使芽孢或/和孢子全部被吸附，然后再用板框壓濾。(3)干燥將板框壓濾后的濾餅搗碎后，置于烘干機或烘干裝置內進行烘干，烘干時的溫度不超過4(TC(為了防止菌體死亡)，要不斷翻動，使受熱均勻，當含水率《5%時，即可進行粉碎。(4)粉碎高細度粉碎機(0.09mm孔徑篩)粉碎，制成枯草芽孢桿菌(i9a"l/〃s卯Z&7A)KTB001CGMCCNo.2564和綠色木霉(7^'c力oa^y^WnVe)KTF001CGMCCNo.2562固體制劑。(5)制備復合抗重茬微生態制劑綠色木霉(7>i'c/ofiferaA3w'r2Ve)KTF001CGMCCNo.2562和枯草芽孢桿菌幼力"7A)KTB001CGMCCNo.2564固體制劑按1:1的質量比混合制備復合抗重茬微生態制劑，每克復合抗重茬微生態制劑含綠色木霉(7^'C力OOfe/7Z/3w'nVe)KTF001CGMCCNo.2562的厚垣孢子的含量為5億cfu/克，枯草芽孢桿菌(&ciL^KTB001CGMCCNo.2564的芽孢的含量為50億cfu/克。(7)成品檢驗用干燥失重法測定含水率，HG2-896標準的濕篩法測定細度。成品含水率《5%，且10(^通過0.()9mni篩為合格。檢驗結果表明步驟(6)制備的復合抗重茬微生態制劑的含水率為4%，100%能通過0.09mm篩，雜菌量《1%。(S)包裝用編制袋(內有塑料袋)25Kg包裝，于干燥通風處貯存，保存期3年。實施例2、復合抗重茬微生態制劑的制備復合抗重茬微生態制劑的制備方法同實施例1，不同之處僅在于綠色木霉(7ric/oofera7aw'wVe)KTF001CGMCCNo.2562和枯草芽孢桿菌KTB001CGMCCNo.2564固體制劑按10:3的質量比混合，制備防治棉花枯、黃萎病以及立枯病、猝倒病等病害的復合抗重茬微生態制劑，每克復合抗重茬微生態制劑中含有綠色木霉(7yic力oafer/MKinWe)KTF001CGMCCNo.2562的厚垣孢子的含量為50億cfu/克，枯草芽孢桿菌KTB001CGMCCNo.2564的芽孢的含量為150億cfu/克。實施例3、實施例1的復合抗重茬微生態制劑的棉花田間試驗效果選擇已有連續5年種植棉花歷史的試驗地，立枯病、枯萎病和黃萎病歷年發病均較重，試驗期間自然發生立枯病、枯萎病和黃萎病。選擇地勢平坦，土壤性狀一致，肥力均勻中等地塊種植棉花中棉所36號(新疆錦棉種業有限責任公司)設2個處理，處理l為分別在苗期和花期噴施實施例l的復合抗重茬微生態制劑各l次，每畝4千克；處理2為分別在苗期和花期噴施清水作為對照；每個處理設4次重復，共8個小區，隨機區組排列。每小區面積5畝。除施用復合抗重茬微生態制劑外，各小區其他管理一致，田間管理按當地習慣進行。每隔5畝的地塊中(即一次重復)進行田間調查，采用五點取樣法，每點取30株。棉花平頂后對株高、果枝層、單株結鈴、單鈴重等生物學性狀進行調查；于5月中旬、6月中旬、7月中旬分別對立枯病、枯萎病和黃萎病進行調查。記載調查株數及病株數，計算發病率，統計防治效果。發病率(％)二發病株數/調査總株數X100防治效果(％)=(對照區發病率-處理區發病率)/對照區發病率X100，計算防病效果、實收籽棉，計算產量和增產效果；并對棉花的品質絨長和衣分也進行了測定。實施例l的復合抗重茬微生態制劑對棉花病害的防治效果見表l，復合抗重茬微生態制劑能夠有效的降低死苗率，對棉花立枯病、枯萎病和黃萎病均有明顯的防治效果，防效分別達到44.8%、50.4%和61.9%，經SAS統計分析均達到顯著水平。表l復合抗重茬微生態制劑對棉花病害的防治效果<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例1的復合抗重茬微生態制劑對棉花生物學性狀的作用效果如表2，復合抗重茬微生態制劑對棉花的生長具有明顯的促生作用，株高、果枝層數、單株結鈴數、單鈴重分別增加10.0%、11.5%、14.3%和10.7%，經SAS統計分析均達到顯著水平。表2.復合抗重茬微生態制劑對棉花生物性狀的作用效果<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例1的復合抗重茬微生態制劑對棉花產量和品質的作用效果見表3所示，復合抗重荏微生態制劑對棉花有明顯的增產效果，增產率達到15.6%;品質也有提高，絨長略有增加，但不顯著，衣分率增加6.49%，經SAS統計分析產量和衣分均達到顯著水平。_表3.復合抗重茬微生態制劑對棉花產量和品質影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例4、實施例2的復合抗重茬微生態制劑的棉花田間實驗選擇已有連續6年種植棉花歷史的試驗地，枯萎病、黃萎病及紅腐病歷年發病均較重，試驗期間自然發生枯萎病、黃萎病及紅腐病。選擇地勢平坦，土壤性狀一致，肥力均勻中等地塊種植中棉所36號棉花，設2個處理，處理1為分別在苗期和花期滴灌施用實施例2的復合抗重茬微生態制劑各l次，每畝4千克；處理2為分別在苗期和花期滴灌清水作為對照；每個處理設4次重復，共8個小區，隨機區組排列。每小區面積5畝。除施用實施例2的復合抗重茬微生態制劑外，各小區其他管理一致，田間管理按當地習慣進行。每隔5畝的地塊中(即一次重復)進行田間調査，采用五點取樣法，每點取30株。棉花平頂后對株高、果枝層、單株結鈴、單鈴重等生物學性狀進行調査；于5月中旬、6月中旬、7月中旬分別對枯萎病、黃萎病及紅腐病進行調查。記載調查株數及病株數，計算發病率，統計防治效果。發病率(％)^發病株數/調査總株數X100防治效果(％)=(對照區發病率-處理區發病率)/對照區發病率X100同時計算防病效果、實收籽棉，計算產量和增產效果；并對棉花的品質絨長和衣分也進行了測定。試驗結果表明，實施例2的復合抗重茬制劑可增強棉花抗病能力，死苗率下降，對棉花枯萎病、黃萎病及紅腐病造成的爛鈴均有明顯的防治效果；其次對棉花株高、果枝層、總果節、單株鈴、單鈴重、畝總鈴數等均有明顯的作用效果，其中果枝層較對照增加10.8%，單株鈴數增加16.3%，畝總鈴數增加15.2%;增加產量，改善品質，籽棉產量增加11.8%、衣分率增加8.4%。權利要求1、一種復合抗重茬微生態制劑，是以枯草芽孢桿菌KTB001CGMCCNo.2564和綠色木霉KTF001CGMCCNo.2562為活性成分的制劑。2、根據權利要求1所述微生態制劑，其特征在于:所述枯草芽孢桿菌KTBOOlCGMCCNo.2564和綠色木霉KTFOOlCGMCCNo.2562的集落形成單位數目比為(10-30):(1-10)。3、根據權利要求2所述微生態制劑，其特征在于所述枯草芽孢桿菌KTBOOlCGMCCNo.2564的芽孢的含量為50億cfu/克制劑。4、根據權利要求2所述微生態制劑，其特征在于所述綠色木霉KTFOOlCGMCCNo.2562的厚垣孢子的含量為5億cfu/克制劑。5、根據權利要求3或4所述微生態制劑，其特征在于所述制劑為固體。6、根據權利要求5所述微生態制劑，其特征在于所述制劑的粒度為0.09mm。7、根據權利要求6所述微生態制劑，其特征在于所述制劑還含有吸附劑。8、根據權利要求7所述微生態制劑，其特征在于所述吸附劑為輕質碳酸鈣或草炭。9、枯草芽孢桿菌KTB001，其保藏編號為CGMCCNo.2564。10、綠色木霉KTF001，其保藏編號為CGMCCNo.2562。全文摘要本發明公開了一種棉花專用復合抗重茬微生態制劑及應用。本發明的復合抗重茬微生態制劑是以枯草芽孢桿菌KTB001CGMCCNo.2564和綠色木霉KTF001CGMCCNo.2562作為活性成分的制劑。其中，所述枯草芽孢桿菌KTB001CGMCCNo.2564的芽孢的含量為50億cfu/克制劑；所述綠色木霉KTF001CGMCCNo.2562的厚垣孢子的含量為5億cfu/克制劑。本發明的復合抗重茬微生態制劑，能夠預防和控制棉花苗期病害和枯黃萎病，而且還有增加棉花產量、提高棉花品質和增強棉花抗逆性等功效，有利于改良土壤和減少環境污染，為生產優質棉花提供保障。文檔編號C12N1/20GK101352177SQ20081014449公開日2009年1月28日申請日期2008年8月5日優先權日2008年6月30日發明者張云龍,琦王申請人:康坦生物技術(山東)有限公司