專利名稱：：一種人參多糖提取工藝的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及一種人參多糖的提取工藝，屬于中藥制劑領域。
背景技術(shù)：
：人參為五加科Araliaceae植物PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根，在我國有著悠久的藥用歷史，主要含有人參皂苷、人參多糖、人參多肽及揮發(fā)油、多種氨基酸、脂肪酸及維生素、微量元素等有效成分，國內(nèi)外對人參的活性成分的提取工藝和藥效研究始終非常活躍，特別是對于人參皂苷的報道較多見，但是近年來隨著分析手段的逐步提高，對于人參多糖的研究也取得了較大的進展。人參多糖為中藥人參的活性成份，為高分子葡聚糖。人參多糖具有增強機體免疫調(diào)節(jié)功能及增強化療藥物抗腫瘤作用，對腫瘤有明顯的抑制作用。實驗表明，人參多糖能誘生腫瘤壞死因子和干擾素-Y，對腫瘤細胞有殺傷和抑制作用。腫瘤壞死因子是由激活的巨噬細胞/單核細胞系統(tǒng)產(chǎn)生的多功能蛋白分子，在機體內(nèi)起著重要的生理作用。在體內(nèi)腫瘤壞死因子可以通過三種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用直接殺傷腫瘤細胞；作用于腫瘤血循環(huán)，導致腫瘤組織血供減少，從而影響腫瘤的生長；激活機體免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用。同時，腫瘤壞死因子還可介導炎性過程，減少網(wǎng)膜組織間皮細胞溶纖維蛋白活性，進而使網(wǎng)膜表面纖維蛋白增多，減少組織外滲。干擾素是細胞在受到刺激物作用后合成并釋放出的蛋白性淋巴因子，其作用為直接抗病毒作用；增強主要組織相容性抗原和腫瘤相關抗原的表達；增強自然殺傷細胞(NK)的細胞毒作用；增強抗體依賴性細胞的細胞毒作用；直接的抗細胞增殖作用和抗血管生成作用。同時人參多糖能增強T淋巴細胞及NK細胞活性，提高了機體的免疫調(diào)節(jié)功能，而有利于抗腫瘤作用的發(fā)揮。其次，人參多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以用于治療病毒性流感。人參多糖具有顯著增強單核吞噬細胞系的功能，人參多糖可明顯增加巨噬細胞的吞噬指數(shù)。人參多糖能促進抗體和補體的形成，可以顯著增加血清補體和血清IgG的含量。目前國家食品藥品監(jiān)督管理局批準生產(chǎn)的人參多糖注射液只有肌肉注射給藥途徑。沒有批準靜脈注射給藥途徑主要原因是現(xiàn)有的人參多糖提取、分離、純化技術(shù)所制得原料純度不高，存在一定安全隱患。肌肉注射存在的主要問題是生物利用率低，患者注射部位疼痛及長期注射可能出現(xiàn)局部紅腫、淤血、腫塊、甚至肌肉壞死等不良反應。專利ZL200410000209.4公開了一種人參多糖的制備方法，其提純方法為A)取人參，加入815倍重量水，煎煮23次，每次煎煮時間為30卯分鐘，合并煎液，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的0.10.4倍；加入95%的乙醇使?jié)饪s液含醇量為6585%，08。C冷藏靜置1248小時，將冷藏后的藥液用離心機低溫離心2040分鐘(離心轉(zhuǎn)速為30004000轉(zhuǎn)/分)，收集沉淀，沉淀低溫干燥得人參多糖粗品；B)人參多糖粗晶加1015倍重量水加熱煮沸1030分鐘，降溫，過濾，向濾液中加入95%的乙醇使含醇量為6585%，08'C冷藏靜置1248小時，將冷藏后的藥液用離心機在08"C下離心20—40分鐘(離心轉(zhuǎn)速為30004000轉(zhuǎn)/分)，收集沉淀；重復水煮醇沉、冷藏離心過程23次，得到人參多糖沉淀；人參多糖沉淀加1020倍重量水溶解，藥液用冷凍離心機在-10-3(TC凍實后，在08。C下融解離心2030分鐘(離心轉(zhuǎn)速為30004000轉(zhuǎn)/分)，取上清液，上清液重復凍融離心12次后，將上清減壓，減壓濃縮，在08r下干燥得到人參多糖精品。此提純方法僅采用了多次水煮醇沉、過濾離心除雜，再經(jīng)凍融離心、多次除雜蛋白，離心得上清液，再經(jīng)減壓濃縮、低溫干燥的人參多糖精品。此方法不僅步驟繁瑣復雜，回收率低，實施例中的回收率僅為0.450.5%，而且制得的人參多糖的純度不高。專利申請200610034728.1公開了一種注射用人參多糖凍干粉及其制備工藝，其中人參多糖提取工藝步驟為A)采集鮮人參的根部，洗凈，粉碎，過篩，加水浸泡過夜，晾干，用乙醇浸漬提取或者回流提取至少5次；B)將藥渣揮發(fā)去盡乙醇后，加水浸泡，加熱至沸騰，保持微沸提取至少5次；C)合并提取液，濃縮，加入乙醇至少提取三次，至醇濃度為80—90%，收集沉淀，用無水乙醇浸洗1一2次，得到粗人參多糖；D)再經(jīng)葡聚糖凝膠柱或者聚酰胺柱分離純化，用水洗脫，洗脫液濃縮，再用乙醇沉淀，沉淀用無水乙醇浸洗1一2次，得到精品人參多糖。此專利申請在醇提和水提的基礎上采用了葡聚糖凝膠柱或者聚酰胺柱的分離純化，但所含雜質(zhì)仍然比較多，人參多糖的含量僅為75%，不能完全適應臨床需要。上述授權(quán)或公開的專利所采用的人參多糖提取工藝，人參多糖含量均未達到《中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求》(國食藥監(jiān)注[2007]743號)關于"有效成份制成的注射劑，主藥成份含量應不少于90%。多成份制成的注射劑，所測成份應大于總固體量的80%"的質(zhì)量標準。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種過程簡單、操作方便的人參多糖提取、分離和純化方法，所制得的人參多糖符合國家現(xiàn)行中藥注射劑質(zhì)量標準，可用于制備靜脈注射人參多糖注射劑，為臨床提供一種新的給藥途徑，克服了肌肉注射生物利用率低，不良反應多等缺點。本發(fā)明的人參多糖提取工藝，在已有技術(shù)基礎上增加了酶解、脫色及除蛋白的工藝步驟，最大限度的去除了淀粉和色素，并且通過Sevage法去除了人參多糖經(jīng)過醇沉后存在的少量蛋白質(zhì)。Sevage法去蛋白的優(yōu)點是條件溫和，不會引起多糖的變性。人參多糖制成注射劑臨床上肌肉注射或者靜脈注射，若注射液中存在人參中的異體蛋白質(zhì)會使人體發(fā)生過敏反應。其次，本發(fā)明采用了葡聚糖樹脂、交聯(lián)瓊脂糖凝膠、快流速瓊脂糖凝膠為載體柱層脫色分離的提純方6法，采用洗脫液梯度洗脫，使得人參多糖的純度明顯提高，產(chǎn)率增加。Sevage法是利用蛋白質(zhì)在三氯甲烷等有機溶劑中變性的特點，將提取液與Sevage試劑5:1混合，振蕩，離心，變性后的蛋白質(zhì)介于提取液與Sevage試劑交界處。Sevage試劑為氯仿與正丁醇體積比為5:1配制而成。本發(fā)明所述的人參多糖的分離、純化方法，包括以下步驟-(1)粉碎選取生曬參，過10100目篩；(2)醇提使用10100%的乙醇回流反應310小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為l:211，過濾，將固體產(chǎn)物自然風千；(3)水提向上述風干的固體產(chǎn)物中加入其固體產(chǎn)物28倍體積的水，于60IIO'C回流反應15小時得水提物；(4)醇沉:將上述水提物于359(TC減壓濃縮成密度為1.021.1的液體，用40100%的乙醇醇沉，室溫放置1048小時，離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶后，再加入80100%的乙醇醇沉放置1048小時，離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，置于8595。C保溫2040分鐘；加1020%活性炭90110。C回流3045分鐘脫色、離心；取上清液Sevage法脫蛋白，重復35次，取水層濃縮、離心、千燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離采用葡聚糖凝膠樹脂、交聯(lián)瓊脂糖凝膠、快流速瓊脂糖凝膠中的一種為載體，將上述棕褐色粉末和載體按1:10100克上樣，采用不同濃度的洗脫液梯度洗脫，將洗脫液濃縮，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到人參多糖。本發(fā)明所述的人參多糖提取工藝優(yōu)選為-(1)粉碎選取生曬參，過1080目篩；(2)醇提使用5075%的乙醇回流反應48小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為l:711，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干；(3)水提向上述風干的固體產(chǎn)物中加入其固體產(chǎn)物58倍的水，于8011(TC回流反應35小時得水提物；(4)醇沉將上述水提物于5590。C減壓濃縮成密度為1.021.1的液體，用50100%的乙醇，沉室溫放置1040小時，離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶后再加入80100%的乙醇醇沉放置1040小時，離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，置于9095°C保溫2030分鐘；加入精制糖提取物重量1520%的活性炭95110°。回流3040分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復45次，取水層濃縮、離心、千燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離釆用葡聚糖凝膠樹脂、交聯(lián)瓊脂糖凝膠、快流速瓊脂糖凝膠中的一種為載體，將上述棕褐色粉末和載體按1:10100克上樣，采用不同濃度的洗脫液梯度洗脫，將洗脫液濃縮，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到人參多糖。其中，選用的生曬參為45年齡的人參。其中，選用的淀粉酶為a-淀粉酶，添加的比例為每克粗糖提取物添加llU淀粉酶。其中，步驟(6)中采用的洗脫液為Tris緩沖液，醋酸溶液，醋酸銨溶液，磷酸鹽緩沖液，氯化鈉溶液其中的一種。其中，步驟(6)中采用的載體為纖維素DEAE-52、瓊脂糖凝膠SephadexG-25、SephadexG-75、SephadexG-100中的一種，交聯(lián)瓊脂糖凝膠載體為SepharoseCL-4B、SepharoseCL-6B中的一種，快流速瓊脂糖凝膠載體為Sepharose4FF、Sepharose6FF、Q-SepharoseFF的一種。本工藝采用酶解、脫色及除蛋白，柱層脫色分離，梯度洗脫，克服了已有技術(shù)中參多糖提取工藝的不足，人參多糖的純度(苯酚硫酸法)可以達到96.5。/。以上，符合國家現(xiàn)行標準可用于靜脈注射。而且產(chǎn)率高，成本低，反應條件易于控制。本發(fā)明所具有的技術(shù)優(yōu)勢為1.人參多糖分離、純化技術(shù)可靠，操作步驟簡單，條件易于控制，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。2.所制得的人參多糖純度高、安全性好，含量達96.5%以上，符合《中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求》(國食藥監(jiān)注[2007]743號)關于"有效成份制成的注射劑，主藥成份含量應不少于90%。多成份制成的注射劑，所測成份應大于總固體量的80%"的質(zhì)量標準。3.所制得的人參多糖用于制備靜脈注射人參多糖注射劑，具有生物利用度高，臨床使用方便、安全有效、不良反應少等優(yōu)點。具體實施例方式實施例l:(1)選取生曬參，粉碎，過80目篩(2)醇提使用50%的乙醇回流反應4小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為1:7，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干，其中的醇提物可用于回收皂苷；(3)水提將上述固體產(chǎn)物溶解于其5倍體積的水中，于80。C回流反應3小時得水提物，其固體廢渣可用做詞料等；(4)醇沉將上述水提物于55X:減壓濃縮成密度為1.02-1.1的液體，用70%的乙醇室溫放置10小時，2000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶，再用卯％的乙醇醇沉放置10小時，2000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白按每克精制糖提取物添加1lUa-淀粉酶，置于9(TC保溫30分鐘；加精制糖提取物重量15%的活性炭ll(TC回流40分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復4次，取水層濃縮，離心，干燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離采用纖維素DEAE-52為載體，將上述棕褐色粉末和載體按重量比1:100上樣，先以0.02mol/L醋酸銨洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到100流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；繼續(xù)以0.3mol/L醋酸銨洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到80流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，黃白色至棕黃色粉末；最后以0.5mol/L醋酸銨洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到70流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黃白色至棕黃色粉末；將三個部分人參多糖合并得到人參多糖成品，經(jīng)苯酚硫酸法測定，人參多糖的純度為95.3%。實施例2(1)粉碎選取生曬參，過10目篩；(2)醇提使用10%的乙醇回流反應3小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為1:2，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干；(3)水提將上述固體產(chǎn)物溶解于其2倍體積的水中，于60'C回流反應3小時得水提物，其固體廢渣可用做飼料等；(4)醇沉將上述水提物于35'C減壓濃縮成密度為1.021.1的液體，用40%的乙醇室溫放置10小時，3000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶，再用80%的乙醇醇沉放置10小時，3000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白按每克精制糖提取物添加ltUa-淀粉酶，置于95。C保溫30分鐘；加精制糖提取物重量15%的活性炭95'C回流30分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復5次，取水層濃縮，離心，干燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離采用葡聚糖凝膠樹脂SephadexG-25為載體，將上述棕褐色粉末和載體按重量比l:90上樣，先以0.02mol/L醋酸銨洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10至ljl00流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，黃白色至棕黃色粉末；繼續(xù)以0.3mol/L醋酸銨洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到80流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，黃白色至棕黃色粉末；最后以0.5mol/L醋酸銨洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到70流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黃白色至棕黃色粉末。將三個部分人參多糖合并得到人參多糖成品，經(jīng)苯酚硫酸法測定，人參多糖的純度為95.7%。實施例3(1)選取生曬參，粉碎，過IOO目篩；(2)醇提使用100%的乙醇回流反應IO小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為1:11，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干，其中的醇提物可用于回收皂苷；(3)水提將上述固體產(chǎn)物溶解于其8倍體積的水中，于11(TC回流反應5小時得水提物，其固體廢渣可用做飼料等；(4)醇沉將上述水提物于90。C減壓濃縮成密度為1.02U的液體，用70%的乙醇室溫放置48小時，5000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶，再用80%的乙醇醇沉放置48小時，5000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白按每克精制糖提取物添加lula-淀粉酶，置于9095°C保溫2030分鐘；加精制糖提取物重量15%的活性炭9511(TC回流3040分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復45次，取水層濃縮，離心，干燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離采用交聯(lián)瓊脂糖凝膠SepharoseCL-4B為載體，將上述棕褐色粉末和載體按重量比1:10上樣，先以0.002mol/LTris緩沖液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第IO至IJ100流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，黃白色至棕黃色粉末；繼續(xù)以0.02mol/LTris緩沖液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到80流分，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，黃白色至棕黃色粉末；最后以0.1mol/LTris緩沖液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到70流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黃白色至棕黃色粉末。將三個部分人參多糖合并得到人參多糖成品，經(jīng)苯酚硫酸法測定，人參多糖的純度為96.2%。實施例4(1)選取生曬參，粉碎，過80目篩；(2)醇提使用75%的乙醇回流反應8小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為1:7，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干，其中的醇提物可用于回收皂苷；(3)水提將上述固體產(chǎn)物溶解于其8倍體積的水中，于ll(TC回流反應3小時得水提物，其固體廢渣可用做飼料等；(4)醇沉將上述水提物于9(TC減壓濃縮成密度為1.021.1的液體，用80%的乙醇室溫放置45小時，5000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶，再用80%的乙醇醇沉放置45小時，5000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白按每克精制糖提取物添加1"1a-淀粉酶，置于95°C保溫30分鐘；加精制糖提取物重量20%的活性炭U(TC回流40分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復5次，取水層濃縮，離心，干燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離釆用快流速瓊脂糖凝膠Sepharose4FF為載體，將上述棕褐色粉末和載體按重量比1:75上樣，先以0.002mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到100流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，黃白色至棕黃色粉末；繼續(xù)以0.02mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到80流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀千燥，得到第二部分多糖，黃白色至棕黃色粉末；最后以0.1mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到70流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，黃白色至棕黃色粉末。將三個部分人參多糖合并得到人參多糖成品，經(jīng)苯酚硫酸法測定，人參多糖的純度為96.5%。實施例5(1)選取生曬參，粉碎，過80目篩；(2)醇提使用75%的乙醇回流反應8小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為1:10，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干，其中的醇提物可用于回收皂苷；(3)水提將上述固體產(chǎn)物溶解于其8倍體積的水中，于IO(TC回流反應4小時得水提物，其固體廢渣可用做飼料等；(4)醇沉將上述水提物于35t:減壓濃縮成密度為1.021.1的液體，用75%的乙醇室溫放置42小時，4000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶再用卯％的乙醇醇沉放置42小時，4000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白按每克精制糖提取物添加llUa-淀粉酶，置于9(TC保溫25分鐘；加精制糖提取物重量20%的活性炭95"C回流40分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復4次，取水層濃縮，離心，干燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離采用快流速瓊脂糖凝膠S印harose6FF為載體，將上述棕褐色粉末和載體按重量比l:80上樣，先以0.02mol/L氯化鈉溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第IO至UOO流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；繼續(xù)以0.1mol/L氯化鈉溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到80流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；最后以0.5mol/L氯化鈉溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到70流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末。將三個部分人參多糖合并得到人參多糖成品，經(jīng)苯酚硫酸法測定，人參多糖的純度為96.3%。實施例6(1)選取生曬參，粉碎，過90目篩；(2)醇提使用75%的乙醇回流反應6小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為1:9，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干，其中的醇提物可用于回收皂苷；(3)水提將上述固體產(chǎn)物溶解于其7倍體積的水中，于95r回流反應5小時得水提物，其固體廢渣可用做飼料等；(4)醇沉將上述水提物于55。C減壓濃縮成密度為1.021.1的液體，用50%的乙醇室溫沉淀10小時，4000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶再用80%的乙醇沉淀10小時，4000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白按每克精制糖提取物添加liUa-淀粉酶，置于9(TC保溫25分鐘；加入精制糖提取物重量18%的活性炭IO(TC回流45分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復4次，取水層濃縮，離心，干燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離采用快流速瓊脂糖凝膠Q-SepharoseFF為載體，將上述棕褐色粉末和載體按重量比1:70上樣，先以0.02mol/L氯化鈉溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到100流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；繼續(xù)以0.1mol/L氯化鈉溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到80流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖為黃白色至棕黃色粉末；最后以0.8mol/L氯化鈉溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到70流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末。將三個部分人參多糖合并得到人參多糖成品，經(jīng)苯酚硫酸法測定，人參多糖的純度為96.5%。實施例7(1)選取生曬參，粉碎，過100目篩；(2)醇提使用100%的乙醇回流反應IO小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為1:11，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干，其中的醇提物可用于回收皂苷；(3)水提將上述固體產(chǎn)物溶解于其8倍體積的水中，于11(TC回流反應5小時得水提物，其固體廢渣可用做詞料等；(4)醇沉將上述水提物于90。C減壓濃縮成密度為1.02U的液體，用70%的乙醇室溫放置48小時，5000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶再用90%的乙醇醇沉放置48小時，5000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得精(5)酶解、脫色及除蛋白按每克精制糖提取物添加1lUa-淀粉酶，置于95'C保溫2030分鐘；加入精制糖提取物重量20%的活性炭ll(TC回流3040分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復45次，取水層濃縮，離心，千燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離采用交聯(lián)瓊脂糖凝膠SepharoseCL-6B為載體，將上述棕褐色粉末和載體按1:50克上樣，先以0.01mol/L醋酸溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10至ljlOO流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；繼續(xù)以0.1mol/L醋酸溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到80流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；最后以0.8mol/L醋酸溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到70流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；將三個部分人參多糖合并得到人參多糖成品，經(jīng)苯酚硫酸法測定，人參多糖的純度為96.2%。實施例8(1)粉碎選取生曬參，過10目篩；(2)醇提使用10%的乙醇回流反應3小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為1:2，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干；(3)水提將上述固體產(chǎn)物溶解于其2倍體積的水中，于6(TC回流反應3小時得水提物，其固體廢渣可用做飼料等；(4)醇沉將上述水提物于35。C減壓濃縮成密度為1.021.1液體，用40%的乙醇室溫放置10小時，3000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物16經(jīng)水溶再用80%的乙醇醇沉放置IO小時，3000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白按每克精制糖提取物添加1lUa-淀粉酶，置于90'C保溫30分鐘；加入精制糖提取物重量15%的活性炭95°(:回流30分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復5次，取水層濃縮，離心，干燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離采用葡聚糖凝膠樹脂SephadexG-75為載體，將上述棕褐色粉末和載體按重量比1:50上樣，先以0.01mol/L醋酸銨溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第IO至UIOO流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，為為黃白色至棕黃色粉末；繼續(xù)以0.02mol/L醋酸銨溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到80流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；最后以0.1mol/L醋酸銨溶液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到70流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；將三個部分人參多糖合并得到人參多糖成品，經(jīng)苯酚硫酸法測定，人參多糖的純度為95.8%。實施例9(1)粉碎選取生曬參，過10目篩；(2)醇提使用10%的乙醇回流反應3小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為1:2，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干；(3)水提將上述固體產(chǎn)物溶解于其2倍體積的水中，于6(TC回流反應3小時得水提物，其固體廢渣可用做詞料等；(4)醇沉將上述水提物于35'C減壓濃縮成密度為1.021.1的液體，用40%的乙醇室溫放置10小時，3000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶再用80%的乙醇醇沉放置10小時，3000轉(zhuǎn)/分離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白按每克精制糖提取物添加l.lul淀粉酶，置于9(TC保溫30分鐘；加入精制糖提取物重量15%的活性炭951:回流30分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復5次，取水層濃縮，離心，干燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離采用葡聚糖凝膠樹脂SephadexG-100為載體，將上述棕褐色粉末和載體按重量比1:50上樣，先以0.01mol/LTris緩沖液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到100流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第一部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；繼續(xù)以0.02mol/LTris緩沖液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到80流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第二部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末；最后以0.1mol/LTris緩沖液洗脫，每20ml為一個流份接收洗脫液，紙層析色譜檢測，收集第10到70流份，合并，濃縮，濃縮液加乙醇調(diào)至80%濃度，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到第三部分多糖，為黃白色至棕黃色粉末。將三個部分人參多糖合并得到人參多糖成品，經(jīng)苯酚硫酸法測定，人參多糖的純度為96.3%。實施例IO苯酚硫酸法測定人參多糖中總糖含量實驗方法精密稱取標準單糖或單糖混合物100mg，配制成濃度為0.1mg/ml的溶液，分別取0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，l.Oml，依次補加蒸餾水至lml。以蒸餾水為對照，分別向其中加入6。/。的苯酚0.5ml，濃硫酸2.5ml，充分振蕩搖勻后，冷至室溫，490nm處測吸光值。準確稱取適當多糖樣品配成濃度為0.1mg/ml的溶液，按同法處理后，根據(jù)多糖樣品的吸光值，對照標準曲線計算出人參多糖樣品的總糖含量。實驗結(jié)果-以標準葡萄糖為對照品樣品人參多糖含量(重量百分比)實施例1所得樣品95.3%實施例2所得樣品95.7%實施例3所得樣品96.2%實施例4所得樣品96.5%實施例5所得樣品96.3%實施例6所得樣品96.5%實施例7所得樣品96.2%實施例8所得樣品95.8%實施例9所得樣品96.3%實施例11碘顯色法測定人參多糖中淀粉含量實驗方法精密稱取標準可溶性淀粉100mg，置于100ml容量瓶中，力口lml無水乙醇，10ml蒸餾水使其潤濕，再加2mllO。/。的NaOH溶液，混勻置于80°C水浴中熱分散15min，冷至室溫后，補水至刻度。分別取上述分散液0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，l.Oml置于100ml容量瓶中，加水50ml，6M鹽酸一滴使其微酸化，加2.5ml配制好的碘試液(碘0.20g，碘化鉀2.00g，加水定容到100ml)，以水稀釋至刻度于620nm處測吸光值。準確稱取100mg多糖樣品，按同法處理后，根據(jù)樣品的吸光值，對照標準曲線計算出樣品的淀粉含量。實驗結(jié)果:<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>實施例12考馬斯亮藍法測定人參多糖中蛋白含量實驗方法精密配置0.1mg/ml的牛血清蛋白溶液合物100mg，分別取0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，l.Oml，依次補加蒸餾水至lml。然后分別考馬斯亮藍試液4ml，立即混勻，5min后在595mn處測吸光值。準確稱取適量多糖樣品，按同法處理后，根據(jù)實施例l一9樣品的吸光值，對照標準曲線計算出樣品的蛋白考馬斯亮藍試液的配制10mg考馬斯亮藍溶于95%的乙醇5ml，再加入85%的磷酸10ml，加蒸餾水稀釋至100ml，過濾備用。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例13半乳糖醛法測定人參多糖含量實驗方法1.半乳糖醛酸溶液的制備精密稱取6(TC真空干燥至恒重的半乳糖醛酸100mg，置100ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。2.樣品溶液的制備精密稱取實施例樣品l一9各50mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。3.測定法精密量取半乳糖醛酸溶液、實施例樣品l一9溶液及水各lml。分別加入0.25mol/L硼砂硫酸溶液6ml，置水浴中加熱30分鐘，放冷，再分別加入0.125%咔唑無水乙醇溶液0.4ml，置水浴中加熱10分鐘，放冷至室溫，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄VB)試驗，在530nm冷至室溫，測定吸收度，計算。測定結(jié)果:以D-半乳糖醛酸(C6Hn)07)為對照品:<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>本實驗人參多糖以D-半乳糖醛酸(C6Hu)07)計，重量百分含量達到55%以上。權(quán)利要求1.一種人參多糖的制備方法，其特征在于采用以下方式制備(1)粉碎選取生曬參，過10～100目篩；(2)醇提使用10～100％的乙醇回流反應3～10小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為1∶2～11，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干；(3)水提向上述風干的固體產(chǎn)物中加入其固體產(chǎn)物2～8倍體積的水，于60～110℃回流反應1～5小時得水提物；(4)醇沉將上述水提物于35～90℃減壓濃縮成密度為1.02～1.1的液體，用40～100％的乙醇室溫放置10～48小時，離心，沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶后再加入80～100％的乙醇放置10～48小時，離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，置于85～95℃保溫20～40分鐘；按精制糖重量10～20％添加活性炭，于90～110℃回流30～45分鐘脫色、離心；取上清液Sevage法脫蛋白，重復3～5次(6)取水層濃縮、離心、干燥，得到棕褐色粉末；(7)柱層脫色分離采用葡聚糖凝膠樹脂、交聯(lián)瓊脂糖凝膠、快流速瓊脂糖凝膠中的一種為載體，將上述棕褐色粉末和載體按重量比1∶10～100上樣，采用不同濃度的洗脫液梯度洗脫，將洗脫液濃縮，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到人參多糖。2.—種如權(quán)利要求1所述的人參多糖的制備方法，其特征在于(1)粉碎選取生曬參，過1080目篩；(2)醇提使用5075%的乙醇回流反應48小時，乙醇與生曬參粉末的重量比為l:711，過濾，將固體產(chǎn)物自然風干；(3)水提向上述風干的固體產(chǎn)物中加入其固體產(chǎn)物58倍的水，于80U0"C回流反應3—5小時得水提物；(4)醇沉將上述水提物于5590。C減壓濃縮成密度為1.021.1的液體，用50100%的乙醇室溫放置1040小時，離心，取沉淀，得粗糖提取物，粗糖提取物經(jīng)水溶后再加入80100%的乙醇醇沉放置1040小時，離心，取沉淀，得精制糖提取物；(5)酶解、脫色及除蛋白取上述精制糖提取物按比例添加淀粉酶，置于9095°C保溫2030分鐘；加入精制糖提取物重量1520%的活性炭95110'C回流3040分鐘脫色，離心；上清液Sevage法脫蛋白，重復45次，取水層濃縮、離心、干燥，得到棕褐色粉末；(6)柱層脫色分離采用葡聚糖凝膠樹脂、交聯(lián)瓊脂糖凝膠、快流速瓊脂糖凝膠中的一種為載體，將上述棕褐色粉末和載體按重量比1:10100上樣，采用不同濃度的洗脫液梯度洗脫，將洗脫液濃縮，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到人參多糖。3.—種如權(quán)利要求1所述的人參多糖的制備方法，其特征在于采用的生曬參為45年齡的人造參。4.一種如權(quán)利要求1和2所述的人參多糖的制備方法，其特征在于采用的淀粉酶為a-淀粉酶，添加的比例為每克精制糖提取物添加11.2yl淀粉酶。5.—種如權(quán)利要求1和2所述的人參多糖的制備方法，其特征在于步驟(6)中采用的洗脫液為Tris緩沖液，醋酸溶液，醋酸銨溶液，磷酸鹽緩沖液，氯化鈉溶液其中的一種，其中Tris緩沖液作為洗脫液的濃度分別為0.002mol/L，0.01mol/L，0.1mol/L;醋酸溶液作為洗脫液的濃度分別為0.01mol/L，0.1mol/L，0.8mol/L;醋酸銨溶液作為洗脫液的濃度分別為0.01mol/L，0.2mol/L，0.5mol/L;磷酸鹽緩沖液作為洗脫液的濃度分別為0.002mol/L，0.02mol/L，0.1mol/L;氯化鈉溶液作為洗脫液的濃度分別為0.02mol/L，0.1mol/L，0.5mol/L。6.—種如權(quán)利要求1和2所述的人參多糖的制備方法，其特征在于步驟(6)中采用的葡聚糖凝膠樹脂載體為DEAE-52、SephadexG-25、SephadexG-75、SephadexG-100中的一種，交聯(lián)瓊脂糖凝膠載體為SepharoseCL-4B、SepharoseCL-6B中的一種，快流速瓊脂糖凝膠載體為Sepharose4FF、Sepharose6FF、Q-SepharoseFF的一種。全文摘要本發(fā)明涉及一種人參多糖的提取工藝。該方法選取生曬參，經(jīng)粉碎、醇提、水提、醇沉后，離心取沉淀得粗糖提取物，再經(jīng)水溶醇沉、離心取沉淀得精制糖提取物；經(jīng)添加淀粉酶去淀粉，加活性炭脫色，取上清液Sevage法脫蛋白得到棕褐色粉末；再將此棕褐色粉末經(jīng)柱層脫色分離，采用不同濃度的洗脫液梯度洗脫，將洗脫液濃縮，醇沉，過夜，離心，取沉淀干燥，得到人參多糖。本生產(chǎn)工藝具有技術(shù)可靠、操作步驟簡單、條件易于控制的特點，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。所制得的人參多糖純度可達96.5％以上，純度高、安全性好，可用于制備靜脈注射人參多糖注射劑。文檔編號C12P19/00GK101323873SQ200810142918公開日2008年12月17日申請日期2008年7月16日優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日發(fā)明者蘭樹敏,陶遵威申請人:珠海市星遠科技有限公司