專利名稱：對蝦白斑綜合癥病毒核酸等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法
細下白j^鶴^^ar嫩淡,戯檢測施
本發(fā)明涉及海洋生鵬原麵財，具體魏蟲下白珍微鶴毒(WSSV， White Spot Syndrome Virus)的核^ 增檢測脇戯微泖跳 背景獄
) #下白斑^^ 毒是可廣^ *下@^十足類甲^ #、成體、親體的一種^M桿TO毒， 自1993^4辯1^下中暴發(fā)以來，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，導(dǎo)致辭1^下:^E亡，絲^MM^ 了歐的經(jīng)娜失。因此開織繊術(shù)鵬、糊、靈ictfel^測wssv,加強翻和働徹以及魏 水將境的監(jiān)測，對 1^病 ，切斷病劍專播，僦餓國細下辭她的HJ^^鎌具WSg意義。
目前，有關(guān)WSSV,測^iSWAft，第一種是電激見察法，第是TE她法，第三種是 病理切片法，第四種^t^^測法，第五種是核M^雜交法，第Af中是PCR檢測法。電子顯微^^術(shù) 雖然可以直接觀察至擴離子的雜，但其操作鋭、耗費時間長、W性低；TE鵬法WS切片法 都錢于病理^fe^，不倉^i:接對病^sffl^測，只*猁用織的繼/a^3tS征a)隨fi:^測；抗#^測法 和核^t"雜交S^t病^身的蛋白質(zhì)，m^^tfi^^測，不^處在于^^測靈i(SSf氐，只能 用于^i細下或即將Bi的細下進fi^測，WSSV尚未引^1 & 的極早鄉(xiāng),這照中方法檢
測；WSSV的PCR檢測法，雖然刻艮了前五禾t^法的缺點，在^^剝牛下能實5鵬WSSV的ffi^快 速、糊檢測，但由于常規(guī)的PCR檢測需要昂貴的PCR儀、？嫩電&細成像系統(tǒng)，這妙限制了PCR 檢測方法在妒中^T鵬。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是^tt—^^測靈^S高且易操作的細下wssv檢測方法，并^^仿法標(biāo)準(zhǔn)化， !^化，同Bt將1t測^fi簾中Ta!范的^隱中，力求刻艮已有技術(shù)的不足，^(^下白斑^^ 毒的
檢測更鵬、靈敏、'腿、錢和方便。
本發(fā)明是基于2000年由Notomi等發(fā)明的環(huán)介導(dǎo)#^"增^*。本發(fā)明針 ;們精心繊的WSSV 目的基因的6個區(qū)段，設(shè)計4^^異引物并利用一種具有^S^性的DNAI^SS,在一定MT對 核^Sfi^a擴增。與其Wit的LAMP^ffi比，本發(fā)明的核心之一^tt"對WSSV基因組，雌了 目的基因區(qū)l^fe設(shè)計LAMP特異性弓嫩，使得該弓l物能W^^測WSSV的所有離，而且檢觀將異性 好；楊fc^^ffl專門設(shè)計的SEMP研磨^S行樣品的鵬，使f雜品的^ia程極其簡單；楊。之 三^ffl尿嘧啶糖mH消除LAMP擴增]^的污染，避免了由于LAMP檢測方法的J^W增量非常 大，極易iSM^樣品污染，5t^微日性的結(jié)果，而戲限制了雜檢測中的廣^ffl;楊t、之四^tft化 了齡操作過程的技術(shù)織并將之標(biāo)準(zhǔn)化、隨化形微測淑隱，以便挪湯艦
因此，本發(fā)明的細下白斑^^M^ig^a擴增檢測Wf憶包括(1) SEMP研磨液，l管，內(nèi)裝S層采微，SEMP采微由以下組^i^: 1M的三羥甲基氨 基甲烷(Tris-HCl， pH8X)): 0.5 15份；0.5 M的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA): 0.5 15份；10%的十二 '^S^, (SDS): 0.5 15份；織乙醇0.01 0.5份；8存5 #: 0.01"0.5份；^F繊10 30 份；氯仿10 30份；^7K:定額IJ100份；
(2) 核,提液A， 1管，內(nèi)裝乙,(NaAc， pH5,2);
(3) 核,提液B, l管，內(nèi)裝^7jC乙醇；
(4) 核,提液C， l管，內(nèi)裝70%的乙醇；
(5) TE緩沖液，1管，內(nèi)裝TE緩沖液(含10 mM Tris-HCl和1 mM ED1A， pH8.0);
(6) UNG酶，l管，內(nèi)^mn^DNA糖^ttl1 (UNG酶)；
(7) 酶鵬辦液，l管，內(nèi)繊嘧使DNA糖SitSI的鵬爰艦；
(8) LAMP ^S液，1管，內(nèi)裝LAMP SiS液，其會Jj^^分如下:LAMP弓|物WSSV-FIP和WSSV-BIP 各1 2 pM， LAMP弓|物WSSV-F3和WSSV-B3各0.1 ~0.4 pM, dAIP、 dGTP和dCTP各0.8 2.0 mM， dTTP、 (111[ 各0.5 1.5函，MgCl24 10mM， Betaine (甜MD 0.6 1 2M， Tri& Cl 10 40mM， KC110 20mM， MgS041 4載 46 12福，TritonX-1000.05% 1.0% ;
(9) 5對DNA聚，，l管，內(nèi)裝5^DNA聚鋪；
(10) 顯色劑，1管，內(nèi)繊麟料GeneFinder，
(11) 陽ti^照核酸，l管，內(nèi)^t!fe下WSSV陽性DNA;
(12) 研磨棒，4支；
(13) 盒子；
(14) 一塊^ ，其大小與J^^子的底面相同，裝^:子中，泡沫fei:有^!^J^小管M 的/J吼，J^各小管j^g^^/J吼中；
(15) 微i傖娜說明書，l份。 i^WSSV基因檢頂!B^隱中所述的LAMP引物是 WSSV基因保守g^列設(shè)計的，LAMP引
嫩計的首選軟件是PrimerExplore40 (htQ^/primeiexplorerjp/elampiO.O/iiKbc htmL)，也可以《頓常用 的弓Itf^計軟件(如Primer Primier 5.0或Omiga 2.0)按照LAMP弓嫩的設(shè)計要^S行弓1 計。本發(fā) 明中利用軟件PrimerExplore 4.0機設(shè)計的4 LAMP弓嫩的DNA序列如下 WSSV-FIP: 5'"GCTGTrcTTCrrcTTCTrCTGCGTnTAAArATGGArGAAGACACTTGG WSSV-BIP: 5'-GCCGTrGAACGAGTITArAGnTCTnTGTrCTCTCArTACAAGAAGTCTC WSSV-F3: 5'^GACAACACTCTTCnTCTTGAA WSSV-B3: 5'-ACGGGAAGAAGAATnTGTG
用本發(fā)明J^Wf0^^lJ^l下白斑^^^毒^^法，按下列步^t行
(1) 取樣品)^下的胃、龜蜮附1^§1形勺0.02 0.068置于,離心管中，力PA研磨液，用研磨麟 樣品充分0#1§^狀；
(2) )^f磨好的樣品以5000 1畫r/min，離心2 5 min，取0.1 mL上^g預(yù)附鵬離心管
中；
(3) 力口入核^l取液A,混勻，再力PA^I取液B (-20。C預(yù)冷)充分混合，以l國 15000r/min 離心5 lQmin,棄上清液保留沉淀物；
(4) 用核^I取液C洗滌沉淀物，然后以l麵 15000r/min離心5 10min，小L、去上清并保留 沉淀物；
(5) 鼓步驟(4) 一次，然后將離心管底gPE淀物于室溫晾干，力口入TE緩沖液溶^i:淀物，得 樣品核酷
(6) ^J^^解后的樣品核酸，力nA2 12個單位(U)的UNGSIfP酶勝夷沖液，消辦品核酸 中可能雜的污^^;
(7) 將J^ai解后的樣品核酸、陽14^照核軒95。C保溫3 6min，讓DNA雙觀^^鏈，離 再3KIg于柳燭中2 10min，目的鞭核酸DNA條呈兩條單艦態(tài)。
(8) M^bSB的核^^別置預(yù)的小管中，^t中再分別力PALAMPSi^液和淑DNA聚
鎢
(9) 將Jd^小管于60 65^C^a40 70min，然后于80^C保溫5 10min進行LAMP皿；
(10) LAMPSi^束后，在齡小管中力口入GeneFinder，然JS用目l0f觀^Mi辭品的LAMP反 i3^ti，如顆^fe卯m^^樣品的wssv檢測結(jié)果為陽性，如顆示橙黃MiJ^i^樣品的WSSV ^M結(jié)果為陰性。
本發(fā)明的積豐厳媒在于在微隱中匯集WSSV檢測所需的SEMP樣品研磨液、核^ft提液A、
1Mi提液B等"h^H^御三種器材，使得wssv的檢測倉,序鵬行，實現(xiàn)了檢測過程的^jm
和標(biāo)準(zhǔn)化，使f鞭作規(guī)范、不易出錯；本發(fā)明的淑y^^檢測方凝以鵬WSSV基因保守MJW股計 的HAMP引物為主體而設(shè)計的，因而使WSSV檢測完全具有了LAMP技術(shù)靈敏、鵬、^^和簡 便 點；同時本發(fā)明的WPJ^S檢測方法中^ UNG酶能徹底消除多7^^測過程中核酸污染，的 假陽性，解決了限制LAMPg^na^的易被污^f擾的問題。《頓本發(fā)明的淑IJ^S檢測方法在2 小時內(nèi)就可^Jlll下WSSV6^J^測，檢測過禾g^需昂貴的儀器設(shè)備如PCR儀和i^^像皿，僅皿 水鵬^M浴和離心機艮阿；而且檢測結(jié)果非常容易判別；與)^下WSSV已有檢測^B比，本發(fā)明 的湖腳檢測方 *低，^Mi程W及有驗U，鵬作人員和環(huán)^ 常娃，并且檢測靈敏 度極高，檢出病毒,貝可fftM26個。，g^， ^^法具有比普通PCR檢測方法更高^^異性、靈敏性
和便捷性，可以割Wi下白斑^^Mmt前的相關(guān)檢測方法如電傲見察法、TE^fe法、；i^a切片法、
抗#^測法、核^t"雜交法和PCR檢測法。
以下艦,樹本發(fā)明作進"^l兌明。
鄉(xiāng)例l:,白珍微鶴鎌^ "增檢觀繊瞼 本發(fā)明的KM^由以下皿(4樣份) (l)SEMP研磨液，l管，內(nèi)裝800mLS證采微，SEMP采微^tiE在于是由lM的三羥甲 基錢甲烷(Tris.HCl， pH8.0) 10份，0.5M的Z^四乙酸二鈉(EDTA) 1份，10%的十二^^應(yīng)
鈉(SDS) 10份，驢乙醇O.Ol份，84g * 0.01份，平衡酚10份，氯仿10份，M^7K定額U
ioo份而成。
(2)核,提液A， l管，內(nèi)裝400mL4M乙,(NaAc， pH5.2)。 G)核,提液B， l管，內(nèi)裝800nL ^7jC乙醇。
(4) 核,提液C， l管，內(nèi)裝800nL70"/。的^7K乙醇。
(5) TE緩沖液，l管，內(nèi)裝200nLTE緩沖液(含lOmMTris-HCl和1 mMEDTA, pH8.0)。
(6) UNG酶，l管，內(nèi)裝20個單位(U)的尿1^DNA糖皿酶(UNG酶)。
(7) 酶m夷沖液，l管，內(nèi)裝10ML2xUNGS^I解MiMl沖液o
(8) LAMP^g^液，l管，內(nèi)裝100 pL LAMP ^Z液，^tttiE在于它的纟M^分和比例如下引 物WSSV-FEP和WSSV-BIP各1.6 pM，弓|物WSSV-F3和WSSV-B3各0.2 — ， dAIP、 dGTP和dCTP 各1.4mM， dTIP、 dUTP各0.7mM， MgCl26mM， BetainelM， Tri^HC120mM， KC110mM， MgS04 2 mH 410 mM， Triton X-100 0.1%。
(9) 版DNA聚鋪，l管，內(nèi)裝4mL&,DNA聚^SI。
(10) 顯色劑，l管，內(nèi)裝8ML20倍繊的核^^料GeneFinder，
(11) 陽'I4^照核酸，l管，內(nèi)裝8ML)^下WSSV陽性DNA。
(12) 研磨棒，4支。
(13) 盒子(78x78x50訓(xùn))。
(14) 一塊泡沫板，泡,高22mm,有三列空，第一歹御第二列都J^H個空，孑W5l0mm，第三 列五個空，孑L徑5.5mm， i^各小管體^f^/j吼中；泡賺與Jdi^子的底面大小，裝^:子中。
(15) WHJ^頓說明書1。 微嗆中戶腿的LAMP弓胸的DNA序列如下
WSSV-FIP: 5'"GCTGTrcTTCTrCTTCTrCTGCGTnTAAArArGGArGAAGACACTrGG WSSV-BIP: 5'-GCCGTTGAACGAGnTArAGTnumTGTTCTCTCArTACAAGAAGTCTC WSSV-F3: 5'"GACAACACTCITCnTCITGAA WSSV陽B3: 5'-ACGGGAAGAAGAAmTGTG
該淑瞼中的陽'l4XtM^^含WSSV病離酸的DNA質(zhì)茅對示準(zhǔn)。其第恪的具^^作是在PCR反 !^g,用淑瞼回收相^it段，然Jg^5頓辛i^體上，轉(zhuǎn)入^^桿菌￡ //中，經(jīng)氨節(jié)^^S^W :^@#，釤陬陽性克隆并進行測imffi，提取陽性克隆的質(zhì)粒并繊到104個拷貝，即可作為陽'ft^照 標(biāo)準(zhǔn)。
^SI例2本發(fā)明的^l!下白斑^^M毒LAMP檢測方法 艦鄉(xiāng)例l中的淑搶，按下列步鵬行
(1) 取樣品)^!下的胃繼形勺0.05經(jīng)置于鵬離心管中，力PA300nL研磨液，用研磨#^樣品充分磨碎。
(2) )^F磨好的樣品以■ i/min離心2min, ^^勺0.1 mL上清置豫時鵬離心管中。(3) 力隊100ML核^i取液A，混勻后，再力DA200ML核^l取液B(-2(rC預(yù)冷)充分混合，以 12000r/min離心5min，棄上清液保留沉淀物。
(4) 用100ML核^I取液C洗滌沉淀物，然Jg以12000r/min離心5min，小'。棄去上滑液，保留 沉淀物。
(5) 鼓步驟(4) 一次，然Jg將離心管底鵬淀物于室溫晾干，加入100pLTE緩沖液溶鵬淀 物，辦品核酸。
(6) ^J^^解后的祥品核酸2mL，力HA5個單位(U)的UNGSHP2.5ML酶勝愛沖瓶于37。C 保溫5min進摘解c
(7) 將±^81解后的樣品核酸和陽'14^照核 95°C 5 min，然^再》318于^/燭中3 min。
(8) 取2pLj^bS^的核^^別置預(yù)的小管中，Wf中再分別加入22MLLAMP^aS液和 1 pL&課A聚^SI。
(9) 將i^&小管于63 <€保溫60 min，然后于80《保溫5 min進行LAMP Mi^。
(10) LAMP Si^束后，在齢小管中力PA 2 pL顯色劑，然后用目lBf觀SI^測樣品的LAMP 反應(yīng)產(chǎn)物，如果顯^^絶則表示該樣品的WSSV檢測結(jié)果為陽性，如果顯示橙黃色則標(biāo)該樣品的 WSSV檢測結(jié)果為陰性。
本^FO^l檢測方^刑^的WF御材料乙二胺四乙^z1鈉、三羥甲基MS甲烷、十二^i酸
鈉、ig^、氯仿、平衡m、,乙醇、8"i^pg^、 Mgci2購自上 i^物:ri呈有限劍i^司；UNG酶、
版DNA聚^H^購自NEB公司；核^^料GeneHnder^購自廈門百維信生t^l^限公司。
<uo>中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)fm^
<12。>艦白珍微癥病毒核酸^r增檢測試劑敘檢測方法
<160> 4
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> AX序列
<220>
<223>根據(jù)對蟲下白斑^癥病毒基因組序列和^U擴增引物設(shè)計要求而設(shè)計，用作對 蝦白斑^^癥病毒^a擴增^^測的HP引物
<400> 1
gc^ttcttc ttcttcttct gcgttttaaa tatgga^aa gacactigg 49
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> Ali^列
<220>
<223>根據(jù)對蟲下白斑^^癥病毒基因組序列和^M擴增引物設(shè)計要求而設(shè)計，用作對 蟲下白斑^^癥病毒^S擴增檢測的BIP弓物
<400> 2
gccgttgaac gagtttatagtttcttttgttctctcatta caagaagtct c 51
<210> 3 <211> 22<212> DNA 〈13> AX序列
<220>
<223>根據(jù)對蟲下白珍B^癥病毒基因組序列和^M擴增引物設(shè)計要求而設(shè)計，用作對 蝦白斑餘癥病毒^a擴增檢測的F3引物
<400> 3
gacaacacte ttctttctig aa 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> AX序列
<220>
〈23>根據(jù)對蟲下白斑^癥病毒基因組序列和^M擴增引物設(shè)計要求而設(shè)計，用作對 蝦白斑^^癥病毒^i擴增檢測的B3弓嫩
<400> 4
ac鵬aagaa gaattdgtg 20
權(quán)利要求
1.一種對蝦白斑綜合癥病毒核酸等溫擴增檢測試劑盒，其特征是該試劑盒包括(1)研磨液，1管，內(nèi)裝SEMP采樣液；(2)核酸抽提液A，1管，內(nèi)裝乙酸鈉；(3)核酸抽提液B，1管，內(nèi)裝無水乙醇；(4)核酸抽提液C，1管，內(nèi)裝70％的乙醇；(5)TE緩沖液，1管，內(nèi)裝TE緩沖液；(6)UNG酶，1管，內(nèi)裝尿嘧啶DNA糖基化酶；(7)酶解緩沖液，1管，內(nèi)裝尿嘧啶DNA糖基化酶的反應(yīng)緩沖液；(8)LAMP反應(yīng)液，1管，內(nèi)裝LAMP反應(yīng)液；(9)Bst DNA聚合酶，1管，內(nèi)裝Bst DNA聚合酶；(10)顯色劑，1管，內(nèi)裝核酸染料GeneFinderTM；(11)陽性對照核酸，1管，內(nèi)裝對蝦WSSV陽性DNA；(12)研磨棒，4支；(13)盒子；(14)一塊泡沫板，置于盒子中，其上的若干小孔用于放置上述各小管；(15)試劑盒使用說明書，1份。
2. 如權(quán)利要求書1中所述的試劑盒，其特征在于作為研磨液的SEMP 采樣液是由以下組份按比例組成1MpH值為8.0的三羥甲基氨基甲垸 0.5 15份；0.5M的乙二胺四乙酸二鈉0.5 15份；10%的十二烷基硫酸 鈉0.5 15份；巰基乙醇0.01 0.5份；8-羥基喹啉0.01-0.5份；平衡 酚10 30份；氯仿10 30份；并以雙蒸水定容到100份。
3. 如權(quán)利要求書1中所述的試劑盒，其特征在于上述的LAMP反應(yīng) 液由以下組份組成LAMP引物WSSV-FIP和WSSV-BIP各1 2 pM， LAMP引物WSSV國F3和WSSV國B3各0.1 0.4 ^M， dATP、 dGTP和dCTP 各0.8 2.0 mM， dTTP、 dUTP各0.5 1.5 mM， MgCl2 4 10 mM, Betaine 0.6 1.2 M， Tris畫HCl 10 40 mM， KC1 10 20 mM， MgS04 1 4 mM， (NH4)2S046 12mM， Triton X-100 0.05% 1.0% 。
4.如權(quán)利要求書3中所述的試劑盒，其特征在于LAMP引物的核酸序列 如下- WSSV陽FIP :5'國GCTGTTCTTCTTCTTCTTCTGCGTTTTAAATATGGATGAAGACACTTGG;WSSV國BIP : 5'國GCCGTTGAACGAGTTTATAGTTTCTTTTGTTCTCTCATTACAAGAAG TCTC;WSSV-F3: 5'-GACAACACTCTTCTTTCTTGAA; WSSV-B3: 5'陽ACGGGAAGAAGAATTTTGTG。
5.使用權(quán)利要求書1中所述試劑盒檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法， 其特征在于該方法包括下列步驟(1 )取樣品對蝦的胃、鰓或附肢組織0.02 0.06 g置于微型離心管中， 加入研磨液，用研磨棒將樣品充分磨碎至槳狀；(2) 將研磨好的樣品以5000 10000r/min離心2 5min，取0.1 mL上清液置于新的微型離心管中；(3) 加入核酸提取液A，混勻，再加入-2(TC預(yù)冷的核酸提取液B并 充分混合，以10000 15000r/min離心5 10min,棄上清液保留沉淀物；(4) 用核酸提取液C洗滌上述沉淀物，然后以10000 15000 r/min 離心5 10min，棄去上清液并保留沉淀物；(5) 重復(fù)步驟(4) 一次，然后將上述離心管底部的沉淀物于室溫晾 干，加入TE緩沖液溶解沉淀物，得到樣品核酸；(6) 取上述樣品核酸及試劑盒中的陽性對照核酸，加入UNG酶和酶 解緩沖液，作為污染模板消除方法以酶解其中可能存在的污染模板；(7) 將上述酶解后的樣品核酸和陽性對照核酸于95。C保溫3 6min，然后再迅速置于碎冰塊中2 10min;(8) 取上述處理后的樣品核酸和陽性對照核酸分別置于新的小管中， 每個管中再分別加入LAMP反應(yīng)液和BWDNA聚合酶；(9) 將上述小管于60 65 。C保溫40 70 min，然后于80 。C保溫5 10min進行LAMP反應(yīng)；(10) LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在每個小管中加入GeneFinderTM，然后用 眼睛觀察被測樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如果顯示綠色則表示該樣品的 WSSV檢測結(jié)果為陽性，若顯示橙黃色則表示該樣品的WSSV檢測為陰性。 6.如權(quán)利要求5中所述的檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法，其特征是上述 污染模板消除方法是通過在提取的對蝦樣品核酸中加入2 12個單位的 UNG酶和酶解緩沖液，并于37X:，保溫5 30min來消除污染模板對檢測 結(jié)果的干擾。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對蝦白斑綜合癥病毒核酸等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法。是根據(jù)白斑綜合癥病毒基因保守區(qū)序列設(shè)計的一套LAMP引物為主體設(shè)計的。試劑盒匯集了WSSV檢測所需的SEMP研磨液、核酸抽提液、UNG酶、TE緩沖液、酶解緩沖液和LAMP反應(yīng)液等十一種試劑，實現(xiàn)了檢測的程序化和標(biāo)準(zhǔn)化，因此本發(fā)明靈敏性極高，檢出病毒的拷貝可低至26個，而且簡便快速，安全，特異性好成本低，利用該試劑盒和檢測方法僅需一個水浴鍋即可在2小時內(nèi)準(zhǔn)確檢測出對蝦和養(yǎng)殖水體中的白斑綜合癥病毒。也解決了限制LAMP技術(shù)中的易被污染干擾的問題。有望替代對蝦白斑綜合癥病毒之前的相關(guān)檢測方法，如電鏡觀察法、TE染色法、病理切片法、抗體檢測法、核酸探針雜交法和PCR檢測法。
文檔編號C12Q1/70GK101372714SQ200810139949
公開日2009年2月25日 申請日期2008年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月7日
發(fā)明者莉 劉, 宋曉玲, 張慶利, 冰 楊, 倢 黃 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所