專利名稱：海洋高等真菌的大批量長期保存方法
海洋高等真菌的大媳長期保存方法獄領域本發明屬于海洋微生物學領域，海洋高等真菌的対比量長期保存方法。背景駄分離獲得的真菌^W適當的方法予以保存，以{^:的生活力和原有的性狀，并同 時避免雜菌的污染。海洋高等真菌是一att^的海洋微生物資源，由Ti十對i^t^物的研離步較晚，迄今已鵬的海洋高等真薪中類僅有500余種。與陸地真菌相比，有關海洋高等真謝繊技術未見有專門研究。目前，海洋高等真m^種的保存并無成熟的 方法，主要是參考陸地真菌的保存技術。目前，針對陸地真菌的菌種保存方法有很多，主魏以下三類(i)菌種定期移植 培養，這是常用的保存方法，但是這種保存方法，微生物的生長和代掛胸沒有穀i勝 何抑制，所以存活時期較短，發生^的可能性^c。另外， "^^存菌種主要，ii^平板，; #基用量較多，因此浪費實驗藥品和占用駄空間，不宜大mi保存菌種。 (2) ^a和礦物油下保存，可以部分抑制生長和銜發^J，可延長，的存活期和^> 頓。雌對Mffl培養平板(線平敝爐在5。C鵬餅下保存)或i^i^管(培 #^管中添加一定量的礦物油)保存節中，同樣面臨浪費實驗藥品與占用^:空間的問 題。礦物油下保存薪中的方》娥作費事，在實際保存中添加的礦物油船隹控制準確的量， 一旦添加了過量的礦物油，極易導致保存的蘄中因長期缺氧而失去活性。(3)采用真空千燥和冷凍千燥的方法，以^^a年來，的液態氮的趣B^保幫去，可以完全抑制m射赫，玄媒明顯提高。i^^髓要較多的設備，不是一般實驢都育翻的。同時，由 于在菌種復活轉接期間要求的餅鄉嚴格，而難以普^Zffl。發明內容本發明的目的辭十對海洋高等真菌保存技術缺乏的現狀，掛共一種海洋高等真菌的 大批量長期保存效去，以剠艮已有獄的不足。本發明的特征是將需要保存的菌種轉接到陳海7K^膨^^平板上，在15。C下培^ 個月到一個半月，再^^存管鹽酸浸泡消毒后，用蒸餾水沖^T凈備用，然后用移液槍 移取1.6 ml的陳海水方從±^凍存管中，將皿陳海水的凍存t^行高壓蒸M菌20倂中后取出備用，再用滅菌的手術刀在無 境下，切ra:徑小于凍存管管口徑的一小塊長有真菌的培養^i央，并將其方MJ:^凍存管中浸泡在陳海水里，1^1 存管蓋螺 !im凍存管盒內，于5"C、黑暗剝牛下保存。戰凍存管以濃度為5%的鹽酸浸泡消毒。本發明的菌種的復活轉接方法只要用移液槍將凍存管中少量的陳海水轉移到培養 平lli:即可。，的高壓蒸M菌的皿和壓力分別為121°C， 98.1kPa 。 戰的陳海7嫁膨歸平板是誦ml陳海水+15克瓊月謝。 戰的凍存管的容量為1.8 ml。 {頓前，凍存管以濃度為5%的鹽酸浸泡消毒。本發明簡便、易于操作，只需利用大多數實驗室均能具備的凍存管，就離艮好i鵬 決目前海洋高等真菌保存過程中易出Uii化、失活以及浪費實驗藥品、空間資源等問題。 具體實船式本發明的更具體的鄉步驟(l)審ij備陳海水取天^^7K^;保存3個月以上， iOT時經0.45 um濾M 濾，即獲得陳海水。將需要保存的辦中轉接到陳海7K^膨歸 平板(1000ml陳海水+15克瓊脂盼)上，15。C下:t^^個月到一個半月(視真菌生長瞎 況而定)。該陳海7j^膨咅養基是貧營^f牛的J^^基，ff^^^高等真菌的實際生, 境，用以i歸真菌，可以獲得性狀穩定、麟的真M^，有利于延長保存時間。(2) 選,量為1.8ml的凍存管，鹽酸浸泡消毒后，用蒸餾水沖 凈。然后，用移液, 取1. 6 ml的陳海水，方JCA凍存管中。 (3)將^W陳海水的凍存t^行高壓蒸n^菌(121 。C， 98. lkPa) 20倂中，取出備用。(4)用滅菌的手術刀在無菌環境下，切取一小土央長 有真菌的:tB^基(:fe&^對央的直《被小于凍存管管口直徑)，然后將其方J[A (3)步驟中獲得的凍存管中，并浸泡在陳海水里，翔鄉存管蓋螺緊，m凍存t^內，OT于5。C、黑暗餅下保存。顯然，本發明具有以下優點(1)由于凍存管所占空間^K 一個100格的凍存管 盒(14 cmX14 cm X5 cm)可以方嬗100個凍存管(即保存IOO株海洋高等真菌)，對 于菌種的存放十分方便，相比傳統的J^^平^^Jt^管保存方法，極大地節約了空間 資源，這在調查船_ 得更為觀，有利于實現海洋高等真菌的大fta保存(2)另外， 保存過程中，只以陳海水為保存介質，幾乎不需要其它倒可實驗藥品，大大節約了菌種保存駄(3)由于凍存管^m點弒密封，相對于一般的平板培養鵬^^t加蓋棉縫的密封方法密封性能高，離艮好M鈔卜界雜菌污染凍存管內保存的薪中；(4) 菌種保存期間，附著在:feg^基上的真菌孢子和菌絲^tA陳海水中，所以陳海水中含有 大量真菌活體組織。若在保存一段時期后，需要對所保存的謝進行復活轉接，僅需用 移液糊 存管中少量的陳海水轉移至膽^#平^11即可實現節中的復活轉接，極力也方 便了保存菌種的復活轉接。利用本發明已從海洋低泥中分離獲得的50株海洋高等真菌(其中包括曲霉屬 Aspe gz'腸12株，漸^M尸MS(2r/固18株，青霉屬戶ew/c做廳15株，J/temor^ 5株)進行了保存微，結果表明被保存的菌種可以存活2-3年，其復活轉接的離 率超lj 100%，并且沒有發現薪中退化、頓等問題。
權利要求
1、一種海洋高等真菌的大批量長期保存方法，其特征是將需要保存的菌種轉接到陳海水瓊脂培養平板上，在15℃下培養一個月到一個半月，再將凍存管以濃度為5％的鹽酸浸泡消毒后，用蒸餾水沖洗干凈備用，然后用移液槍移取1.6ml的陳海水放入上述凍存管中，將盛有陳海水的凍存管進行高壓蒸汽滅菌20分鐘后取出備用，再用滅菌的手術刀在無菌環境下，切取直徑小于凍存管管口徑的一小塊長有真菌的培養基塊，并將其放入上述凍存管中，浸泡在陳海水里，最后將凍存管蓋螺緊裝入凍存管盒內，放置于5℃、黑暗條件下保存。
2、 如權利要求1所述的海洋高等真菌的大批量長期保存方法，其特征 是上述高壓蒸汽滅菌的溫度和壓力分別為12TC， 98. lkPa 。
3、 如權利要求1所述的海洋高等真菌的大批量長期保存方法，其特征 是上述陳海水瓊脂培養平板是1000 ml陳海水+15克瓊脂粉。
4、 如權利要求1所述的海洋高等真菌的大批量長期保存方法，其特征 是上述凍存管的容量為1.8 ml。
全文摘要
本發明涉及一種海洋高等真菌的大批量長期保存方法，其特征是將需要保存的菌種轉接到陳海水瓊脂培養平板上，在15℃下培養一個月到一個半月，再將選擇的凍存管鹽酸浸泡消毒后，用蒸餾水沖洗干凈備用，然后用移液槍移取1.6ml的陳海水放入上述凍存管中，將盛有陳海水的凍存管進行高壓蒸汽滅菌20分鐘后取出備用，再用滅菌的手術刀在無菌環境下，切取直徑小于凍存管管口徑的一小塊長有真菌的培養基塊，并將其放入上述凍存管中，浸泡在陳海水里，最后將凍存管蓋螺緊裝入凍存管盒內，放置于5℃、黑暗條件下保存。本發明簡便、易于操作，很好地解決了海洋高等真菌保存中易出現退化、失活以及浪費實驗藥品、空間資源等問題。
文檔編號C12N1/14GK101333501SQ20081013892
公開日2008年12月31日 申請日期2008年7月31日 優先權日2008年7月31日
發明者唐學璽, 孫開明, 偉 李 申請人:中國海洋大學