一種利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法

專(zhuān)利名稱：一種利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)的方法，尤其涉及一種利用重組大腸桿 菌發(fā)酵生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)的方法。屬于基因工程和微生物發(fā)酵領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酉旨(Polyhydroxyalkanoat,簡(jiǎn)稱PHA)，是由微生物合成的功能性生物聚 酯。PHA具有生物可降解性、生物相容性、氣體阻隔性、壓電性、非線性光學(xué)活性以及 由官能團(tuán)引起的其它特殊性能。PHA的性質(zhì)決定了它具有可作為生物可降解塑料、組織 工程的支架材料等許多潛在的應(yīng)用，因此，國(guó)內(nèi)外都對(duì)其進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)和應(yīng)用開(kāi)發(fā) 研究。聚羥基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate, PHB)是PHA家族中最簡(jiǎn)單，也是研究得 最多、最透徹的成員。PHB在細(xì)胞內(nèi)呈顆粒狀，分子量一般為106 (隨培養(yǎng)條件，抽提 方法不同而變化)，熔點(diǎn)為18'C,具有高結(jié)晶性、光學(xué)活性和壓電性質(zhì)，是立體規(guī)整的聚 合物。
PHB的合成途徑已經(jīng)比較清楚。以葡萄糖為原料，可以通過(guò)乙酰輔酶A縮合形成 聚合物的前體物酰基輔酶A，然后在聚合酶的作用下合成PHB。但是由于原料成本較高， PHB的工業(yè)生產(chǎn)仍然受到限制。目前，市場(chǎng)上PHB的價(jià)格大約為20美元/千克，為普 通石化塑料的10倍，因此，PHB還無(wú)法與石化塑料相競(jìng)爭(zhēng)。隨著石油價(jià)格的上漲及環(huán) 境污染的問(wèn)題的凸顯，生物發(fā)酵生產(chǎn)PHB代替化學(xué)合成塑料的趨勢(shì)越來(lái)越明顯。
大腸桿菌作為一模式原核微生物，由于其遺傳背景清楚、易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快及易操作 性，已廣泛應(yīng)用于基因工程及化工原料合成代謝途徑的構(gòu)建中。大宗生化原料如氨基酸、 有機(jī)酸等已經(jīng)通過(guò)大腸桿菌中得以生產(chǎn)。在工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)PHB的過(guò)程中，除 了降低發(fā)酵底物價(jià)格、能源消耗及提取消耗外，發(fā)酵過(guò)程中昂貴誘導(dǎo)劑的添加也是一個(gè) 難于解決的問(wèn)題。
目前，用于基因的表達(dá)系統(tǒng)，常見(jiàn)的有阿拉伯糖誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)Pbad; IPTG (異 丙基-P-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，如PLAC、 Ptrc、 Ptac、 Pl、 Pr和PT7。然 而，這些常見(jiàn)的表達(dá)系統(tǒng)存在著很大的缺陷，即只能用于實(shí)驗(yàn)研究水平，在大工業(yè)生產(chǎn) 中很難得到利用。阿拉伯糖誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)在添加阿拉伯糖的條件下誘導(dǎo)表達(dá)，但該表 達(dá)系統(tǒng)依賴于阿拉伯糖的濃度。由于大腸桿菌存在利用阿拉伯糖的酶系，所以應(yīng)用過(guò)程 中，必須持續(xù)的添加阿拉伯糖來(lái)維持目的基因的充分表達(dá)。IPTG誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng) 用遠(yuǎn)遠(yuǎn)廣于阿拉伯糖誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，但該系統(tǒng)也存在著缺陷。IPTG本身對(duì)菌體有毒 害作用，實(shí)驗(yàn)己證明IPTG抑制菌體的生長(zhǎng)，所以在培養(yǎng)菌體過(guò)程中，何時(shí)添加IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)目的基因難以確定。同時(shí)，IPTG本身有比較昂貴，同樣限制了該誘導(dǎo)表達(dá)系 統(tǒng)在大工業(yè)生產(chǎn)中的利用?；谏厦姹磉_(dá)系統(tǒng)的缺陷，科研工作者開(kāi)發(fā)出了溫度誘導(dǎo)型 表達(dá)系統(tǒng)和pH誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，即分別通過(guò)調(diào)節(jié)溫度和pH來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)。雖然 這些表達(dá)系統(tǒng)具有應(yīng)用前景，但是由于調(diào)節(jié)過(guò)程較為復(fù)雜，所以也限制了在實(shí)際生產(chǎn)中 的應(yīng)用。因此，利用合適的誘導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)PHB對(duì)于解決目前PHB生產(chǎn)成本過(guò)高 的問(wèn)題具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前PHA發(fā)酵過(guò)程中代謝過(guò)程關(guān)鍵酶的誘導(dǎo)產(chǎn)生問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用 重組大腸桿菌通過(guò)環(huán)境誘導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)的方法。具體以發(fā)酵生產(chǎn) PHB為例來(lái)闡述利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)的方法。
本發(fā)明選擇大腸桿菌作為基因工程改造的對(duì)象菌株，所用大腸桿菌菌株為大腸桿菌 MG1655、 JM109、 DH5a、 W3110或Xll-blue中的一株。其中MG1655、 JM109和W3110 購(gòu)買(mǎi)于ATCC(美國(guó)典型菌種保藏中心)；DH5a與Xll-blue購(gòu)買(mǎi)于DSMZ(德國(guó)微生物保 藏中心)。真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌04/ca/ig^ey w/ra; /n^)購(gòu)買(mǎi)于CICC(中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管 理中心)。月巴大產(chǎn)減桿菌(^4/(^//§^"^/a/"附)、自養(yǎng)黃桿菌(^"aw/7 o6a"er tn^o^"op/n.ci^)、 巨 大芽孢桿菌(5""7/w weg"/er/"w)和惡臭假單胞菌CPww^;w "ay /w"fo)購(gòu)買(mǎi)于ATCC(美 國(guó)典型菌種保藏中心)。
本發(fā)明所述利用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)的方法，由下述步驟 實(shí)現(xiàn)(具體以發(fā)酵生產(chǎn)PHA家族成員中的PHB為例來(lái)闡述)
l.環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
基本方法是以大腸桿菌MG1655、 JM109、 W3110、 DH5a或XLl-blue基因組為模 板，通過(guò)設(shè)計(jì)引物PCR體外擴(kuò)增環(huán)境誘導(dǎo)片段并將其命名為EPI;將EPI作為啟動(dòng)子插 入到質(zhì)粒pBluescript S、pUC19、 pUC18、 pCL1920或pTrc99A中，取代原來(lái)的啟動(dòng) 子序列，獲得重組環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒。 (I )環(huán)境脅迫誘導(dǎo)(簡(jiǎn)稱為EPI)片斷克隆
根據(jù)GenBank上公布大腸桿菌MG1655、 JM109、 W3110、 DH5a或XLl-blue的基 因組序列，設(shè)計(jì)引物
pEPI primer 1: 5'- AATACATGTCCATACGCGCTGAACGTTGGTCA-3' pEPI primer 2: 5 '-ATACCCGGGAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCCCT-3'
以大腸桿菌MG1655、 JM109、 W3110、 DH5a或XLl-blue的基因組為模板，利用 PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)M本外擴(kuò)增環(huán)境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子序列片斷，命名為EPI，該環(huán)境 誘導(dǎo)片段含有Prp。s及Prp。s下游的受DsrA調(diào)控的序列。
通過(guò)電泳檢測(cè)目的條帶的大小。引物中下劃線部分為相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，前引物中為 Ac/酶切位點(diǎn)，后者為Swa/酶切位點(diǎn)。
(n )環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
將環(huán)境脅迫誘導(dǎo)片斷EPI與克隆載體pBluescript SIC、 pUC19、 pUC18、 pCL1920 或pTrc99A，利用Ac/和Sma/核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切消化。Ac/酶切反應(yīng)溫度為37°C， Swa/酶切反應(yīng)溫度為30°C。然后利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA)回收純化 酶切的片段。將酶切片斷利用T4連接酶(購(gòu)買(mǎi)于MBI)連接。連接反應(yīng)在16 25'C下進(jìn) 行，反應(yīng)體系為5-15pl。經(jīng)連接后得到重組的環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒。
進(jìn)一步的優(yōu)選方式，EPI作為啟動(dòng)子插入到質(zhì)粒pBluescript SK—中的Ac/酶切位點(diǎn) 與5Vwa/酶切位點(diǎn)之間，獲得重組環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒，命名為pEPI。 (III)環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒的擴(kuò)增
挑取LB平板中的大腸桿菌，培養(yǎng)過(guò)夜；將培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌DH5a按照1%的 接種量轉(zhuǎn)入裝有50 ml LB的300ml的三角瓶中培養(yǎng)，于30 37°C、 180 250轉(zhuǎn)/分鐘 下培養(yǎng)至OD6oo為0.3 0.5。停止培養(yǎng)，置冰上20 30分鐘，4°C， 4000 5000轉(zhuǎn)/分 鐘，離心10-20分鐘，棄上清，加入冰冷的O.05 0.3mol/L CaCl2溶液懸浮，冰上靜置 30 60分鐘。離心濃縮，獲得感受態(tài)細(xì)胞。放于-7(TC保存。
將含有重組環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pEPI的連接液加入50 lOOpl的DH5oc感受態(tài)細(xì)胞 中，混勻；置冰上30 40分鐘；42。C熱激，冰上靜置2分鐘，加入90(^1的LB培養(yǎng) 基，30 37'C， 100轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)1小時(shí)。將轉(zhuǎn)化液涂布于含有質(zhì)量百分比為1.5 2.0% 的瓊脂并加有終濃度為50 150微克/毫升的氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，30 37'C條件下，靜置培養(yǎng)12 16小時(shí)，調(diào)取單菌落篩選轉(zhuǎn)化子。即將單菌落挑取轉(zhuǎn)入LB 液體培養(yǎng)基中，30 37°C， 180 250轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)過(guò)夜(培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素至 終濃度為50 150微克/毫升)。離心菌體，利用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)買(mǎi)于TIAN GEN公 司)提取重組質(zhì)粒pEPI，并驗(yàn)證質(zhì)粒的正確性。
所述質(zhì)粒pBluescript SK-、 pUC19、 pUC18購(gòu)自Fermentas公司，pCL1920購(gòu)自德 國(guó)微生物保藏中心，pTrc99A購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心。
2. PHB表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
基本方法是將來(lái)源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌04/^//^"^ wfro; /H^ )、肥大產(chǎn)堿桿菌 (v4/cfl//ge"ey /"to)、 自養(yǎng)黃桿菌(Jf朋^zo6o!"er做to的/ /n'ciw)、 巨大芽孢桿菌(5鎖7/z^ megafen'i^)或惡臭假單胞菌(尸"wcfowo"o pw"A)的PHB合成酶基因pMC4S克隆至環(huán) 境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒中，獲得PHB表達(dá)重組質(zhì)粒。
上述PHB合成酶基因；^6CAS的來(lái)源菌株優(yōu)選真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Ol e^ra/7/m力。
根據(jù)Genbank公布的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的基因組序列，設(shè)計(jì)引物如下
PHB primer<formula>formula see original document page 6</formula>PHB primer <formula>formula see original document page 6</formula>-3'
以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的基因組序列為模板，PCR體外擴(kuò)增pM;C45基因簇。
將上述PCR所得到的； ^C4B片段和重組質(zhì)粒利用Sw"/和進(jìn)行雙酶切處 理，反應(yīng)條件為五coi /于37。C下，Sma/于3(TC下進(jìn)行。酶切時(shí)間為12h-16h。將酶 切反應(yīng)液利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化。然后利用T4連接酶連接，反應(yīng)溫度為 16°C-22°C， 16h。從而獲得表達(dá)戶/76C4B的重組質(zhì)粒。
所述PHB合成酶基因/7M)C4B為來(lái)源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的PHB合成過(guò)程中的三個(gè)關(guān) 鍵酶基因酮基硫酯酶(p^S)，羥基丁酰CoA脫氫酶(pM^)及PHB聚合酶(p/76C)。
進(jìn)一步的優(yōu)選方式，pW)C4S片段和重組質(zhì)粒pEPI利用Swa/和五coi /進(jìn)行雙酶切 處理，然后利用T4連接酶連接，獲得表達(dá)/;M)C4萬(wàn)的重組質(zhì)粒pEPI-/7Z)C45。
3. 產(chǎn)PHB重組大腸桿菌的構(gòu)建及p秘C4S表達(dá)重組質(zhì)粒的擴(kuò)增
基本方法是將含有表達(dá)C45重組質(zhì)粒的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655、 JM109、 W3110、 DH5a或XLl-blue，通過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選產(chǎn)PHB重組大腸桿菌。
進(jìn)一步的優(yōu)選方式，將含有表達(dá)戶/^C4B重組質(zhì)粒pEPI-戶MC45的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得產(chǎn)PHB的重組大腸桿菌DH5a/pEPI-p/^C45。 (4).發(fā)酵重組大腸桿菌生產(chǎn)PHB并檢測(cè)
發(fā)酵重組大腸桿菌的發(fā)酵條件為溫度設(shè)為30 4(TC，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為150 300轉(zhuǎn)/ 分，發(fā)酵時(shí)間36h 72h;
發(fā)酵培養(yǎng)基組成為Na2HP04 6g/L 、KH2P04 3g/L、NaCl 0.5g/L、 NH4C1 lg/L、 酵母浸出物 2g/L 4g/L、 MgS04 2mmol/L、 CaCl2 0.1mmol/L、葡萄糖 10g/L 30g/L。
挑取LB平板中篩選后的產(chǎn)PHB重組大腸桿菌，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán) 于20 100 ml并加有終濃度為50 150微克/毫升的氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 4(TC條件下，150 300轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)8 16小時(shí)，制得種子液；以1% 5%的 接種量轉(zhuǎn)接入裝有100 400ml培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中。發(fā)酵條件為30 40。C，150 300轉(zhuǎn)/分鐘。發(fā)酵36 72小時(shí)，每間隔4小時(shí)取樣。
進(jìn)一步的優(yōu)選方式，發(fā)酵重組大腸桿菌的發(fā)酵條件為溫度設(shè)為37'C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè) 為250轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間44h 48h。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為Na2HP04 6g/L 、 KH2P04 3g/L、 NaCl 0.5g/L、 NH4C1 lg/L、酵母浸出物 2g/L、MgS04 2mmol/L、CaCl2 O,lmmol/L、 葡萄糖20g/L。
PHB發(fā)酵檢測(cè)
收集細(xì)胞:將所取的發(fā)酵液樣品在4,000 5,000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心10 30分鐘， 收集沉淀細(xì)胞，使用蒸熘水洗滌細(xì)胞2 3次后，4，000 5,000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 30分鐘 收集細(xì)胞，烘干后稱其干重。
將所得的干菌體，加入150微升的98%硫酸，沸水浴中加熱60-90分鐘，然后利用 15M的氨水調(diào)節(jié)pH至2.2 2.6，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，HPLC(高壓液相色譜)檢測(cè)PHB含
量。檢測(cè)條件為分析柱C18; 1%。的甲酸作流動(dòng)相；紫外檢測(cè)器；紫外波長(zhǎng)為210nm。
本發(fā)明通過(guò)分析分析五.co//中環(huán)境壓力應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，首次利用基因工 程技術(shù)成功構(gòu)建了環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)用于PHB的發(fā)酵生產(chǎn)。實(shí)現(xiàn)了在環(huán)境脅迫條件 下大腸桿菌自發(fā)調(diào)控j^KMB基因的表達(dá)，積累PHB的過(guò)程。發(fā)酵結(jié)果表明，在不添 加任何人工誘導(dǎo)劑的條件下，重組大腸桿菌DH5a/pEPI-j^6C4S PHB含量高達(dá)到細(xì)胞干 重的85.7%。本發(fā)明不僅解決了以往誘導(dǎo)劑添加問(wèn)題，同時(shí)獲得了 PHB的高效率發(fā)酵菌 株，從而大大降低了 PHB發(fā)酵生產(chǎn)的成本，為PHB的大工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)找到了新的方法， 該方法具有極為重要的廣泛的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明構(gòu)建的環(huán)境脅迫誘導(dǎo)型質(zhì)粒pEPI的酶切圖譜。
圖2為本發(fā)明構(gòu)建的； /^C4jB表達(dá)質(zhì)粒pEPI-;^6c45的酶切圖譜。
圖3為本發(fā)明所構(gòu)建的重組大腸桿菌DH5a/pEPI-pMC4B的熒光顯微照片。
圖4為重組大腸桿菌DH5a/pEPI-/^Z>C^發(fā)酵結(jié)果(A)與對(duì)照組DH5a/pBluescript
SK-phbCAB發(fā)酵結(jié)果(B)的比較，其中對(duì)照組添加需要添加IPTG誘導(dǎo);^6c4b基因
的表達(dá)，而DH5a/pEPI-; /^C45不添加任何誘導(dǎo)劑。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
1. 大腸桿菌MG1655基因組的提取
根據(jù)細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明提取大腸桿菌MG1655的基因組，并通過(guò)瓊脂糖 電泳檢測(cè)。瓊脂糖濃度為質(zhì)量百分比0.8%。
2. 環(huán)境誘導(dǎo)型片斷(EPI)的克隆
根據(jù)GenBank上公布大腸桿菌的基因組序列(2865574-2866200),設(shè)計(jì)引物 pEPI primer 1: 5'- AATACATGTCCATACGCGCTGAACGTTGGTCA-3'與 pEPI primer 2: 5 '-ATACCCGGGAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCCCT-3'
以所提取的大腸桿菌MG1655的基因組為模板，利用PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體外 擴(kuò)增環(huán)境誘導(dǎo)型片斷序列。 PCR反應(yīng)體系如下(引物濃度為20pmol/L) 10x緩沖液 5u1; 25mmol/L MgCl2 4pl;
10mmol/L 四種dNTP混合液1^1;
上下游引物各 1(u1; TaqDNA聚合酶 0.5|al; 模板DNAlpl，加水補(bǔ)至50pl;
PCR反應(yīng)條件9 7°C預(yù)變性10分鐘，9fC變性60秒，58。C退火30秒，72'C延伸60 秒,30個(gè)循環(huán)后72i:延伸10分鐘，4'C保存。電泳檢測(cè)片段的大小。瓊脂糖濃度為0.8%。
引物中下劃線部分為相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，前引物中為Ac/酶切位點(diǎn)，后者為Swa/酶
切位點(diǎn)。
3. 環(huán)境脅迫誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
(1) 酶切反應(yīng)
將環(huán)境誘導(dǎo)型片斷與pBluescript SK—利用pscl和Swa/核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切消 化。Ac/酶切反應(yīng)溫度為3 7°C， Swa/酶切反應(yīng)溫度為30°C。然后利用PCR產(chǎn)物回收 試劑盒(購(gòu)自O(shè)MEGA公司)回收純化酶切的片段。
(2) 連接反應(yīng)
利用T4連接酶(購(gòu)買(mǎi)于MBI公司)連接，反應(yīng)組成體系為 環(huán)境誘導(dǎo)型片斷6u1 pBluescript SIC片斷2|il
連接液緩沖液(10X): 1u1 T4連接酶1u1
連接反應(yīng)在22。C下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)，反應(yīng)體系為10|al。經(jīng)連接后得到重 組環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pEPI。
(3) 感受態(tài)細(xì)胞的制備
挑取LB平板中的大腸桿菌DH5a,培養(yǎng)過(guò)夜；將培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌DH5a按照1% 的接種量轉(zhuǎn)入裝有50mlLB的300ml的三角瓶中培養(yǎng)，于37。C、 225轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)至 OD6。o為0.4。停止培養(yǎng)，置冰上20分鐘，(C， 4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄上清， 加入冰冷的0.1mol/L的CaCl2溶液懸浮，冰上靜置30分鐘。離心濃縮。獲得感受態(tài)細(xì) 胞。放于-70'C保存。
(4)重組環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pEPI的驗(yàn)證擴(kuò)增
將含有重組質(zhì)粒pEPI的10pl的連接液加入100^1的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，混勻； 置冰上30分鐘；42。C熱激，冰上靜置2分鐘，加入900pl的LB培養(yǎng)基，3 7°C, 100轉(zhuǎn) /分鐘，培養(yǎng)1小時(shí)。將轉(zhuǎn)化液涂布于含有質(zhì)量體積比為1.5%的瓊脂并加有終濃度為 100微克/毫升的氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，37'C條件下，靜置培養(yǎng)16小時(shí)， 挑取單菌落篩選轉(zhuǎn)化子。
將單菌落挑取轉(zhuǎn)入含有100微克/毫升的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 225 轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)過(guò)夜。利用質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒pEPI，驗(yàn)證質(zhì)粒的大小。
重組質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖1。 實(shí)施例2、 PHB重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
PHB重組大腸桿菌的構(gòu)建
將PHB合成酶基因/7/^C4S插入到重組質(zhì)粒pEPI的多克隆位點(diǎn)處，構(gòu)建PHB合成
酶表達(dá)重組質(zhì)粒，命名為pEPI卞/^C4B。將所構(gòu)建的PHB合成酶表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大
腸桿菌，培養(yǎng)檢測(cè)PHB在該環(huán)境誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控下積累。
(1) PHB重組質(zhì)粒pEPI卞/z6C45的構(gòu)建
根據(jù)Genbank公布的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的基因組序列，設(shè)計(jì)引物如下 PHB primer 1: 5'-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3' PHB primer 2: 5'-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3' 以以真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的基因組序列為模板為模板，PCR體外擴(kuò)增;^6C4S基因簇。 將上述PCR所得到的pM)C4S片段和質(zhì)粒pEPI利用5V^/(30。C)和五coi /(37。C)進(jìn)
行雙酶切消化，反應(yīng)時(shí)間為16h,然后利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(購(gòu)買(mǎi)于OMEGA公司)
回收純化。利用T4連接酶連接，反應(yīng)組成體系為 phbCAB基因片段6^1 pEPI片斷2nl
連接液緩沖液(10X): l)Lll T4連接酶1^1
連接反應(yīng)在22。C下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)，反應(yīng)體系為10^1。經(jīng)連接后得到批 HB重組表達(dá)質(zhì)粒pEPI-/ /^C45，該重組質(zhì)粒pEPI-;^6C4S存于連接液中。
所述PHB合成酶基因p/zKMS為來(lái)源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的PHB合成過(guò)程中的三個(gè)關(guān)鍵 酶基因酮基硫酯酶(pM萬(wàn))，羥基丁酰CoA脫氫酶(p/z^4)及PHB聚合酶(pMQ。
實(shí)施例3、 PHB重組大腸桿菌的構(gòu)建
將含有重組環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒pEPI的連接液加入lOOpl的DH5a感受態(tài)細(xì)胞中， 混勻；置冰上30分鐘；42X:熱激，冰上靜置2分鐘，加入卯O[il的LB培養(yǎng)基，37°C， 100轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)1小時(shí)。將轉(zhuǎn)化液涂布于含有質(zhì)量體積比為質(zhì)量體積比為2.0%的瓊 脂并加有終濃度為100微克/毫升的氨節(jié)青霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上，37t:條件下， 靜置培養(yǎng)16小時(shí)，調(diào)取單菌落篩選轉(zhuǎn)化子。即將單菌落挑取轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中，37°C ， 225轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)過(guò)夜(培養(yǎng)基中添加氨芐青霉素至終濃度為100微克/毫升)。離心菌 體，利用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)買(mǎi)于TIAN GEN公司)提取重組質(zhì)粒pEPI，并驗(yàn)證質(zhì)粒的 正確性。含有pEPI-p/^C^重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a命名為DH5a/pEPI-/ /^C45。
重組質(zhì)粒pEPI-;;/^C4S酶切圖譜見(jiàn)圖2。
實(shí)施例4、 PHB重組大腸桿菌DH5a/pEPI-/;/^C45的發(fā)酵及檢測(cè)
培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基
Na2HP04 6g/L KH2P04 3g/L NaCl 0.5g/L NH4C1 lg/L 酵母浸出物 2g/L MgS042mmol/L CaCl2 O.lmmol/L 葡萄糖 20g/L 。
挑取LB平板中的PHB重組大腸桿菌DH5a/pEPI-/7/^ClS,在無(wú)菌條件下用接種環(huán) 接1環(huán)于50 ml并加有終濃度為100微克/毫升的氨芐青霉素的M9加富培養(yǎng)基中(添加 2%的葡萄糖)，37'C條件下，250轉(zhuǎn)/分鐘搖床振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，制得種子液；以2%的 接種量轉(zhuǎn)接入裝有200ml培養(yǎng)基的1000ml三角瓶中。發(fā)酵條件為37。C， 250轉(zhuǎn)/分鐘。 其中對(duì)照組為重組大腸桿菌DH5a/pBluescript SK—-—6C4&對(duì)照組培養(yǎng)至12h，向發(fā)酵液 中加入IPTG至IPTG終濃度達(dá)為0.4毫摩爾/升。發(fā)酵時(shí)間為48小時(shí)，每間隔4小時(shí)取 樣。
所述質(zhì)粒pBluescript SK-卞/^C4S為帶有pMC4B基因的pBluescript SIC質(zhì)粒，通過(guò) IPTG的誘導(dǎo)而表達(dá)。構(gòu)建所用引物為PHB primer 1與PHB primer 2。
PHB發(fā)酵檢測(cè)
收集細(xì)胞將所取的發(fā)酵液樣品在4,000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，收集沉淀 細(xì)胞，使用蒸餾水洗滌細(xì)胞2次后，4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘收集細(xì)胞，烘干后稱其干 重。
PHB檢測(cè)將所得的干菌體，加入150微升的濃硫酸沸水浴中加熱60分鐘，然后 利用15y。的氨水調(diào)節(jié)pH至2.5，經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾后，HPLC(高壓液相色譜)檢測(cè)PHB含 量。檢測(cè)條件為分析柱C18; 1%。的甲酸作流動(dòng)相；紫外檢測(cè)器；紫外波長(zhǎng)為210nm。 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。
通過(guò)熒光顯微照片圖3可以看出,重組大腸桿菌DH5a/pEPI-;^6C4i5細(xì)胞內(nèi)的明顯 的PHB顆粒。
通過(guò)圖4可以看出，重組大腸桿菌DH5a/pEPI-; ^C^在不添加任何誘導(dǎo)劑的條件 下可以以廉價(jià)的葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)PHB， PHB含量達(dá)到85.7%。而對(duì)照組 DH5a/pBluescript SK.-;7^C45在添加IPTG為誘導(dǎo)劑的條件下，PHB含量為45%。結(jié)果 表明該表達(dá)系統(tǒng)可以高效的用于PHB的非人工誘導(dǎo)型發(fā)酵生產(chǎn)。
因此，利用該表達(dá)系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)PHB的方法在實(shí)際大工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中具有巨大的 應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，其步驟包括 (1)一種環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建； (2)聚羥基脂肪酸酯表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建； (3)獲得產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的重組大腸桿菌； (4)發(fā)酵重組大腸桿菌生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯并檢測(cè)；其特征是步驟(1)所述環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法是以大腸桿菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue基因組為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)引物PCR體外擴(kuò)增環(huán)境誘導(dǎo)片段并將其命名為EPI；將EPI作為啟動(dòng)子插入到質(zhì)粒pBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A中，取代原來(lái)的啟動(dòng)子序列，獲得重組環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒；步驟(2)所述聚羥基脂肪酸酯表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建的方法是將來(lái)源于真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes．latus)、自養(yǎng)黃桿菌(Xanthobacterautotrophicus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus.megaterium)或惡臭假單胞菌(Pseudomonas.putida)的聚羥基脂肪酸酯合成酶基因phbCAB克隆至環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒中，獲得聚羥基脂肪酸酯表達(dá)重組質(zhì)粒；步驟(3)所述獲得產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的重組大腸桿菌的方法是將聚羥基脂肪酸酯表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue，獲得產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的重組大腸桿菌；步驟(4)所述發(fā)酵重組大腸桿菌的發(fā)酵條件為溫度設(shè)為30～40℃，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為150～300轉(zhuǎn)/分，發(fā)酵時(shí)間36h～72h；發(fā)酵培養(yǎng)基組成為Na2HPO4 6g/L、KH2PO4 3g/L、NaCl 0.5g/L、 NH4Cl 1g/L、酵母浸出物2g/L～4g/L、MgSO4 2mmol/L、CaCl2 0.1mmol/L、葡萄糖10g/L～30g/L。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是步驟 (1)所述環(huán)境誘導(dǎo)片段含有Prp。s及Prp。s下游的受DsrA調(diào)控的序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是步驟(1)所述模板是大腸桿菌MG1655或W3110的基因組;體外擴(kuò)增環(huán)境誘導(dǎo)片斷的引物是 pEPI primer 1: 5'-AATACATGTCCATACGCGCTGAACGTTGGTCA陽(yáng)3' pEPI primer 2: 5'-ATACCCGGGAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCCCT-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是步驟(1) 所述EPI作為啟動(dòng)子插入到質(zhì)粒pBluescript SK—中的Ac/酶切位點(diǎn)與Swa/酶切位 點(diǎn)之間，獲得重組環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒，命名為pEPI。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是步驟(2) 所述聚羥基脂肪酸酯合成酶基因pMC45的來(lái)源菌株是真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(A ew加/ /2—。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是步驟(2) 所述獲得的聚羥基脂肪酸酯表達(dá)重組質(zhì)粒是pEPI-如6C4仏
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是步驟(3) 所述聚羥基脂肪酸酯表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，獲得產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的 重組大腸桿菌DH5a/pEPI-p/^C45。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是步驟(4) 所述發(fā)酵重組大腸桿菌的發(fā)酵條件為溫度設(shè)為37'C，搖床轉(zhuǎn)速設(shè)為250轉(zhuǎn)/分，發(fā) 酵時(shí)間44h 48h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，其特征是步驟 (4)所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成為Na2HP04 6g/L 、 KH2PQ4 3g/L、 NaCl 0.5g/L、 NH4C1 lg/L、酵母浸出物 2g/L、 MgS04 2mmol/L、 CaCl2 O.lmmol/L、葡萄糖 20g/L。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用工程菌株生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHA)的方法，是通過(guò)構(gòu)建環(huán)境誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)PHB合成酶基因phbCAB，在不添加任何誘導(dǎo)劑的條件下，phbCAB基因通過(guò)環(huán)境脅迫等外界條件的誘導(dǎo)而表達(dá)，從而催化聚羥基脂肪酸酯(PHA)的合成。發(fā)酵結(jié)果表明，在不添加任何人工誘導(dǎo)劑的條件下，重組大腸桿菌DH5α/pEPI-phbCAB PHB含量高達(dá)到細(xì)胞干重的85.7％。本發(fā)明中重組大腸桿菌DH5α/pEPI-phbCAB具有重要的應(yīng)用前景和價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101363034SQ20081013888
公開(kāi)日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月8日
發(fā)明者振 康, 祁慶生 申請(qǐng)人:山東大學(xué)