專利名稱：一種酶法拆分外消旋乳酸生產d-乳酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種D-乳酸的制備方法，尤其涉及一種利用微生物產生的NAD (煙酰 胺腺嘌呤雙核苷酸)非依賴性L-乳酸脫氫酶拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法。
技術背景乳酸在化工、制藥等工業及科學研究中有著廣泛的用途。乳酸分為L-乳酸，D-乳 酸以及外消旋乳酸(DL-乳酸)。由乳酸單體聚合合成生物可降解性高聚物聚乳酸是當今 生態塑料研究的熱點《Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 74， 524 - 534. Fermentative production of lactic acid from biomass: an overview on process developments and future perspectives.》。由于L-聚乳酸與D-聚乳酸摻合可以大大 改善聚乳酸的耐熱性問題，使得D-乳酸生產的研究受到廣泛的關注《Macromo1. Biosci. 2005, 5, 569 - 597. Poly (lactide) stereocomplexes: formation, structure, properties, degradation, and applications.》。D-乳酸的生產主要依靠發酵法進行，乳酸菌在該領域得到廣泛應用，然而乳酸菌對 培養基成分的要求比較苛刻。基因工程手段同樣應用于該領域的研究，基因工程菌的乳 酸產量及生產效率均低于乳酸菌。高效D-乳酸生產菌株的難于獲得，制約了D-乳酸的 發酵法生產《Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008， 78， 449 - 454. Production of D-lactic acid by Cory/ze^ac^ri〃/z ^Z〃te/ ic譜under oxygen deprivation.》。生物催化法同樣有報道應用于D-乳酸的生產。粟武，魏東芝等在《Tetrahedron: Asymmetry 2004， 15， 1275 - 1277. Enantioselective oxidation of racemic 1， 2_propanediol to D-(-)-lactic acid by C7t/co/7oZ) 3cter oxjokas.》 一文中，以氧 化葡萄糖酸桿菌為催化劑，立體選擇性催化外消旋2， 3-丙二醇，得到對映體過量值大 于99X的D-乳酸，底物轉化率48% (接近理論轉化率)。在底物外消旋2， 3-丙二醇高 于20克/升的條件下需要通過調節pH等手段保證產物D-乳酸的高對映體過量值。Kenji Soda等在《J Mol. Catal. B-Enzym. 2001， 11， 149 - 153. One-pot chemo-enzymatic enantiomerization of racemates.》 一文中，報道了酶法-化學法相耦聯，以DL-乳酸 為底物，L-乳酸氧化酶作為催化劑，硼氫化鈉為還原劑，催化DL-乳酸生成D-乳酸的工 藝。上述反應所用底物DL-乳酸的濃度僅為5毫摩爾/升，并且過程產生副產物過氧化 氫。由于乳酸的工業化應用對乳酸光學純度的要求，外消旋乳酸的應用受到很大限制， 因此造成外消旋乳酸的價格遠低于L-乳酸，D-乳酸的價格。如果立體選擇性催化外消 旋乳酸中的L-乳酸生成丙酮酸，針對性保留D-乳酸，即可以通過催化過程以外消旋乳 酸為底物生成D-乳酸以及另外一種重要的化工中間體-丙酮酸，這在技術上是可行的， 生產上是極為經濟的。經檢索利用微生物的NAD非依賴性乳酸脫氫酶(iLDH)拆分外消旋乳酸制備D-乳酸 的方法目前還未見報道。 發明內容針對外消旋乳酸應用的限制以及現有D-乳酸生產方法的不足，本發明要解決的問題是提供一種利用含有NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶的生物催化劑拆分外消旋乳酸制備 D-乳酸的方法。該方法具有底物利用率高(同時生產兩種工業合成中間體)、產物純度 高、后提取簡便等特點。本發明的技術方案是基于申請人的前期研究，見《Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007， 77, 91 _98. Membrane-bound L- and D-lactate dehydrogenase activities of a newly isolated psewt/cw/cwss sfuz^er/ strain.》——文，申i青人手艮道了施氏假單胞 菌SDM中含有D型和L型兩種NAD非依賴性乳酸脫氫酶，能分別立體選擇性催化L-乳 酸、D-乳酸生成丙酮酸，其中NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶具有較高的溫度穩定性。本 發明在這一基礎上，通過培養施氏假單胞菌得到的生物催化劑——NAD非依賴性乳酸脫 氫酶，以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活，再立體選擇性催化外消旋 乳酸生成D-乳酸和丙酮酸，反應式如下外消旋乳酸 D-乳酸 丙酮酸本發明的酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，步驟如下(1) 含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液或粗酶液的制備選取施氏假單胞 菌(Pw/ob/wmss st〃teeri) S麗CCTCC No.M206010 (申請人已于2006年1月15日保藏 于中國典型培養物保藏中心(CCTCC))，常規培養并發酵至NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶 活達到200 250單位/升時，終止發酵培養；分離并收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體2 4次，再將菌體重懸于pH7. 2 7. 5、 67±3毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體濃度 達到5 60克干細胞/升，得到含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液；或者用超聲 波破碎完整細胞得含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液或粗酶液置于45 65'C水浴中處理5 60分鐘，得 到僅含有NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為100 700毫摩爾/升，生物催化劑濃度為1 15克干細胞 /升；然后在25 40。C， pH值6.0 8. 0條件下，160 200轉/分鐘振蕩10 20小時， 進行生物催化劑對外消旋乳酸的拆分，最終得到含有乳酸和丙酮酸的轉化液；(4) 轉化液預處理將步驟(3)反應后的轉化液以5，000 10,000轉/分轉速， 離心5 10分鐘，去除沉淀，上清液屮含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂Amberlite IRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以0.5 3倍柱體積/小時的流速上樣1 3倍柱體積; 去離子水以0. 5 3倍柱體積/小時的流速淋洗1 3倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗 脫液；然后0. 5 2. 5摩爾/升鹽酸以0. 5 3倍柱體積/小時的流速逆流洗脫1 3倍柱 體積，收集得到含丙酮酸的洗脫液；OH OHjj i^'et/(io;no,ras rf 'zeh SDM =gNAD非依賴性L-乳酸脫氫酶 8、 -^ 'C、 +H3C'、COOH H3CT 、COOH:noco/\c3:n(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗 脫液分別在真空度0. 075 0. 095兆帕，溫度45 7(TC的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸產品。利用高效液相(HPLC)測定D-乳酸和丙酮酸成品的含量及D-乳酸的對映體過量值， D-乳酸和丙酮酸的成品的含量測定采用Agilent1100色譜系統，色譜柱為反向C18柱 (150X4.6毫米，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，美國Agilent公司)，分析條件 為以l毫摩爾/升硫酸甲醇(體積比為96: 4)為流動相，柱溫25'C，流速為i毫升/ 分鐘，進樣量5微升，紫外檢測器波長為254納米。D-乳酸對映體過量值測定采用 AgilentllOO色譜系統，色譜柱為手性柱(50X4. 6毫米，MCIGEL CRS10W， R本三菱化 學)，以2毫摩爾/升硫酸銅水溶液作為流動相，柱溫25'C，流速為0.5毫升/分鐘， 進樣量5微升，紫外檢測器波長為254納米。待測樣品用兩倍體積的高氯酸(5%)酸 化，4'C靜置2小時后，12000轉/分鐘離心15分鐘，離心上清用0. 45微米的水相濾膜 過濾，然后HPLC分析樣品。上述酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法中步驟(1)所述菌體的濃度優選為35 60克干細胞/升。步驟(2)所述完整細胞懸液或者粗酶液熱處理溫度優選為50 6(TC。步驟(2)所述完整細胞懸液或者粗酶液熱處理時間優選為5 30分鐘。步驟(3)所述DL-乳酸鈉的濃度優選為300 600毫摩爾/升。步驟(3)所述生物催化劑濃度優選為6 12克干細胞/升。步驟(3)所述溫度優選為30 37°C，所述pH值優選為6.5 7.5，所述振蕩轉速 優選為180轉Z分鐘。步驟(4)所述離心轉速優選為8， 000 10， 000轉/分，離心時間優選為7~10分鐘。 步驟(5)所述上樣流速優選為1 2倍柱體積/小時，上樣體積優選為1.5 2.5倍柱體積，去離子水淋洗流速優選為1 2倍柱體積/小時，去離子水淋洗體積優選為1.5 2.5倍柱體積，鹽酸濃度優選為1 2摩爾/升，鹽酸逆流洗脫流速優選為1 2倍柱體積/小時，鹽酸逆流洗脫體積優選為1. 5 2. 5倍柱體積。步驟(6)所述真空度優選為0.08 0.09兆帕，溫度優選為55 65°C。 在上述方法中，酶活的單位(U)定義為37°C，每分鐘催化底物乳酸轉化生成1微摩爾丙酮酸的酶量為一個酶活單位(U)。本發明是一種利用熱變性使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活，獲得僅NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶有活力的生物催化劑，使外消旋乳酸中的L-乳酸被選擇性的轉化為丙酮酸，從而制備D-乳酸的方法。 本發明具有以下特點(1) 菌株要求的培養基簡單、生長周期短，成本低。(2) 能拆分價格低的外消旋乳酸，生產D-乳酸，底物成本低。(3) 可作用的底物濃度高。(4) 拆分所得另外一種產物丙酮酸同樣具很高經濟價值。(5) 底物轉化率高，產物穩定。(6) 生物催化劑可以用過濾法或離心法去除，后續分離提取費用低廉。(7) 兩種產物可以簡單分離，高純度產物容易得到。(8) 產物D-乳酸對映體過量值高(高于99.5%)。
具體實施方式
實施例l:利用尸.s""er2'S簡粗酶液拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法(1) 含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液的制備選用施氏假單胞菌(/^m/OT/朋3Sst"teeri) S函CCTCC No. M206010菌株(該菌株申請人已于2006年1月15日保藏于中國 典型培養物保藏中心)接種于含有L 5%的瓊脂糖并加有0. 5XDL-乳酸鈉的固體斜面基 本培養基上，30'C培養20小時。將上述培養的菌株，無菌條件下用接種環接1 2環于50 毫升含有0.5XDL-乳酸鈉的液體基本培養基中，30'C條件下，在搖床上180轉/分鐘振蕩 培養10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有1WDL-乳酸鈉的液體基本培養基中， 30'C條件下，在搖床上振蕩培養至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達到250單位/升時，終 止發酵培養；發酵液5,000轉/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌3次；再將菌 體重懸于pH7.4、 67毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達到45克干細胞/升， 用超聲波破碎菌體細胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分鐘，得含NAD非依賴性 乳酸脫氫酶的粗酶液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液置于55"C水浴中處理10分鐘，得到僅含NAD非依賴性L-乳 酸脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為500毫摩爾/升，生物催化劑濃度為9克干細胞/升；然后 在3(TC， pH 7. 0條件下，180轉/分鐘振蕩10小時，實現生物催化劑對外消旋乳酸的 拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉化液；(4) 轉化液預處理將步驟(3)反應后的轉化液以8,000轉/分轉速，離心10 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AmberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以1.5倍柱體積/小時的流速上樣2倍柱體積，去離子 水以1. 5倍柱體積/小時的流速淋洗2倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液;然后1. 5 摩爾/升鹽酸以1. 5倍柱體積/小時的流速逆流洗脫2倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗 脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗 脫液分別在真空度0. 085兆帕，溫度60°C的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸 產品。高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為90. 3% (質量體積比)，對映體過量值為99. 8 %，丙酮酸濃度為89.8% (質量體積比)。實施例2:利用尸."y^eri SDM粗酶液拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法(1)含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液的制備選用施氏假單胞菌(A'ew/鵬o朋s "wteer。 SDM CCTCC No. M206010菌株接種于含有l. 5%的瓊脂糖并加有O. 5XDL-乳酸 鈉的固體斜面基本培養基上，3(TC培養20小時。將上述培養的菌株，無菌條件下用接種環接l 2環于50毫升含有0.5XDL-乳酸鈉的液體基本培養基中，30'C條件下，在搖床上 180轉/分鐘振蕩培養10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有lXDL-乳酸鈉的液體基本培養基中， 3(TC條件下，在搖床上振蕩培養至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達到220單位/升時，終 止發酵培養；發酵液5,000轉/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌2次；再將菌 體重懸于pH7.2、 64毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達到5克干細胞/升， 用超聲波破碎菌體細胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分鐘，得含NAD非依賴性 乳酸脫氫酶的粗酶液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液置于45'C水浴中處理60分鐘，得到僅含NAD非依賴性L-乳 酸脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物屮DL-乳酸鈉的濃度為100毫摩爾/升，生物催化劑濃度為1克干細胞/升；然后 在25°C， pH 6. 0條件下，160轉/分鐘振蕩15小時，實現生物催化劑對外消旋乳酸的 拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉化液；(4) 轉化液預處理將步驟(3)反應后的轉化液以10,000轉/分轉速，離心5 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AmberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以3倍柱體積/小時的流速上樣1倍柱體積，去離子水 以3倍柱體積/小時的流速淋洗l倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液；然后0.5摩 爾/升鹽酸以3倍柱體積/小時的流速逆流洗脫1倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗 脫液分別在真空度0. 075兆帕，溫度7(TC的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸 產品。高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為89. 5% (質量體積比)，對映體過量值為99. 6 %，丙酮酸濃度為89.4% (質量體積比)。實施例3:利用/3. 5"teen' SDM粗酶液拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法(1)含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液的制備選用施氏假單胞菌(尸seyflb歷朋as 5twteeri) SDM CCTCC Ko. M206010菌株接種于含有l. 5%的瓊脂糖并加有0. 5%DL-乳酸 鈉的固體斜面基本培養基上，3(TC培養20小時。將上述培養的菌株，無菌條件下用接種 環接1 2環于50毫升含有0.5% DL-乳酸鈉的液體基本培養基中，3(TC條件下，在搖床 上180轉Z分鐘振蕩培養10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有l^DL-乳酸鈉的液體基本培養基中， 3(TC條件下，在搖床上振蕩培養至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達到200單位/升時，終 止發酵培養；發酵液5，000轉/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌4次；再將菌 體重懸于pH7.5、 70亳摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達到60克千細胞/升， 用超聲波破碎菌體細胞，功率600瓦，作用5秒，停5秒，破碎10分鐘，得含NAD非依賴性 乳酸脫氫酶的粗酶液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液置于65'C水浴中處理5分鐘，得到僅含NAD非依賴性L-乳酸 脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為700毫摩爾/升，生物催化劑濃度為15克干細胞/升；然 后在40'C， pH 8.0條件下，200轉/分鐘振蕩20小時，實現生物催化劑對外消旋乳酸 的拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉化液；(4) 轉化液預處理將步驟(3)反應后的轉化液以5,000轉/分轉速，離心10 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AmberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以0.5倍柱體積/小時的流速上樣3倍柱體積，去離子 水以0. 5倍柱體積/小時的流速淋洗3倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液;然后2. 5 摩爾/升鹽酸以0. 5倍柱體積/小時的流速逆流洗脫3倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗 脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗 脫液分別在真空度0. 095兆帕，溫度45'C的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸 產品。高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為88. 7% (質量體積比)，對映體過量值為99. 7 %，丙酮酸濃度為89.7% (質量體積比)。實施例4:利用尸.sto&eri SDM完整細胞懸液拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法(1) 含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液的制備選用施氏假單胞菌 (尸se"oWo朋s st"&eW) SDM CCTCC No. M206010菌株接種于含有l. 5%的瓊脂糖并加有0.5XDL-乳酸鈉的固體斜面基本培養基上，3(TC培養20小時。將上述培養的菌株，無 菌條件下用接種環接1 2環于50毫升含有0.5^DL-乳酸鈉的液體基本培養基中，3(TC條 件下，在搖床上180轉/分鐘振蕩培養10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有1% DL-乳酸鈉的液體基本培養基 中，3(TC條件下，在搖床上振蕩培養至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達到250單位/升時， 終止發酵培養；發酵液5，000轉/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌3次；再將菌 體重懸于pH7.4、 67毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達到45克干細胞/升， 得到含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液置于65'C水浴中處理5分鐘，得到僅含NAD非依賴性 L-乳酸脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為700毫摩爾/升，生物催化劑濃度為15克干細胞/升；然 后在4(TC， pH 8. 0條件下，200轉/分鐘振蕩20小時，實現生物催化劑對外消旋乳酸 的拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉化液；(4) 轉化液預處理將步驟(3)反應后的轉化液以5,000轉/分轉速，離心10 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AmberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以0.5倍柱體積/小時的流速上樣3倍柱體積，去離子 水以0. 5倍柱體積/小時的流速淋洗3倍柱體積，收集得到含!3-乳酸的洗脫液;然后2. 5 摩爾/升鹽酸以0. 5倍柱體積/小時的流速逆流洗脫3倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗 脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脫 液分別在真空度0.095兆帕，溫度45'C的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸產品。 高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為88.7X (質量體積比)，對映體過量值為99.7%，丙 酮酸濃度為89.7% (質量體積比)。實施例5:利用尸.s&teeri SDM完整細胞懸液拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法(1) 含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液的制備選用施氏假單胞菌 (/^eyob舶"as "i/f犯rj') SDM CCTCC No. M206010菌株接種于含有l. 5%的瓊脂糖并加有0.5MDL-乳酸鈉的固體斜而基本培養基上，3(TC培養20小時。將上述培養的菌株，無 菌條件下用接種環接1 2環于50毫升含有0.5XDL-乳酸鈉的液體基本培養基中，3(TC條 件下，在搖床上180轉/分鐘振蕩培養10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有1XDL-乳酸鈉的液體基本培養基中， 30。C條件下，在搖床上振蕩培養至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達到200單位/升時，終 止發酵培養；發酵液5，000轉/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌3次；再將菌 休重懸于pH7.5、 70毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達到60克干細胞Z升， 得到含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液置于55'C水浴中處理10分鐘，得到僅含NAD非依賴 性L-乳酸脫氫酶活力的生物催化劑，4'C儲存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將歩驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為500毫摩爾/升，生物催化劑濃度為9克干細胞/升；然后 在30'C， pH 7. 0條件下，180轉/分鐘振蕩10小時，實現生物催化劑對外消旋乳酸的 拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉化液；(4) 轉化液預處理將步驟(3)反應后的轉化液以8,000轉/分轉速，離心10 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AtnberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以1.5倍柱體積/小時的流速上樣2倍柱體積，去離子 水以1. 5倍柱體積/小時的流速淋洗2倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液;然后1. 5 摩爾/升鹽酸以1. 5倍柱體積/小時的流速逆流洗脫2倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗 脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脫 液分別在真空度O. 085兆帕，溫度6(TC的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸產品。 高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為89.9W (質量體積比)，對映體過量值為99.7。/^，丙 酮酸濃度為89.6% (質量體積比)。實施例6:利用尸.W"teeri SDM完整細胞懸液拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法(1) 含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液的制備選用施氏假單胞菌 (/^e"obfflo/7as sto^eri) SDM CCTCC No. M206010菌株接種于含有l. 5%的瓊脂糖并加有0.5XDL-乳酸鈉的固體斜面基本培養基上，3(TC培養20小時。將上述培養的菌株，無 菌條件下用接種環接1 2環于50毫升含有0.5^DL-乳酸鈉的液體基本培養基中，3(TC條 件下，在搖床上180轉/分鐘振蕩培養10小時，制得種子；以5% (體積比)接種量，接種子于150毫升含有l^DL-乳酸鈉的液體基本培養基中， 3(TC條件下，在搖床上振蕩培養至NAD非依賴性乳酸脫氫酶酶活達到220單位/升時，終 止發酵培養；發酵液5，000轉/分條件下離心10分鐘，收集菌體，并用生理鹽水洗滌2次；再將菌 體重懸于pH7.2、 64毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體的濃度達到5克干細胞/升， 得到含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液；(2) 以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD 非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液置于45'C水浴中處理60分鐘，得到僅含NAD非依賴 性L-乳酸脫氫酶活力的生物催化劑，4tM諸存，備用；(3) 對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使 混合物中DL-乳酸鈉的濃度為100毫摩爾/升，生物催化劑濃度為1克干細胞/升；然后 在25。C， pH6.0條件下，160轉/分鐘振蕩15小時，實現生物催化劑對外消旋乳酸的 拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉化液；(4) 轉化液預處理將步驟(3)反應后的轉化液以10， 000轉/分轉速，離心5 分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5) D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂AmberlitelRA45裝柱，處 理為氯型，將步驟(4)的上清液以3倍柱體積/小時的流速上樣l倍柱體積，去離子水 以3倍柱體積/小時的流速淋洗l倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液；然后0.5摩 爾/升鹽酸以3倍柱體積/小時的流速逆流洗脫1倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗脫液；(6) D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脫 液分別在真空度O. 075兆帕，溫度7(TC的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸產品。 高效液相檢測得到的D-乳酸濃度為89.6% (質量體積比)，對映體過量值為99.7%，丙 酮酸濃度為89.2% (質量體積比)。上述實施例中，固體斜面基本培養基配方(克/升)如下KH2P04 1， K2HP04'3H20 0.8， NH4C1 1， MgS04'7H20 0.5， CaCl2*2H20 0 . 05，金屬離 子混合液1.2毫升/升。調節pH 7.0， 115 'C條件下滅菌20分鐘，瓊脂粉15。 液體基本培養基配方(克/升)如下KH2P04 1， K2HP04'3H20 0.8， NH4C1 1， MgS04'7H20 0.5， CaCl2*2H20 0.05，金屬離 子混合液1.2毫升/升。調節pH 7.0， 115 'C條件下滅菌20分鐘。 金屬離子混合液的配方如下(克/升)Na2EDTA， 50; ZnS04 7H20， 20; MnCl2 4H20， 5; (NH4)6Mo7024 4H20， 1， ； FeS04 7H20，5; CuS04*5H20， 1.5; CoCl2*H20， 1.6; CaCl2 2H20， 5.5。上述實施例中，高效液相(HPLC)測定D-乳酸和丙酮酸成品的含量及D-乳酸的對 映體過量值的實施條件是D-乳酸和丙酮酸的成品的含量測定采用Agilent1100色譜系統，色譜柱為反向C18 柱(150X4.6毫米，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，美國Agilent公司)，分析條 件為以l毫摩爾/升硫酸甲醇(體積比為96: 4)為流動相，柱溫25'C,流速為l毫 升/分鐘，進樣量5微升，紫外檢測器波長為254納米。D-乳酸對映體過量值測定采用AgilentllOO色譜系統，色譜柱為手性柱(50X4.6 毫米，MCIGELCRS10W，日本三菱化學)，以2毫摩爾/升硫酸銅水溶液作為流動相，柱 溫25'C，流速為0.5毫升/分鐘，進樣量5微升，紫外檢測器波長為254納米。待測樣 品用兩倍體積的高氯酸(5%)酸化，4'C靜置2小時后，12000轉/分鐘離心15分鐘， 離心上清用0. 45微米的水相濾膜過濾，然后HPLC分析樣品。
權利要求
1.一種酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，步驟如下(1)含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液或粗酶液的制備選取施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)SDM CCTCC No.M206010，常規培養并發酵至NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶活達到200～250單位/升時，終止發酵培養；分離并收集菌體，用生理鹽水洗滌菌體2～4次，再將菌體重懸于pH7.2～7.5、67±3毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液中，并使菌體濃度達到5～60克干細胞/升，得到含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液；或者用超聲波破碎完整細胞得含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的粗酶液；(2)以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活取步驟(1)制得的含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液或粗酶液置于45～65℃水浴中處理5～60分鐘，得到僅含有NAD非依賴性L-乳酸脫氫酶活力的生物催化劑，4℃儲存，備用；(3)對外消旋乳酸拆分將步驟(2)中制得的生物催化劑與DL-乳酸鈉混合，使混合物中DL-乳酸鈉的濃度為100～700毫摩爾/升，生物催化劑濃度為1～15克干細胞/升；然后在25～40℃，pH值6.0～8.0條件下，160～200轉/分鐘振蕩10～20小時，進行生物催化劑對外消旋乳酸的拆分，最終得到含有D-乳酸和丙酮酸的轉化液；(4)轉化液預處理將步驟(3)反應后的轉化液以5,000～10,000轉/分鐘的轉速，離心5～10分鐘，去除沉淀，上清液中含有D-乳酸和丙酮酸；(5)D-乳酸和丙酮酸的分離弱堿性陰離子交換樹脂Amberlite IRA 45裝柱，處理為氯型，將步驟(4)的上清液以0.5～3倍柱體積/小時的流速上樣1～3倍柱體積；去離子水以0.5～3倍柱體積/小時的流速淋洗1～3倍柱體積，收集得到含D-乳酸的洗脫液；然后0.5～2.5摩爾/升鹽酸以0.5～3倍柱體積/小時的流速逆流洗脫1～3倍柱體積，收集得到含丙酮酸的洗脫液；(6)D-乳酸和丙酮酸的精制將步驟(5)中收集得到的含D-乳酸或丙酮酸的洗脫液分別在真空度0.075～0.095兆帕，溫度45～70℃的條件下減壓蒸餾濃縮得到D-乳酸和丙酮酸產品。
2. 如權利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(l) 所述菌體的濃度為35 60克干細胞/升。
3. 如權利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(2) 所述完整細胞懸液或者粗酶液熱處理溫度為50 60°C。
4. 如權利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(2) 所述完整細胞懸液或者粗酶液熱處理時間為5 30分鐘。
5. 如權利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(3) 所述DL-乳酸鈉的濃度為300 600毫摩爾/升。
6. 如權利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(3) 所述生物催化劑濃度為6 12克干細胞/升。
7. 如權利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(3) 所述溫度為30 37°C，所述pH為6.5 7.5，所述振蕩轉速為180轉/分鐘。
8. 如權利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(4) 所述離心轉速為8, 000 10， 000轉/分，離心時間為7 10分鐘。
9. 如權利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，其特征在于，步驟(5)所述上樣流速為1 2倍柱體積/小時，上樣體積為1. 5 2. 5倍柱體積，去離子水淋洗 流速為1 2倍柱體積/小時，去離子水淋洗體積為1. 5 2. 5倍柱體積，鹽酸濃度為l 2摩爾/升，鹽酸逆流洗脫流速為1 2倍柱體積/小時，鹽酸逆流洗脫體積為1. 5 2. 5 倍柱體積。
10.如權利要求1所述酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，其特征在于，步驟 (6)所述真空度為0.08 0.09兆帕，溫度為55 65。C。
全文摘要
本發明公開了一種酶法拆分外消旋乳酸生產D-乳酸的方法，包括(1)含NAD非依賴性乳酸脫氫酶的完整細胞懸液或粗酶液的制備，(2)以熱變性的方法使NAD非依賴性D-乳酸脫氫酶失活，(3)對外消旋乳酸拆分，(4)轉化液預處理，(5)D-乳酸和丙酮酸的分離，(6)D-乳酸和丙酮酸的精制等步驟。本發明具有培養基簡單、生長周期短，成本低，后續分離提取費用低廉，可耐底物濃度高，產物D-乳酸對映體過量值高等特點，為價格低的外消旋乳酸的開發應用和D-乳酸的高效生產奠定了基礎。
文檔編號C12P7/40GK101333554SQ20081013877
公開日2008年12月31日 申請日期2008年8月5日 優先權日2008年8月5日
發明者平 許, 邱建華, 馬翠卿, 超 高 申請人:山東大學