專利名稱：：一種采用聚酰胺分離純化沙棘黃酮的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及中藥有效成分的分離制備方法及其應用，尤其是采用聚酰胺柱層析技術分離純化沙棘黃酮的制備方法及其應用。背景支持沙棘是胡頹子科沙棘屬植物，為蒙、藏習用藥材，具有利肺升陽、健脾消食、活血散瘀等功效，黃酮類化合物則是其主要活性物質之一，主要為異鼠李素、槲皮素、山奈酚的苷及苷元。沙棘黃酮具有降低血脂，軟化血管，降低心肌耗氧量，增強心功能，抗心律失常，抗早博，縮小心肌梗塞面積，緩解心絞痛，增強免疫，改善肝功能，防治呼吸系統疾病，抗輻射等功能，臨床主要用于心絞痛、冠心痛、缺血性心臟病、心肌炎并發心功能不全、高脂血癥和高粘血癥的治療，并有較好的臨床療效。近年來，人們對沙棘進行了很多開發，例如沙棘飲料、沙棘化妝品、沙棘醋、沙棘黃酮口服液等，也有通過膜分離技術、大孔樹脂柱層析等方法從沙棘葉或果實中分離制備沙棘黃酮的工藝報道和專利。但沙棘中所含化學成分復雜，而膜分離技術、大孔樹脂柱層析等方法受其他化學成分干擾明顯，故這些方法得到的沙棘黃酮提取物純度較低。而聚酰胺對富含酚羥基的黃酮類化合物有選擇性吸附作用，特異性強，且具有吸附量大，解吸附徹底等優點，因此利用聚酰胺分離純化黃酮，能獲得大孔樹脂等方法無法達到的產物純度。本發明利用聚酰胺對黃酮的特異性吸附作用，進行沙棘黃酮的純化，制備得到高純度的沙棘黃酮產品，具有明顯的創新性，且有關以沙棘為原料通過聚酰胺柱層析制備高純度沙棘黃酮的方法尚未見有文獻報道。
發明內容本發明的目的之一在于克服現有技術的不足，提供一種從沙棘葉及果實中提取制備高純度沙棘黃酮的方法，即通過聚酰胺柱層析的方式制備沙棘黃酮。此種方法不僅可以獲得高純度的沙棘黃酮，而且工藝簡單、生產成本低，易于工業化生產。本發明的目的之二在于將所制備的沙棘黃酮進一歩制成在臨床上可適用的任何一種具有止咳祛痰、活血散瘀、抗凝血、降血壓、防止血管栓塞以及治療心絞痛、冠心病、缺血性心臟病、心肌炎并發心功能不全、高脂血癥和高粘血癥和炎性疾病作用的藥學上可接受的載體或賦形劑制備的藥物制劑和各種保健品、食品等。本發明通過聚酰胺柱層析分離制備的沙棘黃酮是異鼠李素、槲皮素和山奈酚的混合物，工藝步驟依次為1.沙棘藥材的脫脂及有機溶劑提取以干燥并粉碎的沙棘葉或果實為原料，用5-30倍量的石油醚(60-90°C)進行脫脂，直至脫脂完全。取出脫脂后的原料，晾干后用5-20倍(w/w)的50-95%的甲醇或乙醇提取1-5次，每次l-2小時，合并提取液，過濾后減壓回收溶劑，將提取液濃縮成膏狀。2.提取物的水解和除雜在濃縮的提取液中加入8-20%鹽酸，進行水解。將水解液迅速冷卻后調整pH至中性，乙酸乙酯萃取多次，至萃取液無色。合并萃取液，減壓回收溶劑，得到濃縮物。用水洗滌濃縮物以除去雜質，干燥即可獲得沙棘黃酮粗提物。3.聚酰胺柱層析通常柱層析上樣方式有濕法上樣和干法上樣兩種。水解后的沙棘黃酮為苷元，不溶于水，故只能采用干法上樣。可將粗提物溶于甲醇或乙醇，加入1-5倍量的聚酰胺攪拌均勻后揮干溶劑，進行上樣。而通過多次實驗發現，可直接將粗提物粉末與聚酰胺攪拌均勻進行上樣，從而節省試劑和時間。取上樣粗提物20-60倍量的層析用聚酰胺裝柱，徑高比在1:1—1:20之間，最好為1:8，處理后蒸餾水洗并平衡。將拌好的粗提物加少量水攪拌使成均勻的懸濁液，加到柱床上。用不少于2倍柱體積(BV)的水洗柱，以洗去糖類等極性雜質，再依次用10-100%梯度濃度的極性有機溶劑分別洗脫雜質和沙棘黃酮，流速1,3BV/h，收集洗脫液，回收溶劑進行濃縮后，千燥得到高純度的沙棘黃酮。上述柱層析洗脫過程中所使用的極性有機溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮，優先選擇使用甲醇。洗脫過程中低濃度有機溶劑洗脫液可對溶劑進行回收再利用。柱層析中洗脫液集中收集的部位不同將得到50%—100%范圍內不同純度的沙棘黃酮。本發明所制備出的沙棘黃酮可用于以藥學上可接受的載體或賦形劑制備的所有藥物制劑，用于治療心絞痛、冠心病、缺血性心臟病、心肌炎并發心功能不全、高脂血癥和高粘血癥和炎性疾病以及具有止咳祛痰、活血散瘀、抗凝血、降血壓、防止血管栓塞J力效的藥物，以及相應的保健品、食品等。本發明的優點在于技術合理，操作安全，工藝簡單，經濟可行，可進行工業化制備，采用屮藥現代化技術生產的沙棘黃酮純度高，符合現代中藥產品"高效、速效、長效"，"劑量小、毒性小、副作用小"，"便于貯藏、便于攜帶、便于服用的先進產品"的要求，能適應和滿足現代中醫臨床用藥要求，符合國家倡導的中藥現代化及國際化的產業政策。具體實施方式實施例1本實施例以干燥粉碎的沙棘葉為原料制備沙棘黃酮，工藝步驟依次為1.稱取lkg干燥粉碎的沙棘葉，于提取罐中加入15L石油醚(60-卯'C)進行脫脂。脫脂后晾干藥渣，在提取罐中加入10L75%乙醇提取3次，每次1小時。合并提取液，減壓蒸餾回收溶劑，將提取液濃縮成膏狀。2.膏狀提取物用13%鹽酸在75'C下水解1小時，迅速冷卻水解液。3.調節水解液pH至中性，室溫下乙酸乙酯進行萃取，至萃取液無色。合并萃取液，減壓蒸餾回收乙酸乙酯。4.將回收溶劑后的提取物用水洗滌多次，濾過后將濾渣真空干燥，即為沙棘黃酮粗提物。5.取預處理好的200g60-100目層析用聚酰胺濕法裝柱(6.0X48.0cm)，水洗3倍柱床體積即4000ml平衡。6.稱取制備出的沙棘黃酮粗提物5g，與15g60-100目層析用聚酰胺粉末攪拌均勻，用少量水混懸后上樣于裝好的聚酰胺層析柱上。7.4000ml水洗柱，以洗去糖類等極性雜質。8.依次用30%,50%的甲醇各1200ml,75%甲醇4000ml梯度洗脫雜質。9.用甲醇對沙棘黃酮進行洗脫，棄去前1400ml洗脫液，收集此后的洗脫液約4000ml，回收溶劑，千燥得到高純度的沙棘黃酮。實施例2本實施例以干燥粉碎的沙棘藥材(果實)為原料制備沙棘黃酮，工藝歩驟依次為1.稱取2kg干燥粉碎的沙棘藥材，于提取罐中加入30L石油醚(60-卯°0進行脫脂。脫脂后晾千藥渣，在提取罐中加入20L75%乙醇提取3次，每次1小時。合并提取液，減壓蒸餾回收溶劑，將提取液濃縮成膏狀。2.膏狀提取物用13。/o鹽酸在75'C下水解1小時，迅速冷卻水解液。3.調節水解液pH至屮性，室溫下乙酸乙酯進行萃取，至萃取液無色。合并萃取液，減壓蒸餾回收乙酸乙酯。4.將回收溶劑后的提取物用水洗滌多次，濾過后將濾渣真空干燥，即為沙棘黃酮粗提物。5.取預處理好的160g60-100目層析用聚酰胺濕法裝柱(6.0X40.0cm)，水洗3倍柱床體積即3400ml平衡。6.稱取制備出的沙棘黃酮粗提物4g，與12g60-IOO目層析用聚酰胺粉末攪拌均勻，用少量水混懸后上樣于裝好的聚酰胺層析柱上。7.3400ml水洗柱，以洗去糖類等極性雜質。8.依次用30%,50%的甲醇各1000ml，75%甲醇3400ml梯度洗脫雜質。9.用甲醇對沙棘黃酮進行洗脫，棄去前1200ml洗脫液，收集此后的洗脫液約3400ml,回收溶劑，干燥得到高純度的沙棘黃酮。實施例3本實施例以干燥粉碎的沙棘葉為原料制備沙棘黃酮，工藝步驟依次為1.稱取1.5kg干燥粉碎的沙棘葉，于提取罐中加入23L石油醚(60-90°C)進行脫脂。脫脂后晾干藥渣，在提取罐中加入15L75%乙醇提取3次，每次1小時。合并提取液，減壓蒸餾回收溶劑，將提取液濃縮成膏狀。2.膏狀提取物用13%鹽酸在75〔下水解1小時，迅速冷卻水解液。3.調節水解液pH至中性，室溫下乙酸乙酯進行萃取，至萃取液無色。合并萃収液，減壓蒸餾回收乙酸乙酯。4.將回收溶劑后的提取物用水洗滌多次，濾過后將濾渣真空干燥，即為沙棘黃酮粗提物。5.取預處理好的200g60-100目層析用聚酰胺濕法裝柱(6.0X48.0cm)，水洗3倍柱床體積即4000ml平衡。6.稱取制備出的沙棘黃酮粗提物5g，與15g60-100目層析用聚酰胺粉末攪拌均勻，用少量水混懸后上樣于裝好的聚酰胺層析柱上。7.4000ml水洗柱，以洗去糖類等極性雜質。8.依次用30%，50。/。的乙醇各1200ml，70%乙醇4000ml梯度洗脫雜質。9.用乙醇對沙棘黃酮進行洗脫，棄去前1400ml洗脫液，收集此后的洗脫液約4000ml，回收溶劑，千燥得到高純度的沙棘黃酮。實施例4本實施例以制備的高純度沙棘黃酮為樣品進行降血脂藥效學評價。1.材料Wister大鼠50只；高脂飼料(1%膽固醇，10%豬油，0.2%甲基硫氧嘧啶，0.5%膽酸，5%蔗糖，83.3。/。基礎飼料)；血清總膽固醇(TC)試劑盒；血清甘油三酯(TG)試劑盒；血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒；血脂康(北大維信生物科技有限公司，批號20060526);沙棘黃酮提取物。2.方法取健康大鼠，雌雄各半，平均體重(145.4土10.0g)隨機分為空白對照組、高脂模型組以及沙棘黃酮低劑量組(60mg/kg)、高劑量組(300mg/kg)和陽性對照血脂康組(80mg/kg)，其中空白對照組飼喂基礎飼料，其余四組飼喂高脂飼料。大鼠均灌胃給藥10ml/kg，空白對照組和高脂模型組灌胃給予同體積生理鹽水，每日1次，共4周。取材前禁食12小時，取血，分離血清，分別按試劑盒方法測定血清TC、TG、HDL-C含量。3.降脂藥效學結果沙棘黃酮提取物對大鼠血清總膽固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白膽固醇含量的影響見表1。表1沙棘黃酮對高血脂大鼠藥后4周血脂的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>大鼠飼喂高脂飼料4周后，高脂模型組TC、TG均高于空白對照組，說明高脂模型建模成功。同時發現，沙棘黃酮低劑量組、沙棘黃酮高劑量組均可抑制高血脂大鼠的TC、TG含量(P〈0.05'PO.01),分別使高血脂大鼠血清膽固醇含量顯著減少了19.7%和31.5%,說明沙棘黃酮具有明顯的降低血脂降低膽固醇的效果。權利要求1.一種采用聚酰胺分離純化沙棘黃酮的制備方法及其應用，包括沙棘藥材的脫脂及極性有機溶劑提取步驟，提取物的水解和除雜步驟，粗提物經聚酰胺柱層析分離純化制備黃酮步驟，其特征在于以沙棘提取物經水解和除雜后的粗提物為原料，經少量聚酰胺粉末富集吸附后上樣于聚酰胺層析柱上，先用水洗去極性雜質，再用梯度濃度的極性有機溶劑洗脫沙棘黃酮，洗脫液回收溶劑，濃縮后精制成一定純度的沙棘黃酮。2.根據權利要求1所述的采用聚酰胺分離純化沙棘黃酮的制備方法及其應用，其特征在于1)所述沙棘藥材的脫脂及極性有機溶劑提取方法是以干燥并粉碎的沙棘葉或果實為原料，用5-30倍量的石油醚脫脂完全，然后采用5-20倍(w/w)的50-95%的甲醇或乙醇提取1-5次，每次l-2小時，合并提取液，過濾后減壓回收溶劑，將提取液濃縮成膏狀；2)所述提取物的水解和除雜方法是將濃縮的提取液中加入適量8-20%鹽酸進行水解。將水解液迅速冷卻后調整pH至中性，乙酸乙酯萃取完全，萃取液減壓回收溶劑，濃縮物用水洗滌除去雜質，干燥即可獲得沙棘黃酮粗提物。3)所述粗提物經聚酰胺柱層析分離純化制備黃酮的方法是以沙棘提取物經水解和除雜后的粗提物為原料，與1-5倍量聚酰胺粉末混合拌勻，上樣于20-60倍量層析用聚酰胺裝成的層析柱上，先用不少于2倍柱體積(BV)的水洗去極性雜質，再依次用10-100%梯度濃度的極性有機溶劑分別洗脫雜質和沙棘黃酮，流速i-3BV/h，收集洗脫液，回收溶劑進行濃縮后，得到沙棘黃酮。3.根據權利要求1、2所述的采用聚酰胺分離純化沙棘黃酮的制備方法及其^Z用，其特征在于所述聚酰胺柱層析洗脫用的極性有機溶劑是甲醇、乙醇或丙酮中的一種或幾種混合溶劑，優先選用甲醇。4.根據權利要求1、2所述的采用聚酰胺分離純化沙棘黃酮的制備方法及其應用，其特征在于所述聚酰胺柱層析制備得到的沙棘黃酮為異鼠李素、槲皮素和山奈酚的混合物，該混合物的純度可達50-100%。5.—種如權利要求1、2、3、4所述的采用聚酰胺分離制備的沙棘黃酮，在制備具有止咳祛痰、活血散瘀、抗凝血、降血壓、防止血管栓塞以及治療心絞痛、冠心病、缺血性心臟病、心肌炎并發心功能不全、高脂血癥和高粘血癥和炎性疾病作用藥物或保健品的用途。6.根據權利要求1、2、3、4、5所述的采用聚酰胺分離純化沙棘黃酮的制備方法及其應用，其特征在于制備以藥學上可接受的載體或賦形劑制備的所有藥物制劑或食品、保健品等。全文摘要本發明提供一種采用聚酰胺柱層析分離純化沙棘黃酮的制備方法及其應用。包括沙棘黃酮的提取、聚酰胺分離制備方法及其應用，其特征在于以沙棘葉或果實經提取、水解和除雜后所得的粗提物為原料，經聚酰胺柱層析，水及低濃度極性有機溶劑洗去雜質，并用極性有機溶劑洗脫沙棘黃酮，洗脫液回收溶劑后真空干燥得到純度達50-100％的沙棘黃酮；可用于制成在臨床上可適用的任何一種具有降血壓、防止血管栓塞以及治療心絞痛、冠心病、缺血性心臟病、高脂血癥和高粘血癥等作用的藥學上可接受的載體或賦形劑制備的藥物制劑和各種保健品、食品。本發明技術合理，工藝簡單，經濟可行，能適滿足現代中醫臨床用藥要求，符合國家倡導的中藥現代化及國際化的產業政策。文檔編號A23L1/29GK101327232SQ20081013841公開日2008年12月24日申請日期2008年7月22日優先權日2008年7月22日發明者張岱州,杜曉敏,梁大連,趙興功,陳彤彤,河馬申請人:山東省醫藥工業研究所