專利名稱：：一種對氧化還原循環反應劑敏感的報告菌株及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種通過分子生物學手段，利用代謝工程改造的細菌菌株，具體涉及一種對氧化還原循環反應劑高敏感的大腸桿菌報告菌株、制備方法及其在檢測氧化還原循環反應劑方面的應用。
背景技術：
：近年來，工業迅猛發展，人們生活條件改善，對于環境問題也越來越關注。"環保、生態、綠色、健康"已成為21世紀人們生活的主題概念。氧化還原循環反應劑(redoxcyclingreagents)是一類較嚴重的工農業污染物，該類物質具有酶的特性，使細胞持續性產生超氧陰離子，同時造成細胞內還原當量(NADH/NADPH)大量消耗，所產生的超氧自由基能夠引起機體氧化應激，氧化應激參與很多疾病如神經退行性變、癌癥和衰老等的發生過程，還參與動脈粥樣硬化和心臟病的進展，也和血管生成以及心血管狀態的調節有關。環境中的這種物質增多會惡化生態環境，污染水源食物，嚴重威脅著人們的健康。目前已經發展了一些物理化學方法，利用質譜儀、氣相色譜儀及其它現代化的儀器對氧還循環反應劑進行精確監測，但是，這些物理化學方法需要昂貴的儀器和專門的實驗室，更重要的是，這些技術雖說能夠精確定量污染物，但是不能提供這些污染物的生物有效度、細胞內潛在的修飾/去毒作用以及體內的協同/拮抗效應等生物學關鍵信息。因此，有必要發展一種生物傳感器來對這些有毒物質進行檢測。在過去的十幾年里，利用生物檢測技術來檢測特殊污染物的研究引起了廣泛的關注，生物檢測技術的基本原理即是利用模式生物對特定化學物質的分子反應機理。對于生物檢測技術而言需要三種必需的元件l)針對特定或具有相似性質的化學物質的感應器；2)由感應器控制的啟動子；3)受此啟動子控制的報告基因。在設計生物檢測技術時，由于細菌具有在環境中大量存在、生長快速、低成本及易維護等優點而受到研究人員普遍親睞。使用生長曲線法、終點法、MIC法來檢測菌株對氧化還原循環反應劑的敏感性均有一定的局限性，不能很好地反應細菌對氧化還原循環反應劑的敏感性，細菌培養時間長，多次重復試驗耗時耗力，不利于快速檢測。平板計活菌法檢測細菌對氧化還原循環反應劑的敏感性，則不能連續監測氧化還原循環反應劑作用下的細菌生長狀態，且該方法測定周期較長，主觀誤差大，準確度不高，故也不能很好檢測出細菌對氧化還原循環反應劑的敏感性。所以需要進一步的改建菌株以快速而敏感地檢測出細菌對氧化還原循環反應劑的敏感性。對于氧化還原循環反應劑的生物傳感器的研究主要基于大腸桿菌中SoxR和OxyR兩個轉錄因子的研究。現在已經比較清楚大腸桿菌針對氧化還原循環反應劑反應的分子機理，兩種氧還反應轉錄因子，SoxR和OxyR,主要負責介導細胞對氧化還原循環反應劑的反應。SoxR包含兩個結構域N端的螺旋一轉折一螺旋DNA結合結構域和C端的調節結構域。SoxRC端的四個半胱氨酸殘基(Cys)作為氧還活性簇(2Fe-2S)的配體。純化的SoxR是一同源二聚體，每一單體包含一個氧還活性簇(2Fe-2S)。在普通培養條件下，SoxR(2Fe-2S)簇處于還原狀態，無任何轉錄活性。當在培養基中加入氧化還原循環反應劑時，SoxR立即被氧化，并刺激其唯一目標其因SoxS的表達。其產物SoxS是ara-c相關轉錄激活子，誘導36種基因，包括含有Mn的過氧化物歧化酶，檢酸內切酶IV,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，延胡索酸酶C,烏頭酸酶A和NADPH-鐵氧還蛋白氧化還原酶基因的表達。當大腸桿菌接觸氧化還原循環反應劑時，還原狀態的SoxR(2Fe-2S)續立即被氧化。還原態(2Fe-2S)簇的氧化即顯示出SoxR轉錄活性，刺激目標基因SoxS表達的能力可增高達100。由SoxR對SoxS直接而強有力的誘導控制可以推測SoxR及其目標SoxS啟動子可以用作檢測氧化還原循環反應劑的絕佳的生物檢測系統。SoxR和SoxS墓因頭對頭分布于大腸桿菌染色上(如圖1)，它們的翻譯起始位置相隔僅85bp。SoxS啟動子包含典型-35(TTTACC)和-10(TATACT)元件。SoxS啟動子-35及-10元件間相隔19bp，對由氧化還原循環反應劑生成的過氧化物，SoxR活化后刺激SoxS基因的表達。為了檢測SoxR的活化，將把一報告基因與SoxS啟動子相融合。通常使用的報告基因包括LacZ和LuxABCD基因。大腸桿菌LacZ基因編碼催化-半乳糖苷及其類似物水解的p-半乳糖苷酶。此酶轉換率高且活性強。但是，為了檢測卩-半乳糖苷酶的活性必須在檢測系統中加入酶底物。源于Vibriofisher的LuxABCD基因編碼的細菌熒光素酶催化還原態黃素單核苷酸(FMN)和長鏈醛有氧氧化成氧化態FMN和相應的羧酸，后者在490nm左右有發射光譜。如果使用完整的LuxABCD基因，不需加入外源底物用于生成檢測信號，但是生物發光技術不完全等同于原位檢測。此外，大腸桿菌中表達的細菌性熒光素酶即使在不存在任何氧化還原循環反應劑時，其酶活性也會產生顯著的細胞內氧化應激。本發明所述報告菌株可以克服這些不足，形成比較穩定的基因突變株ExoliWMC-002報告菌株，為生物檢測氧化還原循環反應劑奠定基礎。經檢索本研究構建的基因置換報告菌株在國內外均無文獻報道。
發明內容本發明的目的是通過基因敲除、基因置換技術構建了一種穩定的大腸桿菌報告菌株作為檢測氧化還原循環反應劑的生物傳感器的反應宿主，來快速靈敏檢測氧化還原循環反應劑，以解決生長曲線法、終點法、MIC法檢測氧化還原循環反應劑耗時耗力、主觀誤差大、準確度不高等缺陷。本發明所述大腸桿菌報告菌株，名稱為E.coliWMC-002,已于2008年4月25日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址是北京巿朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，編號CGMCCNo.2464。該大腸桿菌報告菌株和野生型大腸桿菌E.coliMC4100相比，缺失五個基因，分別是sodA(序列如SEQIDNO.1所示)、sodB(序列如SEQIDNO.2所示)、katG(序列如SEQIDN0.3所示)、ahpCF(序列如SEQIDNO.4所示)、frdABCD(序列如SEQIDNO.5所示)，這些基因中sodA、sodB是編碼過氧化物岐化酶的基因、katG、ahpCF編碼過氧化氫酶、frdABCD編碼延胡索酸還原酶，產生內源性過氧化物和過氧化氫，這些基因的刪除可以增加菌株對氧化還原劑檢測的靈敏度和降低檢測的本底值。在此基礎上，通過交叉PCR反應，形成含有報告基因GFPmut2(序列如SEQIDNO.6所示)與待置換目的基因SoxS(序列如SEQIDNO.7所示)兩側DNA片段N和C端相融合的一段1.7kb左右的DNA片段，如圖2所示；克隆到pKOV條件復制質粒，構建pKOV-GFPmut2重組載體，如圖3所示；將該重組載體轉化入敲除了五個基因的E.coliMC4100中，通過溫度及蔗糖的選擇，發生兩次同源重組，最后將基因SoxS置換，得到對氧化還原循環反應劑高敏感的大腸桿菌報告菌株E.coliWMC-002。本發明的E.coliWMC-002報告菌株的構建方法是利用條件復制質粒pKOV作為工具，利用同源重組原理，敲除sodA、sodB、katG、ahpCF、frdABCD五個基因，再通過基因置換技術將基因組上的SoxS編碼基因置換成為GFPmut2報告基因。其置換方法為利用聚合酶鏈反應(PCR)技術將大腸桿菌基因組中待置換目的基因SoxS兩側DNA片段N和C進行擴增，按照經驗，需要較大的DNA片段N和C(每段DNA長度為500bp)才能利用宿主重組酶系統成功進行重組；再對報告基因GFPmut2報告基因進行擴增。對于DNA片段N,引物SoxS-No被設計成含有Notl內切酶位點，引物SoxS-Ni5'端含有與引物GFP-N互補的堿基序列；DNA片段C的引物SoxS-Co被設計成含有Sail內切酶位點，引物SoxS-Ci5'端含有與引物GFP-C互補的堿基序列。從上述PCR反應中合成的DNA產物通過交叉PCR連接形成含有報告基因GFPmut2與待置換目的基因SoxS兩側DNA片段N和C端相融合的一段DNA片段，如圖2所示。GFPmut2基因融合的DNA片段被克隆進pKOV質粒的Notl、Sail內雙酶切位點。克隆的質粒通過轉化導入已敲除5個相關基因的大腸桿菌株E.coliMC4100。經過轉化的大腸桿菌涂布于含氯霉素/LB平板并置42t:孵育。平板上存活的菌落指示重組pKOV質粒已成功整合進入基因組DNA,因為游離質粒不會在非允許溫度下復制增殖。存活的菌落將會立即被置于含5。/。(W/V)蔗糖的平板上置3(TC培養以選擇發生第二次重組事件的大腸桿菌克隆。對蔗糖抵抗且對氯霉素敏感的細菌克隆被挑選用作進一步分析。如果插入及整合事件全發生在目的基因SoxS的同一側的話，將會產生象親代一樣的大腸菌株。另一方面，如果插入與整合發生在目的基因SoxS的不同側的話(如圖6)，就會發生GFPmut2置換SoxS基因。因此，陽性克隆通過針對目的基因SoxS兩側序列的引物的PCR方法加以確證。此基因置換方法實現在不導入基因組中任何抗生素抗性DNA標志的情況下實現精確基因置換。為了克服(3-半乳糖苷酶和生物發光的局限性，選用編碼水母AequoreaVicroria綠色熒光蛋白(GFP)的GFP基因用作報告基因。發光型細菌生物傳感器因為能快速檢測到毒物而受到歡迎。因此，在菌株基因組中引入報告基因來快速靈敏檢測氧化還原循環反應劑是本專利的特色。GFP作為備受青睞的標記分子，在短短幾年時間內就得到了廣泛的應用,其原因在于它具有以下優點(1)易于檢測。GFP熒光反應不需要外加底物和輔助因子，只需紫外光或藍光激發，即可發出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到,且靈敏度高,對于單細胞水平的表達也可識別；(2)熒光穩定。GFP對光漂白有較強的耐受性，能耐受長時間的光照；GFP在pH712范圍內也能正常發光；對高溫(7(TC)、堿性、除港劑、鹽、有機溶劑和大多數都有較強抗性；(3)無毒害。從目前的研究結果來看，GFP對生活的細胞基本無毒害，對目的基因的功能也沒有影響，轉化后細胞仍可連續傳代；(4)通用性。表現在GFP的表達幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達；其次是GFP沒有細胞種類和位置上的限制，在各個部位都可以表達發出熒光；(5)易于構建載體。由于GFP分子量較小，僅為2730kD,編碼GFP的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起構建多種質粒，而不至于使質粒過大影響轉化頻率。(6)可進行活細胞定時定位觀察。對活細胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真實的狀態。穩定的GFP蛋白較之細菌性熒光素酶(~0.1)有更高的量子產量(0.88)。而且，只需大約105106個GFP分子即可檢測出熒光信號。在此，使用一種由GFPmut2基因編碼的GFP蛋白，它比野生型GFP蛋白亮100多倍。從pGFPmut2質粒(購自Clonetech)DNA中獲得含GFPmut2基因的DNA片段，利用交叉PCR技術通過三步PCR進行基因融合，將目的基因SoxS兩端序列與GFPmut2基因融合，利用pKOV質粒特性，進行了基因置換，形成SoxS啟動子直接啟動GFPmut2基因表達的模式。在此構建中，SoxR基因編碼產生的SoxR蛋白結合于SoxS啟動子序列。當存在氧化還原循環反應劑時，在氧化應激狀態下由氧化還原循環反應劑產生的過氧化物活化SoxR并刺激SoxS::GFPmut2融合基因的表達,產生GFPmut2蛋白，如圖4所示。本發明提供一種對氧化還原循環反應劑高敏感的大腸桿菌報告菌株，由野生型大腸桿菌E.coliMC4100缺失sodA、sodB、katG、ahpCF、frdABCD五個基因，再利用基因置換技術，將SoxS編碼基因替換為GFPmut2報告基因，命名為E.coliWMC-002,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCCNo.2464。本發明還提供所述大腸桿菌報告菌株的構建方法，包含以下步驟(1)利用條件復制質粒pKOV作為工具，通過同源重組的方法順序敲除野生型大腸桿菌E.coliMC4100基因組中frdABCD、sodB、ahpCF、katG和sodA五個基因；(2)利用交叉PCR反應構建含有報告基因GFPmut2與待置換目的基因SoxS的兩端同源臂的融合PCR片斷；(3)將步驟2所得片段克隆到pKOV條件復制質粒，構建pKOV-GFPmut2重組載體；(4)所述重組載體pKOV-GFPmut2轉化入步驟(1)中所得菌株基因組中，通過兩次同源重組，將步驟(1)中所得菌株基因組SoxS編碼基因置換成為GFPmut2報告基因。本發明還提供所述大腸桿菌報告菌株在檢測氧化還原循環反應劑方面的應用。本發明所述大腸桿菌報告菌株對于典型氧化還原循環反應劑VitK3(VitaminK3，維生素K3)、PMS(Phe腿inemethosulfate，吩嗪硫酸甲酯)和PQ(Parquat，百草枯)的敏感性明顯高于野生菌E.coliMC4100。同時能夠解決生長曲線法、終點法、MIC法檢測氧化還原循環反應劑耗時耗力、主觀誤差大、準確度不高等缺陷。也可以克服帶有報告載體的報告菌株由于單個細菌中質粒的高拷貝數且數量不均一，在細菌基礎代謝沒有誘導物的情況下報告信號的本底很高，降低了對污染物檢測的敏感性的缺點；質粒的遺傳具有相對的獨立性，引入微生物細胞的質粒，經過幾代的培養，很可能丟失，導致工程菌失效；進入環境的質粒也可能污染其他的菌種，造成潛在的環境風險性；另外利用質粒作為載體的報告系統檢測污染物也存在精確定量相對困難、穩定性差等缺點，而構建的基因突變株E.coliWMC-002報告菌株可以克服這些不足。利用本發明提供的E.coliWMC-002菌株作為檢測氧化還原循環反應劑的生物傳感器的反應宿主菌，其對氧化還原循環反應劑的敏感性明顯增加且生物信號能夠快速客觀地檢測。利用本發明所述菌株作為宿主菌可以在環境污染物一氧化還原循環反應劑的檢測中得到應用。圖1E.coli染色體中soxSandsoxR基因分布圖；圖2利用交叉PCR技術進行基因融合示意圖；圖3重組載體pKOV-GFPmut2的構建流程圖；圖4SoxS::GFPmut2基因融合示意圖5基因替換載體導入宿主于30'C孵育PCR電泳1:DL2000DNAMarker;5:空白對照；2、3、4、6、7:基因替換載體導入宿主于30。C孵育PCR產物；圖6SoxS與GFPmut2基因置換構建報告基因示意圖7基因替換載體與宿主在42。C氯霉素孵育發生同源重組PCR電泳1:DL2000DNAMarker;3:空白對照；7:基因替換載體導入宿主于30。C孵育PCR產物；2、4、5、6、8:基因替換載體與宿主在42。C氯霉素孵育中發生同源重組PCR產物。圖8SoxS與GFPmut2基因發生基因替換PCR電泳鑒定1:DL2000DNAMarker;2:基因替換載體導入宿主于30。C孵育PCR產物；3、4、6、7:SoxS與GFPmut2基因發生基因替換PCR產物；5、8-13:宿主未發生基因替換的PCR產物(陰性對照)；14:空白對照。圖9基因置換報告菌株在熒光顯微鏡下觀察結果圖；左基因置換報告菌株在熒光顯微鏡下觀察結果；右普通大腸桿菌在熒光顯微鏡下觀察結果(陰性對照)；圖IO報告菌株生長曲線圖11不同濃度PQ作用于報告菌株熒光顯微鏡觀察結果(10xioo倍)圖；A:10|iM;B:1jiM;C:0,1jiM;D:Blank圖12不同濃度PMS作用于報告菌株熒光顯微鏡觀察結果(10xl00倍)A:IO一；B:1pM;C:0.1pM;D:Blank圖13不同濃度VitK3作用于報告菌株熒光顯微鏡觀察結果(10xIOO倍)圖。A:lOOjiM;B:IOjiM;C:1|iM;D:Blank具體實施例方式本發明所述對氧化還原循環反應劑高敏感的大腸桿菌的構建具體方法如下實施例1.目的基因的融合(一)、引物信息及合成根據哈佛大學網站提供基因敲除的引物序列和GenBank公布的SoxS及GFPmut2基因序列，設計soxS基因N末端和C末端的內側引物(P2:soxS-Ni和P3:soxS-Ci)和外側引物(Pl:soxS-No和P4:soxS-Co),使P2與P5，P3與P6之間存在互補序列，基因敲除兩個外側引物不變，P5與P6為一對擴增GFPmut2基因引物。具體信息見表-1,引物由大連寶生物公司合成。用無菌去離子水將引物溶解，配成濃度為10^mol/L。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>(二)、交叉PCR進行基因融合利用交叉PCR技術通過三步PCR進行基因融合，將目的基因SoxS兩端序列與GFPmut2基因融合，形成SoxS啟動子直接啟動GFPmut2基因表達的模式。實施例2.擴增兩個同源臂及GFPmut2基因1.兩個同源臂的擴增用接種針挑取LB平板E.coliMC4100—單個菌落少許，混于含15|iL無菌水的200(iLPCR反應管中，沸水煮10min,12000rpm離心35min把凝結在蓋子上的水滴離到管底。取表2中所配體系5pL加入該管中，混勾。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>PCR反應條件如下94°C1min;88°C4min;94°C10sec，66°C3min,25個循環；72°C10min，4。C保存。取5產物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。PCR產物用PCR產物純化試劑盒進行純化，最后加適量的ddH20溶解洗脫備用。2.GFPmut2基因的擴增用接種針挑取含有pGFPmut2質粒(Clonetech)的單個菌落少許，混于含15|iL無菌水的200^LPCR反應管中，沸水煮10min，12000rpm離心3~5min把凝結在蓋子上的水滴離到管底。取表3中所配體系5pL加入該管中，混勻。PCR反應條件如下:94°Clmin;88。C4min;94°C25sec,55°C35sec，72。C40sec,25個循環；72°C10min，4"C保存。取5(iL產物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。PCR產物用PCR產物純化試劑盒進行純化，最后加適量的ddH20溶解洗脫備用。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>3.—側同源臂與GFPmut2基因融合按表4中所配體系反應，PCR反應條件如下94°C1min;88°C4min;94°C25sec，55°C35sec，72°C40sec,25個循環；72°C10min，4。C保存。取5pL產物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。PCR產物用PCR產物純化試劑盒進行純化，最后加適量的ddH20溶解洗脫備用。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>4.兩側同源臂與GFPmut2基因融合按表5中所配體系反應，PCR反應條件如下94°C1min;88°C4min;94°C10sec，66。C3min，25個循環；72°C10min,4。C保存。取5pL產物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。結果顯示，兩側同源臂與GFPmut2基因成功融合。表5ReagentsVolume((oL)dNTPMixture(2.5mM)尸戶6eWDNAPolymerase(5U/pL)na/ar叫(5U/|jL)N端同源臂與GF尸wW2基因融合的PCR反應產物C端同源臂PCR反應產物PI(soxS-No)P4(soxS"Co)10xbuffer(plusMg2+)ddH20_Total_實施例3、PCR產物加A反應在上述PCR反應產物中按每50iaL加入5U的比例加入ExTaq⑧聚合酶，72°C10min。(四)、PCR片斷純化回收加A反應產物用PCR產物純化試劑盒進行純化，最后加適量的ddH2O溶解洗脫備用。實施例4.目的片段與pMD19-Tsimple載體連接按TaKaRa公司的pMD19-TsimpleVector試劑盒說明書進行T載體與目的基因的連接。連接反應體系見表6，連接反應于16t:過夜。20.090.030.50.50,40.4214.520表6ReagentsVolume((jL)pMD19-TsimpleVector1回收產物1ddH20LigationSolutionTotal10實施例5.轉化通過冷CaCl2法將連接產物轉化入大腸桿菌DH-5a感受態細胞中。實施例6.測序挑選一個經外側引物P1、P4PCR鑒定，質粒酶切鑒定證實的單克隆送大連寶生物公司測序，測序結果與NCBI上提供的標準參考序列比對。實施例7.重組克隆pMD19T-GFPmut2的雙酶切和目的片段GFPmut2融合基因的回收1.堿裂解法小量質粒DNA的制備(按《分子克隆》中的方法進行)。2.pMD19T-GFPmut2質粒的雙酶切和目的片段GFPmut2融合基因的回收提取的質粒DNA進行雙酶切，其反應體系見表7，37°C,酶切3h。表7ReagentsVolume(|jL)pMD19T-OF尸賺,210淑I(10U/(xL)15WI(腦VL)110xHBuffer20.1%BSA2ddH204Total20目的片段GFPmut2融合基因的切膠回收酶切反應后產物行0.8%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，在長波紫外燈下切割目的DNA片段，以TaKaRa公司膠回收試劑盒進行回收。最后以Du-800核酸/蛋白分析儀對回收產物定量。實施例8.pKOV載體片段的制備(一)、堿裂解法中量制備pKOV載體因為質粒pKOV是低拷貝的(5~10個/cell),為了得到足夠的量就選用質粒中量提取法(按《分子克隆》中的方法進行)。(二)、pKOV質粒的雙酶切及其回收體系及酶切條件同pMD19T-GFPmut2質粒，回收純化載體片段。實施例9.重組載體pKOV-GFPmut2的構建及保存(一)、目的片斷與載體的連接反應反應體系見表8，連接反應于16i:過夜。表8ReagentsVolume(pL)pKOV載體2OFPmw。片斷T4DNA連接酶210xbuffer2.5ddH2010.5Total20(二)、將連接好的產物轉入DH5a感受態細胞中(三)、陽性克隆的鑒定1.PCR鑒定用接種針挑取LBCM+平板單個菌落少許，混于取含14pL無菌水的200PCR反應管中，沸水煮10min,12000rpm離心3~5min把蓋子上的水蒸氣離到管底。取表9中所配體系加入該管中，混勻。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>PCR反應條件如下94°C1min;88°C4min;94°C10sec,66°C3min，25個循環；72。C10min,4。C保存。取5產物以1.0%的Agarose凝膠電泳鑒定。電泳顯示PCR片斷長度在1.7kb左右的單克隆被挑選出，進行下面的質粒提取和雙酶切鑒定。2.質粒雙酶切鑒定1)上述克隆質粒的中量提取(同上述)2)體系及酶切條件同pMD19T-GFPmut2質粒。酶切反應后產物行0.8%低熔點瓊脂糖凝膠電泳鑒定。酶切片斷在1.7kb左右證實重組載體構建成功，菌種置含甘油15%的LBCM+中，-70°(3保存，備用。實施例10.SoxS與GFPmut2基因的置換(一)、五個基因缺失菌株感受態細胞的制備(1)將-70。C凍存的五個基因缺失菌株接種于約23mL的LB液體培養基中，37°C,200rpm，振蕩培養過夜。(2)將振蕩培養過夜的細菌500(iL加入含有50mLLB液體培養基的三角燒瓶中，振蕩培養3h3.5h。(3)將菌液移入冰預冷的50mL聚丙烯管中，冰上放置10min。(4)4°C,4,000rpm離心10min，棄上清，收集菌體。(5)以10mL冰預冷的0.1MCaCl2重懸沉淀，置于冰上。(6)4°C，4,000rpm離心10min，棄上清。(7)用2mL冰預冷的0.1MCaCl2重懸沉淀，分裝(100i^L/每管)。直接用于轉化或加入15%甘油，放于-7(TC凍存。(二)、重組載體pK0V-GFPmut2轉化入五個基因缺失菌株感受態細胞1、DH5a中pKOV-GFPmut2重組載體的提取(試劑盒法TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0)2、重組載體pKOV-GFPmut2轉化(1)取100jiL感受態細菌，加入上述重組載體，輕輕搖勻，冰洛30min。(2)42°C熱休克90~120s，冰浴3~5min。(3)加800pLLB液體培養基，搖勻，37°C100rpm振蕩培養1h。(4)分別用LB液體培養基稀釋10倍、IOO倍，并各取O.lmL分別涂于LBCM+平板(5)待菌液完全吸收后，倒置培養皿，37'C過夜。(三)、同源重組前的鑒定1.30°CLBCM+平板生長出的單個菌落PCR鑒定用接種針挑取LBCM+平板單個菌落少許，混于含14pL無菌水的200pLPCR反應管中，沸水煮10min，12000rpm離心35min把凝結蓋子上的水滴離到管底。取表10中所配體系加入該管中，混勻。表IOReagentsVolume(^L)dNTPMixture(2.5mM)2MgCl(25mM)1.5&2r函iara《(5U/(xL)0.1Pl(5bxS-No)0.4P4(5bxS-Co)0.42+10xbuffer(plusMg)2Total6,4PCR反應條件如下94°Clmin;88°C4min;94°C10sec，66°C3min,25個循環；72°C10min，4'C保存。取5^L產物以1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2.PCR產物為兩條帶，其亮度有明顯差異，如圖5所示(1200bp左右的較暗，1700bp左右的較亮)取35個克隆稀釋于42'C預熱1mLLB培養基中，按10倍、100倍稀釋，并各取0.1mL分別涂于42。C預熱的LBCM+的平板上。待菌液完全吸收后，倒置培養皿，42°C,24-36h培養。(四)、第一步同源重組(GFPmut2整合到大腸桿菌的基因組中)1.42°CLBCM+平板生長的單個菌落的PCR鑒定(方法同上)、2.PCR產物為兩條帶，其亮度相當，約l200bp和l700bp左右的長度，如圖7，證明已經發生了第一步同源重組，片斷及質粒已經整合到基因組上。選取上述菌落35個稀釋于30'C預熱lmLLB培養基中，倍比稀釋，并各取O.lmL分別涂于3(TC預熱的5。/。蔗糖LB平板上。待菌液完全吸收后，倒置培養皿，3(TC,24-36h培養。(五)、第二步同源重組(質粒與基因組分離并丟失)用接種針挑取3(TC,5。/。蔗糖LB平板上生長的單個菌落，分別接種于LBCM+平板上和5。/。蔗糖LB平板上，3(TC,24-36h培養。(六)、基因置換陽性菌落的PCR篩選3(TCLBCM+平板不生長，LB5。/。蔗糖平板上生長的菌落作PCR鑒定(方法見上述)PCR產物約為1700bp的菌落初步證實為已經發生基因置換的陽性菌落(如圖8)。分純菌落，PCR進一步鑒定證實基因置換成功。(七)、熒光顯微鏡鑒定取PCR鑒定證實基因置換成功的單克隆，37°C1mLLB培養基中培養4-6h，取培養液離心，PBS緩沖液洗滌3次，沉淀留下于熒光顯微鏡下觀察，GFPmut2的激發光波長為488nm,發射光波長為512nm，觀察結果如圖9。實施例ll.報告菌株生長曲線測定為了檢測基因置換報告菌株E.coliWMC-002對氧化還原循環反應劑的敏感性，選擇具有代表性的氧化還原循環反應劑VitK3、PMS和PQ(均購自sigma公司)做氧化還原循環反應劑敏感性實驗，具體實施如下1.種子液制備取LB平板上的單個新鮮菌落，接種于2mlLB液體培養基，200rpm，37。C振蕩過夜，培養至飽和狀態。2.調整起始菌液的OD600值(1)吸取飽和菌液200)!l加入到含有LB液體培養基1,800W的比色皿中吹吸混勻，用空白LB液體培養基調零，測定OD600值，結果乘10即為飽和菌液的OD600值。(2)按照公式V4/OD600，計算出需加入到50mlLB液體培養基中的菌液量，使起始菌液OD600值約為0.02。(3)按照計算好的量吸取種子液加入50mlLB液體培養基中，輕輕搖勻，同時分別吸取菌液2ml加入到比色皿中測定OD600值(作為0hOD600值)。(4)分裝將上述稀釋好的培養液，按照2ml/管加入到無菌試管中。3.標記編號報告菌株、野生型菌株、親本菌株均按照2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h標記；4.培養將上述試管在37。C下振蕩培養。然后分別按對應時間將試管取出，立即放冰箱中貯存，待培養結東時一同測定OD值。5.生長量測定將未接種的LB培養基傾倒入比色杯中，選用600nm波長分光光度計上調節零點，作為空白對照，并對不同時間培養液從Oh起依次進行測定，對濃度大的菌懸液用未接種的LB液體培養基適當稀釋后測定，使其OD值在O.10~0.65以內，經稀釋后測得的OD值要乘以稀釋倍數，才是培養液實際的OD值。實驗中設置平行管，最后OD600值為所測值的平均值，每次實驗至少重復三次。6.結果處理以時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制大腸桿菌的生長曲線。通過測定報告菌株的生長曲線來評價其基因置換后的生長狀態，從生長曲線可以看出報告菌株與基因置換前的親本菌生長狀態沒有明顯差別，生長趨勢基本一致(如圖IO),說明基因置換不影響細菌的正常生長，有利于作為報告菌株對氧化還原循環反應劑的檢測。實施例12.報告菌株WMC-002對氧化還原循環反應劑的敏感性實驗用固定時間點法檢測報告菌株WMC-002對VitK3、PMS和PQ的敏感性。1.種子液的準備從LB平板上的挑取單個新鮮菌落，接種于20mlLB液體培養基，200rpm，37。C振蕩過夜，培養至飽和狀態。2.調整起始菌液的OD600值1)吸取飽和菌液200(xl加入到含有LB液體培養基180(HU的比色杯中吹吸混勻，用空白LB液體培養基調零，測定OD600值，結果乘10即為飽和菌液的OD600值。2)按照公式V=1/OD600，計算出需加入到50mlLB液體培養基中的菌液量，使起始菌液OD600值約為0.02。3.加入誘導劑(分別為VitK3、PMS和PQ)吸取適量種子液加入50mlLB液體培養基中，輕輕搖勻，同時分別吸取菌液2ml加入到比色杯中測定OD600值(作為OhOD600值)，菌液分裝2ml每管加入到試管中，200rpm，37'C振蕩培養2h后，按照不同誘導濃度需求加入適量誘導劑，200rpm，37'C振蕩培養。4.報告菌株培養6小時后，取培養液離心，PBS緩沖液洗滌3次，加lmlPBS重懸沉淀，取5pl菌液制片，制片時加入抗熒光淬滅封片劑，于熒光顯微鏡下觀察。3.實驗結果氧化還原循環反應劑中最為常見的為PQ、PMS、VitK3，本實驗選擇這三種氧化還原循環反應劑的不同濃度作用于報告菌株來評價其敏感性。實驗結果表明(如圖11、12、13):報告菌株對三種氧化還原循環反應劑的敏感性不同，相同的濃度下誘導報告菌株發出的熒光強度不一，PMS的作用下熒光強度最強，VitK3的作用下熒光強度最弱。這也與理論上PMS是強的氧化還原循環反應劑相符合。用這個報告菌株作為生物傳感器的宿主來檢測污染物氧化還原循環反應劑將會克服生長曲線法、終點法、MIC法檢測氧化還原循環反應劑存在耗時費力等缺陷性，為生物傳感器的研發奠定了良好的基礎。以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，并非用于限定本發明的保護范圍。SEQUENCELISTING<110〉溫州醫學院<120>—種對氧化還原循環反應劑敏感的報告菌株及其制備方法<130〉081646-I-CP-NZJ<160>13<170>Patentlnversion3.5<210>1<211〉621<212>DNA<213>sodA<400〉1atgagctataccctgccatccctgccgtatgcttacgatgccctggaaccgcacttcgat60aagcagaccatggaaatccaccacaccaaacaccatcagacctacgtaaacaacgccaac120gcggcgctggaaagcctgccagaatttgccaacctgccggttgaagagctgatcaccaaa180ctggaccagctgccagcagacaagaaaaccgtactgcgcaacaacgctggcggtcacgct240aaccacagcctgttctggaaaggtctgaaaaaaggcaccaccctgcagggtgacctgaaa300gcggctatcgaacgtgacttcggctccgttgataacttcaaagcagaatttgaaaaagcg360gcagcttcccgctttggttccggctgggcatggctggtgctgaaaggcgataaactggcg420gtggtttctactgctaaccaggattctccgctgatgggtgaagctatttctggcgcttcc480ggcttcccgattatgggcctggatgtgtgggaacatgcttactacctgaaattccagaac540cgccgtccggactacattaaagagttctggaacgtggtgaactgggacgaagcagcggca600cgttttgcggcgaaaaaataa621<210>2<211>582<212>DNA<213>sodB<400〉2atgtcattcgaattacctgcactaccatatgctaaagatgctctggcaccgcacatttct60gcggaaaccatcgagtatcactacggcaagcaccatcagacttatgtcactaacctgaac120aacctgattaaaggtaccgcgtttgaaggtaaatcactggaagagattattcgcagctct180gaaggtggcgtattcaacaacgcagctcaggtctggaaccatactttctactggaactgc240ctggcaccgaacgccggtggcgaaccgactggaaaagtcgctgaagctatcgccgcatct300tttggcagctttgccgatttcaaagcgcagtttactgatgcagcgatcaaaaactttggt360tctggctggacctggctggtgaaaaacagcgatggcaaactggctatcgtttcaacctct420aacgcgggtactccgctgaccaccgatgcgactccgctgctgaccgttgatgtctgggaa480cacgcttattacatcgactatcgcaatgcacgtcctggctatctggagcacttctgggcg540ctggtgaactgggaattcgtagcgaaaaatctcgctgcataa582<210>3<211〉582<212>DNA<213>KatG<400>3atgtcattcgaattacctgcactaccatatgctaaagatgctctggcaccgcacatttctgcggaaaccatcgagtatcactacggcaagcaccatcagacttatgtcactaacctgaac120aacctgattaaaggtaccgcgtttgaaggtaaatcactggaagagattattcgcagctct180gaaggtggcgtattcaacaacgcagctcaggtctggaaccatactttctactggaactgc240ctggcaccgaacgccggtggcgaaccgactggaaaagtcgctgaagctatcgccgcatct300tttggcagctttgccgatttcaaagcgcagtttactgatgcagcgatcaaaaactttggt360tctggctggacctggctggtgaaaaacagcgatggcaaactggctatcgtttcaacctct420aacgcgggtactccgctgaccaccgatgcgactccgctgctgaccgttgatgtctgggaa48025cacgcttattacatcgactatcgcaatgcacgtcctggctatctggagcacttctgggcg540ctggtgaactgggaattcgtagcgaaaaatctcgctgcataa582<210〉4<211>2181<212〉DNA<213>ahpCF<400>4atgagcacgtcagacgatatccataacaccacagccactggcaaatgcccgttccatcag60ggcggtcacgaccagagtgcgggggcgggcacaaccactcgcgactggtggccaaatcaa120cttcgtgttgacctgttaaaccaacattctaatcgttctaacccactgggtgaggacttt180gactaccgcaaagaattcagc犯attagattectacggcctg犯aaaagatctga犯gcc240ctgttgacagaatctcaaccgtggtggccagccgactggggcagttacgccggtctgttt300attcgtatggcctggcacggcgcggggacttaccgttcaatcgatggacgcggtggcgcg360ggtcgtggtcagcaacgttttgcaccgctgaactcctggccggataacgtaagcctcgat420aaagcgcgtcgcctgttgtggccaatcaaacagaaatatggtcagaaaatctcctgggcc480gacctgtttatcctcgcgggtaacgtggcgctagaaaactccggcttccgtaccttcggt540tttggtgccggtcgtgaagacgtctgggaaccggatctggatgttaactggggtgatgaa600aaagcctggctgactcaccgtcatccggaagcgctggcgaaagcaccgctgggtgcaacc660gagatgggtctgatttacgttaacccggaaggcccggatcacagcggcgaaccgctttct720gcggcagcagctatccgcgcgaccttcggcaacatgggcatgaacgacgaagaaaccgtg780gcgctgattgcgggtggtcatacgctgggtaaaacccacggtgccggtccgacatcaaat840gtaggtcctgatccagaagctgcaccgattgaagaacaaggtttaggttgggcgagcact900tacggcagcggcgttggcgcagatgccattacctctggtctggaagtagtctggacccag960acgccgacccagtggagcaactatttcttcgagaacctgttcaagtatgagtgggtacag1020acccgcagcccggctggcgcaatccagttcgaagcggtagacgcaccggaaattatcccg1080gatccgtttgatccgtcgaagaaacgtaaaccgacaatgctggtgaccgacctgacgctg1140cgttttgatcctgagttcgagaagatctctcgtcgtttcctcaacgatccgcaggcgttc1200aacgaagcctttgcccgtgcctggttcaaactgacgcacagggatatggggccgaaatct1260cgctacatcgggccggaagtgccgaaagaagatctgatctggcaagatccgctgccgcag1320ccgatctacaacccgaccgagcaggacattatcgatctgaaattcgcgattgcggattct1380ggtctgtctgttagtgagctggtatcggtggcctgggcatctgcttctaccttccgtggt1440ggcgacaaacgcggtggtgccaacggtgcgcgtctggcattaatgccgcagcgcgactgg1500gatgtgaacgccgcagccgttcgtgctctgcctgttctggagaaaatccagaaagagtct1560ggtaaagcctcgctggcggatatcatagtgctggctggtgtggttggtgttgagaaagcc1620gcaagcgccgcaggtttgagcattcatgtaccgtttgcgccgggtcgcgttgatgcgcgt1680caggatcagactgacattgagatgtttgagctgct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