用于有機污染物濃度與降解效能檢測的轉(zhuǎn)化株及其檢測方法

專利名稱：用于有機污染物濃度與降解效能檢測的轉(zhuǎn)化株及其檢測方法
專利說明用于有機污染物濃度與降解效能檢測的轉(zhuǎn)化株及其檢測方法 技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于有機污染物濃度與降解效能檢測的轉(zhuǎn)化株及其檢測方法，特別涉及一種惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)dcblux轉(zhuǎn)化株及其簡易快速、可現(xiàn)地檢測之有機污染物濃度與降解效能檢測的方法。
背景技術：
工業(yè)社會中，生活環(huán)境充斥各種污染物，有些污染物能被人類感覺系統(tǒng)感知，例如含硫化合物、氨以及一些惡臭性的污染物，這些物質(zhì)的存在雖有害于人體之健康，但相對地也很容易被人類感知，而能提早進行防范。然而，有些污染物質(zhì)不易被感知，其存在將會使人類置身于危險的環(huán)境而不自知，故建立快速檢測污染物的方法是保護人類免于環(huán)境危害的有效方法?，F(xiàn)階段的分析方法雖已具相當成效，但設備昂貴，且在操作上必須配合經(jīng)過專業(yè)訓練的技術人員才能達到目的，故在應用上并不方便，如能建立快速的分析方法，將有利于一般民眾快速得知危險之所在。
惡臭假單胞菌對于甲苯、氯化有機物等污染的感應及代謝具有特殊機制，其可分為四個步驟，分別是(1)細胞外環(huán)境的感應由污染物和蛋白質(zhì)TodS結(jié)合；(2)胞內(nèi)胞外訊息的流通蛋白質(zhì)TodS獲得自我磷酸化的能力并對蛋白質(zhì)TodT進行磷酸化，使蛋白質(zhì)TodT具備向核酸分子靠近的能力；(3)基因(tod)表達的控制由蛋白質(zhì)TodT與基因啟動子結(jié)合，啟動基因表達機制；及(4)污染物的降解經(jīng)由轉(zhuǎn)錄和翻譯程序合成酶(toluene dioxygenase)以代謝污染物。經(jīng)此一連串的生化反應已將胞外污染物出現(xiàn)的消息傳回胞內(nèi)，并產(chǎn)生相對應的特定酶來代謝污染物。由于訊息傳導系統(tǒng)具有高效率的調(diào)控功能，使得微生物可以在適當?shù)臅r機表達出代謝污染物的酶，故酶的表達量，將取決于污染物存在量的多寡，唯最終仍受限于菌體代謝系統(tǒng)的協(xié)調(diào)性而達到飽和表達量。此一特性即成為本發(fā)明開發(fā)污染物濃度偵測系統(tǒng)和測定代謝活性的基礎。
美國專利第6117643號中揭示應用甲苯雙加氧酶(toluene dioxygenase)對甲苯所具有的結(jié)合能力，將結(jié)合反應發(fā)生后所啟動的生物冷光反應進一步轉(zhuǎn)化為電流訊號而達到偵測污染物的目的，但對于轉(zhuǎn)化微生物所具備的特性并未說明。
相關文獻中亦有揭示使用惡臭假單胞菌TVA8或B2株作為偵測甲苯或三氯乙烯污染物的菌株(Shingleton JT，et.al.，Biotechnol Bioeng，Quantification of toluene dioxygenase induction and kinetic modeling of TCEcometabolism by Pseudomonas putida TVA8，2001Dec；76(4)341-50；Kelly CJ，et.al.，Kinetic analysis of a tod-lux bacterial reporter for toluene degradationand trichloroethylene cometabolism.Biotechnol Bioeng.2000Aug5；69(3)256-65.)。然而，該二株菌不利于偵測低濃度的污染物。反之，本發(fā)明用于檢測污染物的微生物為轉(zhuǎn)化株，與上述文獻所用的菌株并不相同，彼此間所能測定的污染物能力并不同，且本發(fā)明的轉(zhuǎn)化株可偵測達ppb級的低污染物濃度，更可偵測其它污染物，包括苯、甲苯、二甲苯、乙苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯、二氯乙烯等，可簡易快速用于現(xiàn)地檢測之有機污染物濃度檢測。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明簡述 本發(fā)明的一個目的在于提供一種用于有機污染物濃度與降解效能檢測的轉(zhuǎn)化株，其包含至少一質(zhì)粒，該質(zhì)粒至少包含編碼甲苯雙加氧酶(toluenedioxygenase)的基因的啟動子Ptod(SEQ ID NO1)及發(fā)光光桿狀菌(Photorhabdus luminescens)的lux基因(SEQ ID NO2)。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株，其包含質(zhì)粒ptod_lux，該轉(zhuǎn)化株寄存于財團法人食品工業(yè)發(fā)展研究所(Food IndustryResearch and Development Institute)，微生物寄存號碼為BCRC 940538，并于2008年6月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M208098。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用轉(zhuǎn)化株測定有機污染物濃度的方法，其中該轉(zhuǎn)化株包含至少一質(zhì)粒，該質(zhì)粒至少包含可編碼甲苯雙加氧酶的基因的啟動子Ptod(SEQ ID NO1)及發(fā)光光桿狀菌的lux基因(SEQ IDNO2)，該方法包含 (1)將該轉(zhuǎn)化株與待測有機污染物接觸一適當時間； (2)測定該轉(zhuǎn)化株所產(chǎn)生的冷光值；及 (3)將該冷光值代入以標準濃度的有機污染物與該轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的對應冷光值所建立的關系式中，以決定該待測有機污染物的濃度。
根據(jù)本發(fā)明測定有機污染物濃度的方法，其中該關系式為 L＝Lmax×P/(KC+P)..................1，或 L＝Lmax×P2/(KC2+P2)...............2
其中L為冷光強度，Lmax為最大冷光強度，P為有機污染物濃度，且KC為轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力常數(shù)。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種可感應污染物的質(zhì)粒，其至少包含編碼甲苯雙加氧酶的基因的啟動子Ptod(SEQ ID NO1)及發(fā)光光桿狀菌的lux基因(SEQ ID NO2)。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用轉(zhuǎn)化株評估處理有機污染物的方法，其中該轉(zhuǎn)化株包含至少一質(zhì)粒，該質(zhì)粒至少包含可編碼甲苯雙加氧酶的基因的啟動子Ptod(SEQ ID NO1)及發(fā)光光桿狀菌的lux基因(SEQ IDNO2)，其中該方法包含 (1)將該轉(zhuǎn)化株與待測有機污染物接觸一適當時間； (2)測定該轉(zhuǎn)化株所產(chǎn)生的冷光值；及 (3)將該冷光值與該轉(zhuǎn)化株于最適條件下所產(chǎn)生的冷光值比較，以評估該待測有機污染物是否適于以微生物處理。
發(fā)明詳述 本發(fā)明應用含有Ptod啟動子的質(zhì)粒ptod_Luc，構(gòu)建完成可感應污染物的質(zhì)粒ptod_lux，并以此一質(zhì)粒對宿主細胞進行轉(zhuǎn)化，自所得到的轉(zhuǎn)化株中挑選出對甲苯和三氯乙烯有極高感應能力的菌株，其步驟如下列說明。
(a)ptod_Luc質(zhì)粒構(gòu)建 針對涵蓋甲苯雙加氧酶啟動子Ptod的DNA序列設計引物，將含有啟動子序列長度的PCR產(chǎn)物擴增，再以pCR2.1-TOPO進行連接，可得到質(zhì)粒pCPT1，此質(zhì)粒經(jīng)序列確認后，可做為下一步的質(zhì)粒構(gòu)建工程。由于啟動子5’端含有SacI的限制酶切割點，此一切割點同樣出現(xiàn)在pCR2.1-TOPO的多克隆位點上，故可以SacI切割出含有啟動子Ptod的DNA片段，再選用可以在宿主細胞內(nèi)復制的質(zhì)粒pAL4000，同樣以SacI切開后，再和先前切下來含有啟動子的DNA片段進行連接，得到的新質(zhì)粒，稱為ptod_Luc，此即為含有啟動子Ptod且可用來轉(zhuǎn)化宿主細胞的DNA材料。
(b)ptod_lux質(zhì)粒構(gòu)建 使用ptod_Luc質(zhì)粒在測定活性時，必須打破菌體，并添加基質(zhì)，操作上并不方便。反之，利用細菌螢光素酶(bacterial luciferase)，就可以直接采用活菌測定啟動子的活性。因此，以下述方式構(gòu)建質(zhì)粒將質(zhì)粒pSB1075以BamHI切開后，分離出luxCDABE的DNA片段，以牛小腸堿性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase；CIP)去除DNA尾端的磷酸根后，和BamHI/BglII切開的ptod_Luc質(zhì)粒的DNA片段(不含luc基因)進行連接，所完成的質(zhì)粒即為ptod_lux。
(c)利用三親本交配系統(tǒng)(triparental mating system)的轉(zhuǎn)化 本發(fā)明利用具備轉(zhuǎn)化能力的質(zhì)粒(ptod_lux)的大腸桿菌(E.coli DH5a)、準備接受轉(zhuǎn)化的菌株、及含有質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌三個菌株進行接合，其中含有質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌可透過其菌體內(nèi)所含有的質(zhì)粒的功能將含有啟動子的質(zhì)粒ptod_lux轉(zhuǎn)移至宿主細胞。
在本發(fā)明中，只要能轉(zhuǎn)化含啟動子Ptod及發(fā)光光桿狀菌的lux基因的質(zhì)粒皆可作為本發(fā)明的宿主細胞，并無特別限制。在一具體實施方案中，該宿主細胞為假單胞菌屬的微生物，更明確而言，該宿主細胞為惡臭假單胞菌。
在本發(fā)明中，應用發(fā)光光桿狀菌的lux基因為報導基因，該lux基因本身可形成獨立的生化反應系統(tǒng)，在菌體內(nèi)快速地合成發(fā)光反應所需的所有物質(zhì)。此一發(fā)光體系包括了發(fā)光物質(zhì)的生產(chǎn)和發(fā)光反應兩個步驟，總計需要五個基因來完成此一工作，分別是基因C、D、A、B和E，其中基因AB形成可產(chǎn)生冷光的熒光素酶(bacterial luciferase)，將發(fā)光基質(zhì)肉豆蔻醛(myristaldehyde)氧化成肉豆蔻酸(myristic acid)，同時產(chǎn)生波長為490nm的冷光。而基因C、D和E組合成肉豆蔻酸還原酶(fatty acid reductase)，將肉豆蔻酸于菌體內(nèi)直接還原成肉豆蔻醛，而可持續(xù)發(fā)出冷光，直到酶活性消失為止。
在本發(fā)明一具體實施方案中，該轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的冷光值，就部分有機化合物而言，可用Michaelis Menten的酶動力學方程式V＝Vmax×S/(Km+S)為基礎描述，其中V和Vmax分別為酶的反應速率和最大反應速率，而在本發(fā)明中則可代表轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的冷光強度(L)和最大冷光強度(Lmax)；S為基質(zhì)濃度，本發(fā)明中則可代表污染物的濃度(P)；Km近似于酶和基質(zhì)的解離能力，本發(fā)明中則近似于轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力(KC)；故可將該方程式改寫成 L＝Lmax×P/(KC+P)..................1
其中L為冷光強度，Lmax為最大冷光強度，P為有機污染物濃度，且KC為轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力常數(shù)。
然而，對于另一部分有機物而言，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的冷光值若直接采用上述關系式1較無法合理描述冷光強度和污染濃度的關系，但卻可以稍加修正關系式1后，得到良好的新關系式，其修正后的關系式為 L＝Lmax×P2/(KC2+P2)..............2
其中L為冷光強度，Lmax為最大冷光強度，P為有機污染物濃度，且KC為轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力常數(shù)。
在本發(fā)明中，對于可誘導該轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生冷光的有機污染物包含苯類及氯化有機物。具體而言，該有機污染物為苯、甲苯、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯和順式二氯乙烯等。更具體而言，為甲苯及三氯乙烯。其中可誘導該轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生冷光而符合關系式1的有機污染物為苯、甲苯及間二甲苯，而符合關系式2的有機污染物為乙苯、對二甲苯、鄰二甲苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯和順式二氯乙烯。
依據(jù)上述內(nèi)容，本發(fā)明構(gòu)建完成可感應污染物的質(zhì)粒ptod_lux，并以此一質(zhì)粒對惡臭假單胞菌進行轉(zhuǎn)化，自所得到的轉(zhuǎn)化株中挑選出對甲苯和三氯乙烯有極高感應能力的惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株，其符合上述關系式1或2，該轉(zhuǎn)化株寄存于財團法人食品工業(yè)發(fā)展研究所(Food IndustryResearch and Development Institute)，且微生物寄存號碼為BCRC 940538，并于2008年6月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCM 208098。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用轉(zhuǎn)化株測定有機污染物濃度的方法，其中該轉(zhuǎn)化株包含至少一質(zhì)粒，該質(zhì)粒至少包含可編碼甲苯雙加氧酶的基因的啟動子Ptod(SEQ ID NO1)及發(fā)光光桿狀菌的lux基因(SEQ IDNO2)，該方法包含 (1)將該轉(zhuǎn)化株與待測有機污染物接觸一適當時間； (2)測定該轉(zhuǎn)化株所產(chǎn)生的冷光值；及 (3)將該冷光值代入以標準濃度的有機污染物與該轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的對應冷光值所建立的關系式中，以決定該待測有機污染物之濃度。
在本發(fā)明之一具體實例中，該關系式為 L＝Lmax×P/(KC+P)...............1
其中L為冷光強度，Lmax為最大冷光強度，P為有機污染物濃度，且KC為轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力常數(shù)。
在本發(fā)明的另一具體實例中，該關系式為 L＝Lmax×P2/(KC2+P2)............2
其中L為冷光強度，Lmax為最大冷光強度，P為有機污染物濃度，且KC為轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力常數(shù)。
在本發(fā)明的一具體方案中，該有機污染物為苯、甲苯、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯和順式二氯乙烯等。
在本發(fā)明中，可利用褐藻酸鈉與氯化鈣所形成的凝膠，將轉(zhuǎn)化株菌體包埋成固定化菌球體，其中每一顆固定化菌球體包含的菌體數(shù)可依所需而變化。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用轉(zhuǎn)化株評估處理有機污染物的方法，其中該轉(zhuǎn)化株包含至少一質(zhì)粒，該質(zhì)粒至少包含可編碼甲苯雙加氧酶的基因的啟動子Ptod(SEQ ID NO1)及發(fā)光光桿狀菌的lux基因(SEQ IDNO2)，其中該方法包含 (1)將該轉(zhuǎn)化株與待測有機污染物接觸一適當時間； (2)測定該轉(zhuǎn)化株所產(chǎn)生的冷光值；及 (3)將該冷光值與該轉(zhuǎn)化株于最適條件下所產(chǎn)生的冷光值比較，以評估該待測有機污染物是否適于以微生物處理。
本文中所述的基因表達最適化條件或最適條件系指經(jīng)由一般微生物學方法檢討操作條件，可獲該微生物或轉(zhuǎn)化株適用本發(fā)明檢測系統(tǒng)的最適當生長條件，該條件可包含反應溫度、pH值、鹽類、誘導時間或其它微生物生長條件。
在本發(fā)明的利用轉(zhuǎn)化株評估處理有機污染物的方法中，該有機污染物包含苯類及氯化有機物。具體而言，該有機污染物為苯、甲苯、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯和順式二氯乙烯等。更具體而言，為甲苯及三氯乙烯。
在本發(fā)明的利用轉(zhuǎn)化株評估處理有機污染物的方法中，該轉(zhuǎn)化株為惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株，其包含質(zhì)粒ptod_lux，該轉(zhuǎn)化株寄存于財團法人食品工業(yè)發(fā)展研究所，微生物寄存號碼為BCRC 940538，并于2008年6月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 208098。。
下列實施例僅為示范性且不應視為本發(fā)明之限制，上述教導可應用在其它等效類型。說明書內(nèi)容旨在更詳盡說明本發(fā)明，并不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。
附圖簡述


圖1顯示質(zhì)粒pCPT1之構(gòu)建流程圖。
圖2顯示質(zhì)粒ptod_Luc之構(gòu)建流程圖。
圖3顯示質(zhì)粒ptod_lux之構(gòu)建流程圖。
圖4顯示本發(fā)明質(zhì)粒ptod_lux的限制酶圖譜，其中Ptod為可編碼甲苯雙加氧酶的基因的啟動子；Lux為luxCDABE的DNA片段；t為轉(zhuǎn)錄終止子；RSF1010的DNA序列中包含DNA的復制起點；TetR為四環(huán)素抗藥性相關基因；限制酶的簡寫代號分別是B為BamHI、E為EcoRI、K為KpnI以及S為SacI。
具體實施方式
實施例1質(zhì)粒構(gòu)建 (a)ptod_Luc質(zhì)粒構(gòu)建 針對涵蓋甲苯雙加氧酶啟動子Ptod的DNA序列(SEQ ID NO1)設計引物(正向引物gtttcgcgcaggcgcgcgag；反向引物cactcaaaggcagtgcgagc)，將含有啟動子序列的PCR產(chǎn)物擴增，再以pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)進行連接，可得到質(zhì)粒pCPT1，其流程如圖1所示。此質(zhì)粒經(jīng)序列確認后，可做為下一步的質(zhì)粒構(gòu)建工程。
由于啟動子5’端含有SacI的限制酶切割點，此一切割點同樣出現(xiàn)在pCR2.1-TOPO的多克隆位點上，故可以SacI切割出含有Ptod啟動子的DNA片段，選用可以在惡臭假單胞菌菌體內(nèi)復制的質(zhì)粒pAL4000(購自財團法人食品工業(yè)發(fā)展研究所，質(zhì)粒代號為BCRC No.41765)，同樣以SacI切開后，再和先前切下來含有啟動子的DNA片段進行連接，得到的新質(zhì)粒，稱為ptod_Luc，此即為含有Ptod啟動子且可用來轉(zhuǎn)化惡臭假單胞菌的DNA材料，其流程如圖2所示。
(b)ptod_lux質(zhì)粒構(gòu)建 將質(zhì)粒pSB1075(獲自長庚大學)以BamHI切開后，分離出luxCDABE的DNA片段(SEQ ID NO2)，以CIP去除DNA尾端的磷酸根后，和BamHI/BglII切開的ptod_Luc質(zhì)粒的DNA片段(不含luc基因)進行連接，所完成的質(zhì)粒即為ptod_lux，其流程如圖3所示，且其限制酶圖譜如圖4所示。
實施例2轉(zhuǎn)化惡臭假單胞菌菌株 取準備進行接合的三個菌株，分別是含有具備轉(zhuǎn)化能力的質(zhì)粒ptod_lux的大腸桿菌(DH5a)、準備接受轉(zhuǎn)化的惡臭假單胞菌(購自食品工業(yè)發(fā)展研究所，菌種代號為BCRC No.17059)，另外再準備含有質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌，其中含有質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌可透過其菌體內(nèi)所含有的質(zhì)粒的功能將含有啟動子的質(zhì)粒ptod_lux轉(zhuǎn)移至惡臭假單胞菌。在菌體培養(yǎng)過程中，以含有15μg/ml四環(huán)素(tetracycline)的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)含啟動子的質(zhì)粒ptod_lux的大腸桿菌，以含有50μg/ml卡那霉素(kanammycin)的LB培養(yǎng)液培養(yǎng)含質(zhì)粒pRK2013的大腸桿菌，以營養(yǎng)培養(yǎng)液(nutrient broth)培養(yǎng)惡臭假單胞菌。
當進行轉(zhuǎn)化時，于1ml的LB培養(yǎng)液中先加入50μl的惡臭假單胞菌菌液，再將另外兩株菌株各50μl的菌液依序加入，混合后，將此混合菌液以微量吸管吸到無菌濾膜上，濾膜下方置放無菌吸水紙，以吸取菌液中的培養(yǎng)液，待濾膜上的培養(yǎng)液已吸干后，以無菌夾子夾取濾膜，貼附于LB平板培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)，24小時后以生理食鹽水將濾膜上的菌體洗下，并將菌液序列稀釋后，涂抹于含有50μg/ml四環(huán)素的LB平板培養(yǎng)基上，待形成菌落后，挑選出單一菌落，分別以啟動子和惡臭假單胞菌特異引物進行PCR分析，挑出兩對引物皆可擴增出PCR訊號的菌株，其中被苯或三氯乙烯誘導可得到最大冷光誘導值者，即為惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株。
實施例3建立污染物濃度與冷光值之關系式 (a)基因表達最適化條件 經(jīng)由一般微生物學方法檢討操作條件，可獲得本發(fā)明檢測系統(tǒng)的最適當操作條件 反應溫度約20～30℃ pH約7 誘導時間約2小時 培養(yǎng)基基礎培養(yǎng)基(minimal medium)，其成分為Na2HPO4 4.9g/L、KH2PO4 2.0g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、MgCl2·6H2O 0.34g/L、CaCl2·2H2O 1.7mg/L、FeSO·4.7H2O 2.4mg/L、ZnSO·4.7H2O 0.3mg/L、CoCl2·6H2O 2.4mg/L、MnSO4·7H2O 2.4mg/L、CuSO4·5H2O 0.2mg/L、Na2MoO4·5H2O 0.25mg/L、酵母萃取物0.5mg/L。
(b)濃度標準曲線的建立 當基因表達量的分析條件符合上述條件時，所測得的基因表達量可反應微生物降解污染物的最大能力，而此最適化條件亦為污染物濃度測定過程所采用。
微生物降解污染物的最大能力測定系于上述條件下測定。于20毫升密閉玻璃瓶中配制不同污染物10ppm或100ppm儲備溶液，于室溫下震蕩混勻后備用。將菌體濃度為1O.D.(OD600)的轉(zhuǎn)化株菌液10ml，分裝至密閉玻璃反應瓶中，再將包括苯、甲苯、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯和順式二氯乙烯等污染物儲備溶液進行序列稀釋后，添加至該反應瓶中，由不同濃度的污染物與惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株的反應，可得到一相對冷光值(RLU)，并配合以下關系式1或2，評估冷光值和濃度之間的關系，以建立測量濃度的標準曲線 L＝Lmax×P/(KC+P)............1
L＝Lmax×P2/(KC2+P2).........2
其中L為冷光強度，Lmax為最大冷光強度，P為有機污染物濃度，且KC為轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力常數(shù)。
下表1及表2所示為以三氯乙烯與甲苯為代表性的濃度分析結(jié)果，其中實際誘導倍率為惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株在各濃度下所產(chǎn)生的冷光值除以在沒有污染物存在下的冷光背景值。
表1、以惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株進行三氯乙烯的濃度分析 表2、以惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株進行甲苯的濃度分析 依上所述，由惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株與苯類及氯化有機物所得的反應結(jié)果，可利用上述關系式1或2獲得轉(zhuǎn)化株對于污染物的親和力常數(shù)KC及可產(chǎn)生的最大冷光強度Lmax，其列于下表3。
表3、KC及Lmax的分析結(jié)果 實施例4濃度與冷光強度關系式的評估 (a)線性回歸分析 運用回歸分析方式，檢驗實驗數(shù)據(jù)與關系式1或2間的相關程度，即由關系式1或2的等號兩邊取倒數(shù)時，可以繪出直線關系圖，故可將所獲得的冷光強度與有機污染物濃度數(shù)據(jù)代入關系式后，采倒數(shù)處理，以決定系數(shù)R2值(coefficient of determination)檢驗，并評估各污染物與關系式1或2所符合的程度，其分析結(jié)果如下表4所示。
表4、線性回歸分析的R2之計算結(jié)果 由上表可知，大部分的R2值都可達到0.95以上，其中有些數(shù)據(jù)更可達0.99以上，顯示本發(fā)明的惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株可利用關系式1或2估算有機物的濃度。
(b)濃度適用范圍 由于本發(fā)明惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株分析污染物時遵循關系式1或2，因此亦可由KC值估算污染物的濃度適用范圍，濃度上限以KC×5，下限以KC/5為依據(jù)，該范圍顯示于下表5。
表5本發(fā)明檢測系統(tǒng)的濃度適用范圍 由表5可知，本發(fā)明的檢測能力大部分能符合第二類地下水的管制標準，對于苯類化合物更可符合第一類地下水的管制標準，此可顯示本發(fā)明具有良好的應用性。
實施例5污染物濃度分析 將本發(fā)明惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株用于測定采集自含有苯和甲苯兩種污染物的污染區(qū)的樣本，并同時應用氣相層析儀進行分析作為對照組。
(a)以氣相層析(GC)分析污染物濃度 苯和甲苯的分析樣品皆以氣相色層分析儀(HP 6890)內(nèi)附毛細管柱(SPB-624，60m×0.32mm)搭配火焰離子化偵測器(FID)進行分析，分析條件如下 入口溫度220℃，壓力20psi，氣體流速36.5ml/min。
管柱條件恒壓，N2流速3.1ml/min，壓力20psi。
升溫條件共分成下列四個階段 (1)35℃維持4分鐘； (2)每分鐘上升10℃至110℃并維持1分鐘； (3)每分鐘上升25℃至150℃后維持5分鐘；及 (4)每分鐘上升25℃至210℃后維持5分鐘。
偵測器溫度250℃，H2流量40ml/min，空氣流量45ml/min，尾吹流速(make-up flow)(N2)45ml/min。
(b)以轉(zhuǎn)化株分析污染物 將隔夜培養(yǎng)活化后的本發(fā)明惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株以基礎培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度達1個吸光單位(O.D.)后，取出10ml濃度感應菌株置于20毫升密閉玻璃瓶中，此后開始添加不同濃度的苯和甲苯做為濃度分析用的標準品以制備濃度反應曲線。分析環(huán)境樣本時，則將環(huán)境樣本以不同的稀釋度稀釋后添加到含有10ml濃度感應菌株的密閉瓶中，于30℃以150rpm振蕩培養(yǎng)，兩小時后取出300μl的濃度感應菌體放入冷光分析儀(Lumat LB9507，或Junior LB 9509)中進行冷光強度的分析，并由事先制備好的濃度反應曲線計算出污染物的濃度值。
本分析法所得到的數(shù)據(jù)系將苯和甲苯的混合物應用各污染物的標準曲線換算成苯當量濃度或甲苯當量濃度，其數(shù)據(jù)的含意是污染物的總量，而不是個別污染物的含量。因本發(fā)明所能測定的污染物都屬于管制物質(zhì)，故能測定出污染總量具有極高的應用價值。本實施例所測定的污染物種類有二，故可分別表達成苯的當量濃度和甲苯的當量濃度。
采集到的17個污染樣本經(jīng)由冷光分析后，所得到的污染物當量濃度以及氣相層析儀的分析結(jié)果分別表示于表6。為了解本發(fā)明對環(huán)境樣本的污染濃度的測定能力，將氣相層析儀所測得的各污染物濃度分別計算出相對應的理論冷光強度，以便與實際冷光測定值進行比較，用以了解本發(fā)明的檢測能力之可信度。
以樣本1為例說明下表6的計算方式樣本1的苯和甲苯以氣相層析分析后的濃度分別為113和20.9ppm，遠高于本發(fā)明的濃度適用范圍1.57～39.3μg/L及0.53～13.35μg/L，故進行10000倍稀釋，分別為11.31和2.09ppb。測量的實測冷光值為3108621RLU，此數(shù)據(jù)可換算成苯和甲苯的當量濃度分別為64.1及46.9ppm。將樣本中甲苯的氣相層析所測得濃度(2.09ppb)由甲苯的濃度曲線換算出理論冷光值，并將此一冷光值應用苯的濃度曲線再換算成苯的當量濃度(2.96ppb)，此一甲苯轉(zhuǎn)換得到的苯當量濃度再和苯的氣相層析分析數(shù)據(jù)相加(11.31+2.96＝14.27ppb)，即為理論上苯的總當量濃度。將此一濃度數(shù)據(jù)由苯的濃度曲線換算，可得到理論冷光值3248577，并和實際冷光值進行比較(3108621/3248577)，以確定此二數(shù)據(jù)的差距(95.7％)。其它樣本依上述方法計算，顯示于下表6。
表6、污染樣本的冷光分析與氣相層析分析結(jié)果

由表6可知大部分的數(shù)據(jù)和理論數(shù)據(jù)極為接近，其平均值與標準差為101.96±14.77％。一般而言，以氣相層析儀分析已知濃度的標準品時，其誤差范圍為±5～10％。生物檢測系統(tǒng)的精確性本已不及精密的化學分析系統(tǒng)，且水中成分復雜，樣本間會有很大的變異，當檢測的樣品間的化學組成不一致時，對生物檢測系統(tǒng)的影響會更大。就檢測方法而言，本發(fā)明可方便快速檢測，并于現(xiàn)地使用，無須氣相層析所需之昂貴裝置及繁復操作技術。因此，此一結(jié)果可顯示本發(fā)明已具有極好的應用效果。
實施例6評估降解條件偏離度的方法 依實例3相似的方法，測定本發(fā)明評估環(huán)境因子影響微生物效能的方法，其中以pH值、溫度及鹽份作為環(huán)境變動因子。對于評估未知成份的水樣本時，則在測定用的基礎培養(yǎng)基中添加10％的待測水樣后，依相同方法分析冷光值，并依公式計算出Lmax。
效能偏離度的計算方法為待測條件所測得的Lmax和標準條件下所測得的數(shù)值(如實例3中的表3所列Lmax)之比值(基因表達百分比)。比值為100％時，代表未偏離，利于生物處理作用；比值越低代表其偏離最適當?shù)慕到鈼l件越遠，不利于生物處理作用。表7所列數(shù)據(jù)為應用本發(fā)明評估鹽份、溫度，酸堿度對降解效能的影響情形。
表7、環(huán)境因子對基因表達量的影響
注鹽份所列的百分比為外加到基礎培養(yǎng)基的外加濃度。
由上表可知，溫度20℃、pH7、低鹽度為最適當?shù)慕到鈼l件，當條件發(fā)生偏離時，其基因表達量也產(chǎn)生不同程度的下降現(xiàn)象。
實施例7現(xiàn)地采樣的最適降解條件偏離度分析 應用實施例6之方法同樣可用于評估含特定化學成分的水質(zhì)對降解效能的偏移度。由臺灣高雄地區(qū)任取六口地下水樣并添加不同濃度的甲苯進行Lmax的計算，并將所得數(shù)值與標準條件下的Lmax進行比較，其值分別為86.1％、79.2％、57.7％、86.9％、94.5％、92.5％，由此結(jié)果進一步可評估是否使用微生物降解方式處理該污染物。
產(chǎn)業(yè)可利用性 本發(fā)明應用生物訊息調(diào)控基因表達的機制，開發(fā)可用來檢測污染物濃度與降解效能的轉(zhuǎn)化株及其檢測方法，投入的費用可大幅降低，并可簡易快速、可現(xiàn)地檢測有機污染物濃度與降解效能。
序列表
<110>財團法人生物技術開發(fā)中心
<120>用于有機污染物濃度與降解效能檢測的轉(zhuǎn)化株及其檢測方法
<160>2
<210>1
<211>452
<212>DNA
<213>惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)
<400>1
gagctcaggt gcaggcgccg cgtggctccc gtgacagaac gctcctcgat caacgcattg 60
agcgccacca gcatgttcag gtctgaggtt ttcatcgaca tcaggttatc aacctgctcg120
tggacctgag ggaaactgcc gtggcggcga cggggcttgc gcgtaagccc ccgctatacg180
accagcctgt tcgaaagccg caaagtgctt aggtttgggt gcatatccat cagaagcggc240
ataaaccatc gtttatcaca gttaaacttt ggttttctaa gttgcgatag ccatataaac300
ccataagcca aaaaacaata tttcccaggg cgtgattgta atactgtgcg tgctctaagg360
cggtgtttgc ctacttcact ttataaaaaa aataagatgt ggaaggattg taattatgaa420
gattgccagc gtgctcgcac tgcctttgag tg 452
<210>2
<211>5799
<212>DNA
<213>發(fā)光光桿狀菌(Photorhabdus luminescens)
<400>2
atgactaaaa aaatttcatt cattattaac ggccaggttg aaatctttcc cgaaggtgat 60
gatttagtgc aatccattaa ttttggtgat aatagtgttt acctgccaat attgaatgac120
tctcatgtaa aaaacattat tgattgtaat ggaaataacg aattacggtt gcataacatt180
gtcaattttc tctatacggt agggcaaaga tggaaaaatg aagaatactc aagacgcagg240
acatacattc gtgacttaaa aaaatatatg ggatattcag aagaaatggc taagctagag300
gccaattgga tatctatgat tttatgttct aaaggcggcc tttatgatgt tgtagaaaat360
gaacttggtt ctcgccatat catggatgaa tggctacctc aggatgaaag ttatgttcgg420
gcttttccga aaggtaaatc tgtacatctg ttggcaggta atgttccatt atctgggatc480
atgtctatat tacgcgcaat tttaactaag aatcagtgta ttataaaaac atcgtcaacc540
gatcctttta ccgctaatgc attagcgtta agttttattg atgtagaccc taatcatccg600
ataacgcgct ctttatctgt tatatattgg ccccaccaag gtgatacatc actcgcaaaa660
gaaattatgc aacatgcgga tgttattgtc gcttggggag ggccagatgc gattaattgg720
gcggtagagc atgcgccatc ttatgctgat gtgattaaat ttggttctaa aaagagtctt780
tgcattatcg ataatcctgt tgatttgacg tccgcagcga caggtgcggc tcatgatgtt840
tgtttttacg atcagcgagc ttgtttttct gcccaaaaca tatattacat gggaaatcat900
tatgaggaat ttaagttagc gttgatagaa aaacttaatc tatatgcgca tatattaccg 960
aatgccaaaa aagattttga tgaaaaggcg gcctattctt tagttcaaaa agaaagcttg1020
tttgctggat taaaagtaga ggtggatatt catcaacgtt ggatgattat tgagtcaaat1080
gcaggtgtgg aatttaatca accacttggc agatgtgtgt accttcatca cgtcgataat1140
attgagcaaa tattgcctta tgttcaaaaa aataagacgc aaaccatatc tatttttcct1200
tgggagtcat catttaaata tcgagatgcg ttagcattaa aaggtgcgga aaggattgta1260
gaagcaggaa tgaataacat atttcgagtt ggtggatctc atgacggaat gagaccgttg1320
caacgattag tgacatatat ttctcatgaa aggccatcta actatacggc taaggatgtt1380
gcggttgaaa tagaacagac tcgattcctg gaagaagata agttccttgt atttgtccca1440
taataggtaa aaagtatgga aaatgaatca aaatataaaa ccatcgacca cgttatttgt1500
gttgaaggaa ataaaaaaat tcatgtttgg gaaacgctgc cagaagaaaa cagcccaaag1560
agaaagaatg ccattattat tgcgtctggt tttgcccgca ggatggatca ttttgctggt1620
ctggcggaat atttatcgcg gaatggattt catgtgatcc gctatgattc gcttcaccac1680
gttggattga gttcagggac aattgatgaa tttacaatgt ctataggaaa gcagagcttg1740
ttagcagtgg ttgattggtt aactacacga aaaataaata acttcggtat gttggcttca1800
agcttatctg cgcggatagc ttatgcaagc ctatctgaaa tcaatgcttc gtttttaatc1860
accgcagtcg gtgttgttaa cttaagatat tctcttgaaa gagctttagg gtttgattat1920
ctcagtctac ccattaatga attgccgaat aatctagatt ttgaaggcca taaattgggt1980
gctgaagtct ttgcgagaga ttgtcttgat tttggttggg aagatttagc ttctacaatt2040
aataacatga tgtatcttga tataccgttt attgctttta ctgcaaataa cgataattgg2100
gtcaagcaag atgaagttat cacattgtta tcaaatattc gtagtaatcg atgcaagata2160
tattctttgt taggaagttc gcatgacttg agtgaaaatt tagtggtcct gcgcaatttt2220
tatcaatcgg ttacgaaagc cgctatcgcg atggataatg atcatctgga tattgatgtt2280
gatattactg aaccgtcatt tgaacattta actattgcga cagtcaatga acgccgaatg2340
agaattgaga ttgaaaatca agcaatttct ctgtcttaaa atctattgag atattctatc2400
actcaaatag caatataagg actctctatg aaatttggaa actttttgct tacataccaa2460
cctccccaat tttctcaaac agaggtaatg aaacgtttgg ttaaattagg tcgcatctct2520
gaggagtgtg gttttgatac cgtatggtta ctggagcatc atttcacgga gtttggtttg2580
cttggtaacc cttatgtcgc tgctgcatat ttacttggcg cgactaaaaa attgaatgta2640
ggaactgccg ctattgttct tcccacagcc catccagtac gccaacttga agatgtgaat2700
ttattggatc aaatgtcaaa aggacgattt cggtttggta tttgccgagg gctttacaac2760
aaggactttc gcgtattcgg cacagatatg aataacagtc gcgccttagc ggaatgctgg2820
tacgggctga taaagaatgg catgacagag ggatatatgg aagctgataa tgaacatatc2880
aagttccata aggtaaaagt aaaccccgcg gcgtatagca gaggtggcgc accggtttat2940
gtggtggctg aatcagcttc gacgactgag tgggctgctc aatttggcct accgatgata3000
ttaagttgga ttataaatac taacgaaaag aaagcacaac ttgagcttta taatgaagtg3060
gctcaagaat atgggcacga tattcataat atcgaccatt gcttatcata tataacatct3120
gtagatcatg actcaattaa agcgaaagag atttgccgga aatttctggg gcattggtat3180
gattcttatg tgaatgctac gactattttt gatgattcag accaaacaag aggttatgat3240
ttcaataaag ggcagtggcg tgactttgta ttaaaaggac ataaagatac taatcgccgt3300
attgattaca gttacgaaat caatcccgtg ggaacgccgc aggaatgtat tgacataatt3360
caaaaagaca ttgatgctac aggaatatca aatatttgtt gtggatttga agctaatgga3420
acagtagacg aaattattgc ttccatgaag ctcttccagt ctgatgtcat gccatttctt3480
aaagaaaaac aacgttcgct attatattag ctaaggagaa agaaatgaaa tttggattgt3540
tcttccttaa cttcatcaat tcaacaactg ttcaagaaca aagtatagtt cgcatgcagg3600
aaataacgga gtatgttgat aagttgaatt ttgaacagat tttagtgtat gaaaatcatt3660
tttcagataa tggtgttgtc ggcgctcctc tgactgtttc tggttttctg ctcggtttaa3720
cagagaaaat taaaattggt tcattaaatc acatcattac aactcatcat cctgtcgcca3780
tagcggagga agcttgctta ttggatcagt taagtgaagg gagatttatt ttagggttta3840
gtgattgcga aaaaaaagat gaaatgcatt tttttaatcg cccggttgaa tatcaacagc3900
aactatttga agagtgttat gaaatcatta acgatgcttt aacaacaggc tattgtaatc3960
cagataacga tttttatagc ttccctaaaa tatctgtaaa tccccatgct tatacgccag4020
gcggacctcg gaaatatgta acagcaacca gtcatcatat tgttgagtgg gcggccaaaa4080
aaggtattcc tctcatcttt aagtgggatg attctaatga tgttagatat gaatatgctg4140
aaagatataa agccgttgcg gataaatatg acgttgacct atcagagata gaccatcagt4200
taatgatatt agttaactat aacgaagata gtaataaagc taaacaagag acgcgtgcat4260
ttattagtga ttatgttctt gaaatgcacc ctaatgaaaa tttcgaaaat aaacttgaag4320
aaataattgc agaaaacgct gtcggaaatt atacggagtg tataactgcg gctaacttgg4380
caattgaaaa gtgtggtgcg aaaagtgtat tgctgtcctt tgaaccaatg aatgatttga4440
tgagccaaaa aaatgtaatc aatattgttg atgataatat taagaagtac cacatggaat4500
atacctaata gatttcgagt tgcagcgagg cggcaagtga acgaatcccc aggagcatag4560
ataactatgt gactggggtg agtgaaagca gccaacaaag cagcagcttg aaagatgaag4620
ggtataaaag agtatgacag cagtgctgcc atactttcta atattatctt gaggagtaaa4680
acaggtatga cttcatatgt tgataaacaa gaaattacag caagctcaga aattgatgat4740
ttgatttttt cgagcgatcc attagtgtgg tcttacgacg agcaggaaaa aatcagaaag4800
aaacttgtgc ttgatgcatt tcgtaatcat tataaacatt gtcgagaata tcgtcactac4860
tgtcaggcac acaaagtaga tgacaatatt acggaaattg atgacatacc tgtattccca4920
acatcggttt ttaagtttac tcgcttatta acttctcagg aaaacgagat tgaaagttgg4980
tttaccagta gcggcacgaa tggtttaaaa agtcaggtgg cgcgtgacag attaagtatt5040
gagagactct taggctctgt gagttatggc atgaaatatg ttggtagttg gtttgatcat5100
caaatagaat tagtcaattt gggaccagat agatttaatg ctcataatat ttggtttaaa5160
tatgttatga gtttggtgga attgttatat cctacgacat ttaccgtaac agaagaacga5220
atagattttg ttaaaacatt gaatagtctt gaacgaataa aaaatcaagg gaaagatctt5280
tgtcttattg gttcgccata ctttatttat ttactctgcc attatatgaa agataaaaaa5340
atctcatttt ctggagataa aagcctttat atcataaccg gaggcggctg gaaaagttac5400
gaaaaagaat ctctgaaacg tgatgatttc aatcatcttt tatttgatac tttcaatctc5460
agtgatatta gtcagatccg agatatattt aatcaagttg aactcaacac ttgtttcttt5520
gaggatgaaa tgcagcgtaa acatgttccg ccgtgggtat atgcgcgagc gcttgatcct5580
gaaacgttga aacctgtacc tgatggaacg ccggggttga tgagttatat ggatgcgtca5640
gcaaccagtt atccagcatt tattgttacc gatgatgtcg ggataattag cagagaatat5700
ggtaagtatc ccggcgtgct cgttgaaatt ttacgtcgcg tcaatacgag gacgcagaaa5760
gggtgtgctt taagcttaac cgaagcgttt gatagttga 5799
權(quán)利要求
1.一種用于測定有機污染物濃度的轉(zhuǎn)化株，其包含至少一質(zhì)粒，該質(zhì)粒至少包含編碼甲苯雙加氧酶的基因的啟動子Ptod(SEQ ID NO1)及發(fā)光光桿狀菌(Photorhabdus luminescens)的lux基因(SEQ ID NO2)。
2.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化株，其為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)轉(zhuǎn)化株。
3.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化株，其為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)轉(zhuǎn)化株。
4.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化株，其中該轉(zhuǎn)化株表達冷光的強度與其所接觸之有機污染物濃度約可符合關系式
L＝Lmax×P/(KC+P)
其中L為冷光強度，Lmax為最大冷光強度，P為有機污染物濃度，且KC為轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力常數(shù)。
5.權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)化株，其中該轉(zhuǎn)化株表達冷光的強度與其所接觸之有機污染物濃度約符合關系式
L＝Lmax×P2/(KC2+P2)
其中L為冷光強度，Lmax為最大冷光強度，P為有機污染物濃度，且KC為轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力常數(shù)。
6.權(quán)利要求4或5的轉(zhuǎn)化株，其中該有機污染物為苯、甲苯、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯和順式二氯乙烯。
7.一種惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株，其包含質(zhì)粒ptod_lux，該轉(zhuǎn)化株寄存于財團法人食品工業(yè)發(fā)展研究所(Food Industry Research andDevelopment Institute)，微生物寄存號碼為BCRC 940538，并于2008年6月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 208098。
8.一種利用轉(zhuǎn)化株測定有機污染物濃度的方法，其中該轉(zhuǎn)化株包含至少一質(zhì)粒，該質(zhì)粒至少包含可編碼甲苯雙加氧酶的基因的啟動子Ptod(SEQID NO1)及發(fā)光光桿狀菌的lux基因(SEQ ID NO2)，該方法包含
(1)將該轉(zhuǎn)化株與待測有機污染物接觸一適當時間；
(2)測定該轉(zhuǎn)化株所產(chǎn)生的冷光值；及
(3)將該冷光值代入以標準濃度的有機污染物與該轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的對應冷光值所建立的關系式中，以決定該待測有機污染物之濃度。
9.權(quán)利要求8的方法，其中以標準濃度的有機污染物與該轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的對應冷光值所建立的關系式為
L＝Lmax×P/(KC+P)
其中L為冷光強度，Lmax為最大冷光強度，P為有機污染物濃度，且KC為轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力常數(shù)。
10.權(quán)利要求8的方法，其中以標準濃度的有機污染物與該轉(zhuǎn)化株產(chǎn)生的對應冷光值所建立的關系式為
L＝Lmax×P2/(KC2+P2)
其中L為冷光強度，Lmax為最大冷光強度，P為有機污染物濃度，且KC為轉(zhuǎn)化株和污染物的解離能力常數(shù)。
11.權(quán)利要求8的方法，其中該有機污染物為苯、甲苯、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯和順式二氯乙烯。
12.權(quán)利要求8的方法，其中該轉(zhuǎn)化株可利用褐藻酸鈉與氯化鈣的包埋法制成固定化菌球體。
13.權(quán)利要求8的方法，其中該轉(zhuǎn)化株為惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株，其包含質(zhì)粒ptod_lux，該轉(zhuǎn)化株寄存于財團法人食品工業(yè)發(fā)展研究所，微生物寄存號碼為BCRC 940538，并于2008年6月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 208098。
14.一種可感應污染物的質(zhì)粒，其至少包含編碼甲苯雙加氧酶的基因的啟動子Ptod(SEQ ID NO1)及發(fā)光光桿狀菌的lux基因(SEQ ID NO2)。
15.權(quán)利要求14的質(zhì)粒，其中該有機污染物為苯、甲苯、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯和順式二氯乙烯。
16.權(quán)利要求14的質(zhì)粒，其于假單胞菌屬的宿主中表達。
17.權(quán)利要求14的質(zhì)粒，其于惡臭假單胞菌的宿主中表達。
18.一種利用轉(zhuǎn)化株評估處理有機污染物的方法，其中該轉(zhuǎn)化株包含至少一質(zhì)粒，該質(zhì)粒至少包含可編碼甲苯雙加氧酶的基因的啟動子Ptod(SEQ ID NO1)及發(fā)光光桿狀菌的lux基因(SEQ ID NO2)，其中該方法包含
(1)將該轉(zhuǎn)化株與待測有機污染物接觸一適當時間；
(2)測定該轉(zhuǎn)化株所產(chǎn)生的冷光值；及
(3)將該冷光值與該轉(zhuǎn)化株于最適條件下所產(chǎn)生的冷光值比較，以評估該待測有機污染物是否適于以微生物處理。
19.權(quán)利要求18的方法，其中該有機污染物為苯、甲苯、乙苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯、酚、四氯乙烯、三氯乙烯和順式二氯乙烯。
20.權(quán)利要求18的方法，其中該轉(zhuǎn)化株可利用褐藻酸鈉與氯化鈣的包埋法制成固定化菌球體。
21.權(quán)利要求18的方法，其中該轉(zhuǎn)化株為惡臭假單胞菌dcblux轉(zhuǎn)化株，其包含質(zhì)粒ptod_lux，該轉(zhuǎn)化株寄存于財團法人食品工業(yè)發(fā)展研究所，微生物寄存號碼為BCRC 940538，并于2008年6月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 208098。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于有機污染物濃度檢測的轉(zhuǎn)化株，其中該轉(zhuǎn)化株包含至少一質(zhì)粒，該質(zhì)粒至少包含可編碼甲苯雙加氧酶(toluene dioxygenase)的基因的啟動子Ptod及發(fā)光光桿狀菌(Photorhabdus luminescens)的lux基因。本發(fā)明亦關于一種惡臭假單胞菌dcblux(Pseudomonas putida dcblux)轉(zhuǎn)化株。此外，本發(fā)明亦關于一種利用轉(zhuǎn)化株檢測有機污染物濃度與降解效能的方法，使用本發(fā)明的方法可簡易快速、現(xiàn)地檢測而達成有機污染物濃度與降解效能檢測之目的。
文檔編號C12Q1/02GK101619341SQ20081012953
公開日2010年1月6日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日 公開號200810129535.發(fā)明者張裕釧, 許嘉珍, 翁豐岳, 林畢修平 申請人:財團法人生物技術開發(fā)中心