專利名稱：一種在多孔硅膠上固定漆酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種將真菌漆酶(Laccase from verw'co/or)固定在功能化多孔硅膠載
體上的方法。屬于環境微生物應用領域。
背景技術：
漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，廣泛存在多種生物體內。漆酶作用的底物相當廣泛，包 括多酚、甲基替代單酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯，以及其他容易氧化的化合物，其作 用主要是催化氧化還原反應。由于具有相當廣泛的底物專一性和較好的穩定性，漆酶在廢水 處理、生物漂白、芳香化合物轉化、環境監測等方面具有重要應用價值。
酶的高級結構對環境十分敏感，各種因素如物理因素(溫度、壓力、磁力場)、化學因素 (氧化、還原、pH、有機溶劑、離子強度、金屬離子)和生物因素均可能使漆酶喪失活性， 游離態漆酶即使在最適條件下，隨著反應時間的延長，反應速度會逐漸下降，反應后不能回 收，且難以實現重復利用。與游離態酶相比，固定化酶在保持其高效、專一及溫和的酶催化 反應特性的同時，還存在穩定性高、分離回收容易、可多次重復使用、操作連續及可控。
近年來國際上對漆酶的固定化進行了較為廣泛的研究，文獻(HuX.K. etal., Chemosphere 2007,66: 1618-1626)通過共價結合和物理吸附的方法把來自于vers/co/or真菌漆酶固 定在介孔分子篩SBA-15上，并研究發現這種固定化漆酶對多種環境典型污染物(如多環芳 烴類污染物)降解效果顯著。文獻(王炎等，高校化學工程學報，2008,22 (1): 83-87)通過 物理吸附把漆酶固定在介孔分子篩MCM-41上，并具有較高的表觀活性和穩定性。但現有的 固定化載體材料還普遍存在于合成價格昂貴，加工工藝復雜，分離效果差等缺點。
本發明的目的正是解決了上述幾個問題，本發明中固定化漆酶的載體采用了多孔材料比 表面積大，孔徑適中的多孔硅膠作為固定化漆酶的載體，避免了納米材料作為固定化酶載體 難以分離的特點， 一方面提供一種可以通過共價結合法固定漆酶的功能化的多孔硅膠載體， 另一方面提供這種功能化載體固定漆酶的方法，該方法簡化了制備固定化酶多孔載體的方法， 降低了生產成本，同時增強了漆酶的穩定性，有助于拓寬漆酶在環境保護領域中的應用。
發明內容
本發明的目的在于提供一種以功能化多孔硅膠為載體的高穩定性、高活性的固定化漆酶方法。
發明內容
是以功能化多孔硅膠為載體，將漆酶通過共價結合的方法固定在該載體上。 該方法包括兩個步驟載體的制備及漆酶的固定化。 1 )載體的制備
(a) 多孔硅膠先用1摩爾/升的鹽酸浸泡8-12小時，然后在60-8(TC下烘干；
(b) 稱取所需的烘干后的硅膠置于三角瓶中，向其中加入體積比為3: 1的？氨丙基三乙 氧基硅烷和甲苯混合液，將三角瓶連入冷凝回流裝置，氨基化8-12小時；
(c) 將氨基化的硅膠依次用甲苯、蒸餾水和無水乙醇各清洗3-4次；
(d) 將2.5%-5%質量分數的戊二醛水溶液與所需的氨基化硅膠充分混合，置于真空抽氣裝 置；
(e) 在真空狀態下超聲反應30分鐘；
(f) 置于常溫常壓下靜置30分鐘；
(g) 將嫁接上醛基的多孔硅膠載體低溫干燥，即獲得固定化用的多孔硅膠載體； 2)漆酶的固定化
(a) 將步驟l)中得到的干燥多孔硅膠載體與溶于pH-7.0磷酸緩沖溶液的漆酶充分混合， 置于垂直混合器上于4'C條件下固定12小時；
(b) 用pH-7.0磷酸緩沖溶液洗滌，并收集洗滌液，直到洗滌液中沒有蛋白檢出；
(c) 將固定化好的漆酶放置在pH=8.0乙醇胺-鹽酸緩沖溶液中靜置2小時；
(d) 將靜置后的固定化漆酶用pH=7.0的磷酸緩沖溶液洗滌若千次，然后低溫真空干燥制 備成固定化漆酶成品。
作為用于本發明的載體，多孔硅膠是優選的，對于所述的載體，孔徑優選在10-50納米 左右的范圍內。在孔徑50納米或者更高的情況下，載體的表面積降低造成載酶量降低而影響 酶的活性，孔徑過于小，容易造成酶不能充分利用里面的孔道結構。載體粒徑為60-120目， 優選80-100目，這樣的載體有利于分離和重復利用。
圖1本發明所述載體功能化和漆酶共價結合示意圖
圖2固定化溫度與固定化漆酶相對活性的關系示意圖
圖3戊二醛濃度和醛基去除對漆酶固定化的影響示意圖
圖4固定化漆酶使用次數與固定化漆酶相對活性的關系示意圖
具體實施例方式
以下通過實施例進一步描述本發明。以下的實施例具體解釋本發明，本發明的范圍不受實施
例的限制。
實施例1:
1嫁接氨基
(1) 將10.0克80目多孔硅膠和100毫升l摩爾/升的鹽酸混合浸泡8小時，用去離 子水洗滌若干次，放置到8(TC真空干燥箱中干燥8小時。
(2) 將1.0克上述處理的載體和20毫升？氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于 250毫升錐形瓶中，超聲混合均勻，放置到96t:冷凝回流裝置中回流llh。依次用甲苯、 蒸餾水和無水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
將1.0克上述嫁接氨基的載體與25毫升2.5%的戊二醛水溶液混合均勻，在真空條件 下超聲30分鐘，在室溫條件下靜置30分鐘。洗滌干燥。
3漆酶的固定化
(1) 將0.7克上述制備的載體與7毫升pH-7.0，濃度為5毫克/毫升的漆酶溶液混合 均勻，置于垂直混合器于4'C中固定12小時。
(2) 將經洗滌后的固定化漆酶放置到pH-8.0的乙醇胺-鹽酸溶液中靜置2小時。
實施例2
1嫁接氨基
(1) 10.0克100目多孔硅膠和100毫升1摩爾/升的鹽酸混合浸泡8小時，用去離子 水洗滌若干次，放置到8(TC真空干燥箱中干燥8小時。
(2) 將1.0克上述處理的載體和20毫升Y-氨丙基三乙氧基硅垸、60毫升甲苯置于 250毫升錐形瓶中，超聲混合均勻，放置到96'C冷凝回流裝置中回流llh。依次用甲苯、蒸餾水、無水乙醇各清洗3-4次。 2 嫁接醛基
將1.0克上述嫁接氨基的載體與25毫升5%的戊二醛水溶液混合均勻，在真空條件 下超聲30分鐘，在室溫條件下靜置30分鐘。洗滌干燥。
3漆酶固定化
將0.7克上述制備的載體與7毫升pH=7.0，濃度為5毫克/毫升的漆酶溶液混合均勻， 置于垂直混合器于4'C中固定12小時。
實施例3
1嫁接氨基
(1) 將10.0克120目多孔硅膠和100毫升1摩爾/升的鹽酸混合浸泡8小時，用去離 子水洗漆若干次，放置到8(TC真空干燥箱中干燥8小時。
(2) 將1.0克上述處理的載體和20毫升Y-氨丙基三乙氧基硅垸、60毫升甲苯置于 250毫升錐形瓶中，超聲混合均勻，放置到96'C冷凝回流裝置中回流llh。依次用甲苯、 蒸餾水和無水乙醇各清洗3-4次。
2 嫁接醛基
將1.0克上述嫁接氨基的載體與25毫升2.5%的戊二醛水溶液混合均勻，在真空條件下 超聲30分鐘，在室溫條件下靜置30分鐘。洗滌干燥。
3漆酶固定化
(1) 將0.7克上述制備的載體與7毫升pH=7.0，濃度為5毫克/毫升的漆酶溶液混合 均勻，置于垂直混合器于4'C中固定12小時。
(2) 將經洗滌后的固定化漆酶放置到pH-8.0的乙醇胺-鹽酸溶液中靜置2小時。1 嫁接氨基
(1) 10.0克60目多孔硅膠和IOO毫升l摩爾/升的鹽酸混合浸泡8小時，用去離子 水洗漆若干次，放置到8(TC真空干燥箱中干燥8小時。
(2) 將1.0克上述處理的載體和20毫升y-氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于 250毫升錐形瓶中，超聲混合均勾，放置到96'C冷凝回流裝置中回流llh。依次用甲苯、 蒸餾水、無水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
將1.0克上述嫁接氨基的載體與25毫升2.5%的戊二醛水溶液混合均勻，在真空條件下 超聲30分鐘，在室溫條件下靜置30分鐘。洗滌干燥。
3漆酶的固定化
(1) 0.7克上述制備的載體與7毫升pH=7.0,濃度為5毫克/毫升的漆酶溶液混合均 勻，置于垂直混合器于1(TC中固定12小時。
(2) 將經洗滌后的固定化漆酶放置到pH-8.0的乙醇胺-鹽酸溶液中靜置2小時。
實施例5
1 嫁接氨基
(1) 將10.0克80目多孔硅膠和IOO毫升1摩爾/升的鹽酸混合浸泡8小時，用去離 子水洗滌若干次，放置到8(TC真空干燥箱中干燥8小時。
(2) 將1.0克上述處理的載體和20毫升Y-氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于250 毫升錐形瓶中，超聲混合均勻，放置到96'C冷凝回流裝置中回流llh。依次用甲苯、蒸餾 水和無水乙醇各清洗3-4次。2嫁接醛基
將1.0克上述嫁接氨基的載體與25毫升2.5%的戊二醛水溶液混合均勻，在真空條件下 超聲30分鐘，在室溫條件下靜置30分鐘。洗滌干燥。
3漆酶的固定化
(1) 0.7克上述制備的載體與7毫升pH=7.0，濃度為5毫克/毫升的漆酶溶液混合均 勻，置于垂直混合器于2(TC中固定12小時。
(2) 將經洗滌后的固定化漆酶放置到pH-8.0的乙醇胺-鹽酸溶液中靜置2小時。
實施例6
1嫁接氨基
(1) 將10.0克100目多孔硅膠和100毫升1摩爾/升的鹽酸混合浸泡8小時，用去 離子水洗滌若干次，放置到80'C真空干燥箱中干燥8小時。
(2) 將1.0克上述處理的載體和20毫升Y-氨丙基三乙氧基硅烷、60毫升甲苯置于 250毫升錐形瓶中，超聲混合均勻，放置到96'C冷凝回流裝置中回流llh。依次用甲苯、 蒸餾水和無水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
將1.0克上述嫁接氨基的載體與25毫升2.5%的戊二醛水溶液混合均勻，在真空條件下 超聲30分鐘，在室溫條件下靜置30分鐘。洗滌干燥。
3漆酶的固定化
(1) 0.7克上述制備的載體與7毫升pH-7.0，濃度為5毫克/毫升的漆酶溶液混合均 勻，置于垂直混合器于3(TC中固定12小時。
(2) 將經洗漆后的固定化漆酶放置到pH-8.0的乙醇胺-鹽酸溶液中靜置2小時。實施例7
1嫁接氨基
(1) 將10.0克80目多孔硅膠和IOO毫升1摩爾/升的鹽酸混合浸泡8小時，用去離 子水洗漆若干次，放置到8(TC真空干燥箱中干燥8小時。
(2) 將1.0克上述處理的載體和20毫升"r氨丙基三乙氧基硅垸、60毫升甲苯置于 250毫升錐形瓶中，超聲混合均勻，放置到96'C冷凝回流裝置中回流llh。依次用甲苯、 蒸餾水和無水乙醇各清洗3-4次。
2嫁接醛基
將1.0克上述嫁接氨基的載體與25毫升2.5%的戊二醛水溶液混合均勻，在真空條件下 超聲30分鐘，在室溫條件下靜置30分鐘。洗滌干燥。
3漆酶的固定化
(1) 0.7克上述制備的載體與7毫升pH=7.0，濃度為5毫克/毫升的漆酶溶液混合均 勻，置于垂直混合器于4'C中固定24小時。
(2) 將經洗滌后的固定化漆酶放置到pH-8.0的乙醇胺-鹽酸溶液中靜置2小時。
權利要求
1.一種在多孔硅膠載體上固定化漆酶的方法，其特征在于包括步驟如下1)載體的制備(a)多孔硅膠先用1摩爾/升的鹽酸浸泡8-12小時，然后在60-80℃下烘干；(b)稱取所需的烘干后的硅膠置于三角瓶中，向其中加入體積比為3∶1的γ-氨丙基三乙氧基硅烷和甲苯混合液，將三角瓶連入冷凝回流裝置，氨基化8-12小時；(c)將氨基化的硅膠依次用甲苯、蒸餾水和無水乙醇各清洗3-4次；(d)將2.5％-5％質量分數的戊二醛水溶液與所需的氨基化硅膠充分混合，置于真空抽氣裝置；(e)在真空狀態下超聲反應30分鐘；(f)置于常溫常壓下靜置30分鐘；(g)將嫁接上醛基的多孔硅膠載體低溫干燥，即獲得固定化用的多孔硅膠載體；2)漆酶的固定化(a)將步驟1)中得到的干燥多孔硅膠載體與溶于pH＝7.0磷酸緩沖溶液的漆酶充分混合，置于垂直混合器上于4℃條件下固定12小時；(b)用pH＝7.0磷酸緩沖溶液洗滌，并收集洗滌液，直到洗滌液中沒有蛋白檢出；(c)將固定化好的漆酶放置在pH＝8.0乙醇胺-鹽酸緩沖溶液中靜置2小時；(d)將靜置后的固定化漆酶用pH＝7.0的磷酸緩沖溶液洗滌若干次，然后低溫真空干燥制備成固定化漆酶成品。
2. 根據權利要求l中所述的方法，其中步驟O中多孔硅膠載體粒徑為60-100目。
3. 根據權利要求1中所述的方法，其中多孔硅膠載體的孔徑為10-50納米。
全文摘要
本發明涉及到將漆酶固定到一種多孔硅膠載體上的方法，屬于環境微生物領域。該方法以層析用多孔硅膠為載體，通過共價結合的方法將漆酶固定在功能化多孔硅膠載體上。其固定的方法包括兩個步驟載體的制備和漆酶的固定。載體制備是將多孔硅膠與一定量的戊二醛水溶液混合，在真空超聲下反應，制備出可與漆酶共價結合的功能化載體；漆酶的固定是在4攝氏度下，pH＝7.0的緩沖溶液下先固定漆酶12小時，洗滌、低溫干燥后得到固定化的漆酶。本發明提供了一個高穩定性、高活性的固定化漆酶，制備方便，迅速、成本低廉。
文檔編號C12N11/06GK101294157SQ20081012602
公開日2008年10月29日 申請日期2008年7月1日 優先權日2008年7月1日
發明者佳 劉, 殷立峰, 沈珍瑤, 牛軍峰, 蔣國翔 申請人:北京師范大學