專利名稱：：一種紅纓海棠組織培養快速繁殖的方法
技術領域：
：本發明屬林業中通過組織培養的植物再生
技術領域：
，具體涉及一種紅纓海裳組織培養快速繁殖苗木的生產方法。二
背景技術：
：紅纓海裳(Ma/w好owgy/wg，)，屬薔薇科蘋果屬落葉小喬木，是南京林業大學2007年選育的海棠新品種。海裳是薔薇科(ioy"ceae)蘋果屬(M"/m)植物，為落葉小喬木或灌木，極少數種生長于亞熱帶地區，呈半常綠喬木，分布在橫跨歐亞大陸和北美洲、北綿20°~50°之間的區域內。全世界約有50個種，我國約有23各種，其中16個為特有種，常見的有垂絲海棠(Ma/m/za〃,'朋a)、海棠果(Ma/ws、湖北海業(Ma/its/zw/e/je"^)、西府海裳(M"/wxm/crowfl/i)等。海裳春可賞妖艷花姿，花色有緋紅、粉紅、淺紅、白色及復色等；秋可觀累累碩果，紅黃相映，晶瑩剔透，如珠似玉搖曳枝頭，又或果實碩大、芳香樸鼻，極具特色。因而，海棠在我國栽培歷史悠久，在歷代都作為極具觀賞價值的觀賞樹種應用于園林中。古典園林中海業多孤植、對植、叢植，可以充分展現海棠的花、葉、枝、干及果的單體美，現代園林中海棠的種類選擇和配置形式則須視造景需要和空間大小而定，小型空間宜選擇林型較小的海棠品種，如山荊子、日本海棠，孤植或三五叢植。大型空間選擇西府海棠、湖北海裳、垂絲海裳等抹型較大的種類群植或片植，造成遠看花開似錦，近看則樹影婆娑、枝柔花豐的景觀。據統計，目前全世界觀賞海裳品種據統計約有900多種，我國雖是海棠的分布中心，擁有較多種，但長期以來海裳的繁殖和栽培技術比較落后，其園林綠化上廣泛應用的仍是幾個傳統品種。紅纓海棠是一集觀葉、觀花、觀果于一體的海裳新品種，其小枝紅色，新葉紫紅色，密披白色絨毛，花紫紅色，花期3~4月，果期510月，果實較大，成熟后紫紅色，在園林上有著廣闊的應用前景。目前，紅纓海裳培育處于初級階段，主要采用嫁接、扦插等傳統方法進行苗木繁殖，但繁殖系數很低。組織培養苗木繁殖技術，是目前林木生物技術的主要內容之一。其主要特點是繁殖速度快、繁殖系數高、經濟高效、管理方便、生長周期較短、且不受地區、氣候的影響，可以及時提供大量優質種苗等優點。由于不同樹種，甚至同一樹種、不同品種的林木，其組織培養方法也有很大差異。目前，國內外雖然已有多個樹種的組織培養苗木繁殖技術專利和報導發表，由于紅纓海棠完全是一個林木新品種，因此，目前尚無紅纓海棠組織培養的文獻報道。尋找并探索紅纓海棠這一林木新品種的組織培養快速繁殖方法，是當前快速繁殖、推廣紅纓海裳這一優良林木新品種的迫切任務。
發明內容本發明的目的是根據當前紅纓海裳培育處于初級階段，主要采用嫁接、扦插等傳統方法進行苗木繁殖，但繁殖系數很低的狀況，尋找并探索紅纓海棠這一林木新品種的組織培養快速繁殖方法。本發明的技術解決方案為一種紅纓海棠組織培養快速繁殖的方法，其特征在于以當年生枝條為外植體，經過無菌處理、接種啟動培養、分化培養、增殖培養、生根培養和煉苗移栽后獲得幼苗。接種啟動培養、分化培養、增殖培養使用的均為N6基本培養基，生根3咅養使用的為大量元素減半的1/2N6基本培養基。N6基本培養基(中國科學院植物研究所和黑龍江省農業科學院的科研工作者所設計)和MS基本培養基(MurashingandSkoogmedium)、WPM(WoodyPlantMedium)木本植物組織培養基和GD(GuptaandDurzanmedium)基本培禾基等常用生物組織培養基一樣，也是林木組織培養快速繁殖中常用的培養基配方，其特點是低N、Mg2+、Ca2+、NH4+，高K+,并具有較高的N037NH4+,因為銨這一營養成分可能對有些培養物有抑制生長的作用。本發明中使用的N6基本培養基和1/2N6基本培養基的具體配方如下N6基本培養基大量兀素KN032830mg-L—1CaCl2-2H20166mg-L-1MgS04'7H20185mg-L-1KH2P04400mg'L-1(NH4)2S04463mg-i;1鐵鹽FeS04-7H2027.8mg-L-1Na2-EDTA-2H2037.3mg-L;1微量元素KI0.8mg丄-1H3B。31.6mg.L-1MnS04.4H204.4mg-L-1ZnS04-7H201.5mg'L-1有機物質煙酸0.5mg七-1鹽酸吡哆醇0.5mg-L—1鹽酸硫胺素l.Omg-L"甘氨酸2.0mg-U11/2N6，即大量元素減半的N6基本培養基大量兀素KN031415mg.L-1CaCl2.2H2083mg'L-1MgS04.7H2092.5mg丄-1KH2P04200mg'L-1(NH4)2SQ4231.5mg.I/'鐵鹽FeS04'7H2027.8mg-L-1Na2.EDTA.2H2037.3mg-L-:微量元素KIH3B03MnS04-4H20ZnS04.7H200.8mg'L管14,4mg丄-1.5mg'L管1有機物質煙酸0.5mg,L扁0.5mg'Ul.Omg'L-:2.0mg-I/:鹽酸吡哆醇鹽酸硫胺素甘氨酸如上所述，為了獲得最佳的組織培養結果，根據反復試驗，在不同的培養階段，還可分別在培養基中添加少量其它藥品，具體配方分別為接種啟動培養階段使用的具體培養基配方是N6+BA0.50mg.L"+NAA0.10mg.L"十Sucrose30.00mg'I/1，且控制培養基的pH值為5.8。分化培養階段使用的具體培養基配方是NG+BAl.OOmg'I^+NAAO.OSmg.I^+SucroseSO.OOg.L-1,且控制培養基的pH值為5.8。增殖培養階段使用的具體培養基配方是N6+BA0.50mg七"+NAA0.05mg'L"+Sucrose20.00g'L"+REE2.00mg.L-1，且控制培養基的pH值為5.8。生根培養階段使用的具體培養基配方是1/2N6+(NAA+IBA)(l:l)0.50mg'L"+Sucrosel0.00g'L-1,且控制培養基的pH值為6.0。其中BA為6-benzylaminopurine;NAA為a-naphthyleneaceticacid;Sucrose為蔗糖jREE為RareEarthElement;IBA為Indole-3-butyricacid。下面結合具體實施例詳細介紹培養的過程和方法。四圖1為外植體經消毒獲得的無菌芽；圖2為分化不定芽；圖3為增殖的不定芽叢；圖4為組培生根苗；圖5為移栽后的再生才直;f朱。五具體實施例方式a.取材一_選擇紅纓海裳優良母抹，于3~4月晴天的中午11:00左右，選取當年無病蟲害新生枝條作為外植體。b.無菌處理__將采回的枝條切成約2.0cm的帶有頂芽和側芽的小段，剪掉葉片及葉柄，先用酒精脫脂棉輕輕擦洗去除外植體上的絨毛，然后置于10%洗潔精溶液中浸泡30min,再用流水沖洗4h。在無菌條件下，先用75%的酒精浸泡30s，再用0.1%升汞處理10min,用無菌水沖洗3~5次，最后用無菌濾紙吸去殘余水分。c.接種啟動培養_—在超凈工作臺上，將消毒好的莖段(帶腋芽或頂芽)接種于啟動培養基N6+BA0,50mg.L"+NAA0.10mg七"+Sucrose30.00mg'U1(pH5.8)中，在恒溫25±2°C,光照(20001x)16h/d條件下進行啟動培養。7d后，腋芽逐漸膨大并萌發展葉，形成單芽(參見附圖1)，連續培養30d獲得無菌材料。d.分化培養一_外植體經接種啟動培養后，截取1.0~2.0cm的帶頂芽嫩莖接種于附加NAA0.00、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20mg七-1，BAO.OO、0.50、1.00、2.00、4.00mg'L"的分化培養基中進行分化培養。試驗表明，不同濃度的BA和NAA按一定濃度配比使用對不定芽分化率及不定芽生長狀況的影響差異均顯著，具體表現見表l。表l不同植物生長調節劑對不定芽分化的影響BA/mg.L"NAA/mg'L-1平均分化率/%生長狀況2.000.0028.卯葉巻曲，出現玻璃化2.000.0163.30分化大量芽點，部分頂芽上端葉片有枯萎現象2.000.02跳OO分化芽小而多2.000.05100.00分化芽粗壯，生長快2.000.1070.00分化芽少，生長良好2.000.200.00無分化，生長良好0.000.050.00基部產生愈傷，生長良好0.500.053.30植林生長旺盛，葉較寬1.000.0598.90生長快，莖粗壯，節間明顯2.000.05跳0腋芽分化，生長快4.000.0561.10分化芽莖細，葉邊出現枯萎莖段培養15d左右，基部逐漸膨大，培養20d左右分化形成不定芽叢。其中當NAA濃度為0.02、O.OSmg'U1時分化最好，分化率均達100.0%,并且不定芽分化所需時間較短，即13d就能看見分化形成的不定芽。但是，NAA為O.OSmg.U1時分化形成的不定芽數量多，但都很矮小，不利于進一步增殖與伸長培養。而當NAA為0.05mg.L"時，不同濃度的BA對不定芽分化影響差異大，而當BA濃度為l.OOmg.I/1時，不僅分化率不僅達98.30%,不定芽分化約需12d,并且分化形成的不定芽生長快，莖段粗壯，節間比較明顯，葉片較寬，最寬約1.0cm(參見附圖2)。而未添加NAA的培養基中分化形成不定芽有嚴重的玻璃化現象，甚至部分不定芽出現枯萎、死亡現象。試驗表明，最佳分化培養基配方為N6+BAl.OOmg'L"+NAA0.05mg-L-^SucroseSO.OOg'U1(pH5.8)。紅纓海業單芽在最佳培養基中經過恒溫25±2°C,光照(20001x)16h/d,連續培養30d，誘導分化形成較多的不定芽。e.增殖培養一一篩選已分化的、狀態一致的不定芽叢，轉接入增殖培養基中進行增殖培養。不同的植物生長調節劑、培養基成分和培養條件對分化形成的不定芽的增殖效果不同，其中植物生長調節劑對其影響差異最為顯著，具體表現參見表2。表2不同植物生長調節劑對不定芽增殖的影響BA/mg-L-1NAA/mg'L-1平均有效芽數/個平均芽高/cm生長狀況0.500,001,0葉窄小，叢生芽矮小，難以伸長0.500.058.53.0生長較快，莖粗壯，新葉為紅色0.500.105.82.5生長正常，葉綠色0.500.203.12.0生長較慢，基部產生少量愈傷0.500.501.61.5生長不正常，基部產生大量愈傷分化形成的不定芽在無NAA的誘導培養基中，形成矮小的不定芽叢，高僅約1.0cm,且難以伸長。而當BA為0.50mg.L"時，附加不同濃度NAA的培養基中，不定芽增殖效果也不同。當NAA濃度為0.05mg丄"和O.lOmg'U1的培養基上，增殖形成的有效芽多，不定芽生長較快，有效不定芽的平均芽都高于2.5cm,莖干粗壯，新葉為紅色，漸變成綠色。尤其是當NAA為0.05mg.1/1時，增殖系數達10以上，并且形成的有效不定芽數最多，達8.5個/抹以上。而培養基成分如蔗糖、大量元素含量以及Ph值等培養條件對不定芽的增殖也有一定的影響。經過試驗最終可得不定芽叢最佳增殖培養基配方為N6+BA0.50mg-L"+NAA0.05mg.L"+Sucrose20.00g丄-i+REE2.00mg-I/1(pH5.8)。不定芽叢再最佳增殖培養基中經過恒溫25±2°C,光照(20001x)16h/d,連續培養30d,形成2.03.0cm的不定芽叢(參見附圖3)。f.生根培養一_將2.0~3.0cm的單芽接種于附加不同濃度生長素的生根培養基進行生根培養。不同的生長素及其不同的濃度對其生根影響差異顯著(見表3)。表3不同生長素及濃度對不定根的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>無任何生長素的培養基中，植林無不定根形成，而在添加不同生長素的培養基中，其嫩莖生根效果均比對照好，生根率大部分都在70.0%以上。嫩莖接入含有生長素的培養基10d后，嫩莖基部都明顯膨大。幼莖生才艮培養第8d,處理2、6、7、9、10五個處理出現淺紅色愈傷組織。隨著時間的延長，愈傷組織不斷增多、增大，并漸變為白色。在添加低濃度生長素(處理1、2、5、6、7、8)的培養中，莖段基部無明顯的愈傷形成，2d后，可見淺紅色不定根。而高濃度處理(處理4、8、12)中所形成的愈傷較大，但不定根伸長生長困難。尤其以濃度為l.Omg.L"的NAA和IBA按1:1混合的處理(處理12)中，其生根率較低，僅有6.67%,而且不定根形成所需時間較長(誘導17d后才可見形成的不定根)，生長也緩慢，30d后不定根平均長僅約O.lcm。在僅添加IBA的各處理中，生根率均在90.0%以上。在僅添加NAA的培養基中，誘導形成的不定根較少(約3.5條/抹)，且較纖細；在添加IBA+NAA(1:1)的培養基中，處理9、10和11處理的不定根根系較好，不定根不僅粗壯，根長也較長，最長可達0.7cm,而且部分不定根有側根形成。這說明IBA對紅纓海裳不定根的誘導效果比NAA好，而二者按1:1混合使用對紅纓海裳不定根的誘導更為有效。在所有不定根誘導處理中，濃度為0.5mg丄"的各生長素所誘導的不定根數量較多，每抹形成的不定根均超過4條。所以，綜合生根率、不定根數量及不定根長度考慮，誘導紅纓海裳不定根的最佳生長素為NAA和IBA(1:1)混合，濃度為0.5mg.i;1。而不同糖源、糖濃度、pH值及暗培養時間對不定根誘導也有一定影響。經過試驗可得嫩莖在1/2N6+(NAA+IBA)(1:1)0.50mg.i;1+SucroselO.OOgvL"(pH6.0)培養基(即最佳生根培養基配方)中，恒溫25±2°C，先暗培養3~6d,然后在光照(20001x)16h/d條件下連續培養約30d，誘導出較高質量的根系，形成健壯的組培生根苗(參見附圖4),不僅生根率達100.0%,而且平均不定根數量達8條/一朱，平均不定根長0.3cm,最長達1.0cm。g.煉苗移栽__過長的不定根在移栽時易斷，或移栽時易窩根，影響苗木的生長發育，降低苗木質量。因此，待組培生根苗根長達到1.Ocm左右時即可松瓶口皮筋、揭膜煉苗。生根苗經揭開封口膜常規煉苗5d后，即可將生根苗移栽至珍珠巖、蛭石和草炭土(1:1:1)混合的基質中轉入常規育苗(參見附圖5)。移栽后30d內，每周噴施1%。多菌靈以防止病害，注意保濕、保溫，移栽成活率達80.0%以上。在上述各階段的培養基配方中，均添加Agar6.00mg.L";并在增殖培養基配方中添加REE2.00mg.L-1。其中Agar為瓊脂粉，500g/并瓦，產地日本，南京博全科凈支有限公司分裝。Sucrose為蔗糖，500g/瓶，廣東汕頭西隴化工廠生產。REE為硝酸鑭，25g/瓶，成都科龍化工試劑廠生產。BA為6-千M噤呤，lg/瓶，國藥集團化學試劑有限公司。NAA為萘乙酸10g/瓶，江蘇金壇市程宏化工廠生產。IBA為吲哚丁酸，lg/瓶，國藥集團化學試劑有限公司。有益效果采用上述方法進行紅纓海裳的繁殖育苗，增殖系數在8以上，理論上其每年繁殖效率比常規嫁接、扦插等傳統方法要高出約81()倍，大大緩解了新品種苗木緊缺的矛盾，滿足了市場和新品種推廣工作的需要。權利要求1.一種紅纓海棠組織培養快速繁殖的方法，其特征在于以當年生枝條為外植體，經過無菌處理、接種啟動培養、分化培養、增殖培養、生根培養和煉苗移栽后獲得幼苗，接種啟動培養、分化培養、增殖培養使用的均為N6基本培養基，生根培養使用的為大量元素減半的1/2N6基本培養基。2.如權利要求1所述的紅纓海裳組織培養快速繁殖的方法，其特征在于接種啟動培養階段使用的N6基本培養基中還添加少量BA、NAA和Sucrose,具體培養基配方是N6+BA0.50mg'L"+NAA0.10mg'L"+Sucrose30.00mg'U1，且控制培養基的pH值為5.8。3.如權利要求1所述的紅纓海裳組織培養快速繁殖的方法，其特征在于分化培養階段使用的N6基本培養基中還添加少量BA、NAA和Sucrose,具體培養基配方是N6+BA1.00mg'L-1+NAA0.05mg'L-1+Sucrose30.00g'U1,且控制培養基的pH值為5.8。4.如權利要求1所述的紅纓海裳組織培養快速繁殖的方法，其特征在于增殖培養階段使用的N6基本培養基中還添加少量的BA、NAA、Sucrose和REE，具體增殖培養基配方是N6+BA0.50mg'L-1+NAA0.05mg'L-1+Sucrose20.00g'U1+REE2.00mg.U1，且控制培養基的pH值為5.8。5.如權利要求1所述的紅纓海裳組織培養快速繁殖的方法，其特征在于生根培養階段使用的1/2N6基本培養基中還添加少量NAA、IBA和Sucrose，具體培養基配方是l/2N6+(NAA+IBA)(l:l)0.50mg'U1+Sucrose10.00g.L"，且控制培養基的pH值為6.0。全文摘要一種紅纓海棠組織培養快速繁殖的方法，其特征在于以紅纓海棠優良母株當年生枝條為外植體，經過無菌處理、接種啟動培養、分化培養、增殖培養、生根培養和煉苗移栽后獲得幼苗，接種啟動培養、分化培養、增殖培養使用的均為N6基本培養基，生根培養使用的為大量元素減半的1/2N6基本培養基。采用本方法進行紅纓海棠的繁殖育苗，增殖系數在8以上，大大緩解了新品種苗木緊缺的矛盾。文檔編號C12N5/04GK101352149SQ20081012475公開日2009年1月28日申請日期2008年9月2日優先權日2008年9月2日公開號200810124757.發明者沈永寶,游小英申請人:南京林業大學