專利名稱：一種羰酰還原酶在生產(s)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種羰酰還原酶的應用，尤其涉及一種羰酰還原酶 (Ccarbonyl Rreductase CR)在以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物不對稱還原反應生產(S)-4-氯-3羥 基丁酸乙酯中的應用。
背景技術：
(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate， (S)-CHBE)是一種 重要的有機中間體，可用于很多活性藥物的合成，如他汀類藥物——羥甲基戊二酰 CoA(HMG-CoA)還原酶抑制劑和4-羥基吡啶垸酮(4-hydroxypyrrolidone)等[1]。
以4-氯乙酰乙酸乙酯(4-chloroacetoacetate Ethyl COBE)作為還原反應的潛手性底物， 易于合成且價格低廉，以其為底物進行不對稱還原反應獲取(S)-CHBE是非常經濟有效 的制備途徑。
迄今為止關于COBE不對稱還原制備手性CHBE已進行了很多的研究報道。概括 起來主要有化學法和生物法。
化學催化不對稱還原法，所用催化劑包括價格昂的貴銠、釕等金屬，采用化學法合 成手性CHBE的缺點是產物的光學純度不夠高，且催化還原反應需要很高的氫氣壓，耗 能高，污染大。
微生物法分為酶催化和全細胞催化法，Shimizu等用來自S/wo6o/owyce;y m/附o"!'co/oMA:C/ W"的NADPH依賴的醛基還原酶分別在單一水相體系[2]和水/有 機溶劑兩相體系[3]催化還原COBE制備手性CHBE，由于應用酶催化還原反應所用的 酶要從微生物細胞中分離純化得到，過程操作繁瑣且酶容易失活，與全細胞催化相比， 應用較少。全細胞法則分為采用野生酵母和基因工程菌催化COBE為(S)—CHBE兩種， Yasohara等[4]從400株酵母菌中篩選得到了一株Ca"&由wag o//ae，在水/乙酸正丁 酯體系中，在添加葡萄糖、NADP和葡萄糖脫氫酶以及反應過程中需要控制pH值的 條件下產物(S) -CHBE在有機相的積累濃度可達90 g/L，產物的光學純度對映體過 量值(enantiomeric excess e.e)達到96%。由于采用野生酵母中往往含有多種能夠催化 COBE為不同構型CHBE的還原酶，因此采用野生酵母進行催化所獲得的產物的光學活 性往往很低，需要篩選到高立體選擇性的優良微生物菌株非常困難，所以近來的研究著 重集中于運用重組大腸桿菌不對稱合成具有高立體選擇性的(S)-CHBE。 Yasohara等[5] 從木蘭假絲酵母菌Om^/a ;m^zo//ae中分離得到了 一個輔酶NADPH依賴型的羰基還 原酶，將該酶與葡萄糖脫氫酶基因克隆到大腸桿菌中共表達，在定時添加適量的輔酶
NADP和葡萄糖以及分批添加底物的條件下，催化COBE的不對稱還原(S)-CHBE，其 得率和光學純度分別為85%和100%e.e. [6]。
綜上所述，現有催化COBE為(S)-CHBE的技術存在底物得率低、產物光學活性底、 成本高等問題。
本專利中涉及到的還原酶是羰酰還原酶的一種，其包含282個氨基酸，其在Genbank 中的收錄號為XP—001387287 ， ( http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db=protein&id=
126273732)，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。編碼該蛋白的基因含有849bp堿 基，其在Genbank中的收錄號為XM—001387250， (http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ viewer.fcgi val= XM—001387250.1),其基因序列如SEQ ID NO: 1所示。至今未發現該 羰酰還原酶用于COBE不對稱還原制備(S)-CHBE的報道。參考文獻
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發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種羰酰還原酶在COBE不對稱還原制備 (S)-CHBE中的應用。
為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下
一種氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示的羰酰還原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE) 不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯((S)-CHBE)中的應用。
即以氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示的羰酰還原酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙 酯為底物，以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸磷酸(還原型輔酶II， NADPH)為輔因 子，不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
具體反應是將表達基因序列如SEQ ID NO: 1所示的重組菌，經過破碎后與 200mmol/L~2mol/L葡萄糖、1.5~300g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、50U 5KU的葡萄糖脫氫 酶(glucose dehydrogenase, GDH)和0.05 0.5mmol/L的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸 磷酸(氧化型輔酶II ， NADP)，在pH6.0~7.5、 20~30°C、 180~280rpm條件下反應16~32h， 得到(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。其中，加入NADP與GDH即生成NADPH，且使反應循 環進行，降低了加入量以減少了生產成本。
發明人基于現代生物信息學思想，結合分子生物學技術，采用基因工程的手段從畢 赤酵母戶/cA&S/^z'他CBS 6054克隆羰酰還原酶的基因，在大腸桿菌中表達后發現其在 水相中能夠高效的催化COBE為(S)-CHBE， e.e值為100%。同時，通過在水/有機相中 反應、分批添加底物COBE等方式，解除了底物和產物對細胞和酶的抑制作用，顯著的 提高了轉化效果。通過對羰酰還原酶的基因進行重組表達，獲得了具有新型催化功能的 酶蛋白，開發了該條基因的新功能——催化非天然底物COBE為高立體選擇性的 (S)-CHBE。
有益效果本發明首次將氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示的羰酰還原酶應用于 COBE不對稱還原制備(S)-CHBE中，取得很好的效果，其酶活高達32U/mg，而Yasohara 從木蘭假絲酵母菌Om^fo wflgno^e中分離得到的羰基還原酶，其酶活只有 13.7U/mg[6]。氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的羰酰還原酶對底物COBE的得率高(大 于95%)、產物CHBE的光學活性高(e.e。/。為100%)，且產量高，大大降低了生產成本。
圖l為羰酰還原酶基因的構建圖。
具體實施例方式
根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會
限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
實施例.l:重組大腸桿菌Eco/iRosseta (pET22b-PsCR)的構建
1、 羰酰還原酶基因的獲取
畢赤酵母尸/c/H'fl S印/泡CBS 6054 (購于Centraalbureau voor Schi腿elcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre),培養基YPD (g七")酵母提取物10g，蛋白胨20g，葡萄 糖20g,補蒸餾水至1L。
將畢赤酵母i>/c/ 'a CBS 6054接種于5mLYPD液體培養基中30'C培養至對數
生長期，使用基因組DNA提取試劑盒(北京天為生物工程有限公司酵母基因組提取試 劑盒)提取基因組。
構建表達載體所用的引物加設酶切位點，引物序列如下
上游引物(CR-sense含Nde I)為5' GGAATTCCATATGACCAACAACCCGAGCAT 下游引物(CR-anti含BamHI)為CGCGGATCCCTATGGCGCACAGTAGCCTCC
所有引物均由上海申能博彩公司合成。
基因的PCR條件
94 。C變性7 min，按如下參數循環30次94 'C變性1 min， 60 。C退火50 s， 72 °C 延伸1.5 min。最后72 。C延伸10 min。
2、 基因的表達
用Nde I及BamH I分別酶切pET-22b (pET-22b購于Novagen(默克中國))及所擴 增含有兩個酶切位點的目的基因，分別膠回收已雙酶切的目的片段和表達載體，將已雙 酶切的表達載體pET-22b與目的基因用T4連接酶進行連接過夜，將10uL的連接產物 pET-22b-PsCR加入100uL的Rosetta(DE3)感受態細胞中，冰上放置30min， 42。C熱激 90sec。冰上放置2min。加入預熱的0.45mL培養基。220rpm 37°C lh。將200uL菌液加 入分別含有100ug/mL的氨芐青霉素和氯霉素的LB平板上，37'C過夜培養12—16h。 構建圖譜見圖1。
3、 酶活的測定
挑取重組菌五.co/z'Rosseta (pET-22b-PsCR)及出發大腸桿菌Rosseta (DE3)至含抗 生素的LB液體培養基中，37'C振蕩培養過夜。然后按2 %接種量分別接種到新鮮培養 液中，37 。C培養至OD6oo約為0.6時，加入IPTG至終濃度0.8 mmol'L/1， 25°C， 220rpm， 誘導表達10h后，離心(4。C， 5000rpm， 15min)，菌泥用100mM磷酸鉀緩沖(pH7.0)重
懸，超聲破碎細胞(功率300W，超聲5s，間歇5s，共5min)，離心(4。C， 12000rpm， 15min)，
測定上清中的酶活。
酶反應體系包括lOOmM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)， 5mMNADPH， 20mM COBE， 30'C， 340nm處測定吸光值的下降。酶活定義為每分鐘內氧化ltimolNADPH所需要的酶量為 一個酶活單位u。蛋白采用Brandford法進行測定。
結果顯示，出發大腸桿菌Rosseta (DE3)的比酶活為0.12U/mg，而重組菌E.coli Rosseta (pET22b-PsCR)的比酶活為32U/mg，高于能夠催化該底物COBE為(S)-CHBE 的羰基還原酶的最高報道(Sl的比酶活為13.7U/mg[6])。
實施例2:重組大腸桿菌￡.co//Rosseta (pET22b-PsCR)的發酵
挑取重組菌￡.co//Rosseta (pET-22b-PsCR)至含抗生素的LB培養液，37。C振蕩培 養過夜。然后按2%接種量分別接種到新鮮培養液中，37t)培養至OD6()()約為0.6時， 加入1 10至終濃度0.811111101.1/1， 25°C， 220rpm，誘導表達10h后，8000 rpm， 4 。C離 心10min，棄上清，沉淀備用。
實施例3:
取實施例2的沉淀用磷酸鉀緩沖(100 mmol丄-l ， pH 6.5)洗滌兩次，稱取0.5g (濕 重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于15 mL的pH 6.5磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W, 超聲5s，間歇5s，共5min)，加入葡萄糖200讓ol/L， COBE 1.5g/L， GDH 50U， NADP 0.05mmol/L， 20°C, 180rpm， 16h。產物(S)-CHBE的產量為1.45g/L，產物的得率為 96.7% ，光學純度e.e。/o為100% 。
產物的檢測方法如下(以下實施例中產物的檢測方法與實施例3相同) 對于水相反應反應結束后，加入等體積乙酸乙酯，劇烈振蕩10min然后放置兩 小時，8000rpm離心10min分離有機層和水層。小心吸取上層乙酸乙酯過有機膜，力口 入內標，保存測樣。
對于水/有機兩相反應反應結束后8000rpm離心10min分離有機層和水層。小心 吸取上層乙酸乙酯過有機膜，加入內標，保存測樣。
PEG-20M毛細管柱，內標物為萘。程序為檢測器FID，溫度210'C，汽化室溫度 210°C，柱溫150。C，柱頭壓0.03MPa，氫氣0.05MPa，空氣O.lMPaJl吹0.08MPa。用 HPLC對(S)- 4-氯-3-羥基丁酸乙酯的旋光性進行分析(手性柱Chiralcel OB，4.6x250mm; Daicel Chemical Industries,日本)，檢測條件流動相為正己烷正己烷(9:1),波長214nm， 流量為0.8mL/min， ，R型和S型CHBE的出峰時間分別為10.5min和11.6min。
實施例4:
取實施例2的沉淀用磷酸鉀緩沖(100 mmol丄-l， pH 7.5)洗滌兩次，稱取lg (濕重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于15 mL的pH 7.5磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W， 超聲5s，間歇5s，共5min)，加入葡萄糖50O腿ol/L， COBE 25g/L(0、 1、 2、 8、 14h 各5g/L )， GDH200U， NADP 0.1腿ol/L， 25°C， 220rpm， 24h。產物(S)隱CHBE的產量 為24.1g/L，產物的得率為96.4%，光學純度e.ey。為100%。
實施例5:
取實施例2的沉淀用磷酸鉀緩沖(IOO mmol七-l， pH 7.0)洗滌兩次，稱取2g (濕重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于50mL的pH 7.0磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W， 超聲5s'，間歇5s，共5min)，加入葡萄糖600mmol/L， COBE 35g/L(0、 1、 2、 8、 14h 各7g/L )， GDH500U， NADP 0.15腿ol/L， 30。C， 240rpm， 28h。產物(S)-CHBE的產 量為33.5g/L,產物的得率為95.7%，光學純度e.e。/。為100% 。
實施例6:
取實施例2的沉淀用磷酸鉀緩沖(IOO mmol七-l， pH 6.0)洗漆兩次，稱取4g (濕重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于50 mL的pH 6.0磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W， 超聲5s，間歇5s，共5min)，加入葡萄糖1.5mol/L， 50mL乙酸正丁酯(可促進COBE 的溶解并解除底物和產物對酶和細胞的抑制作用)，加入COBE 100g/L(0、 2、 4、 6、 10 各20g/L )， GDH3KU， NADP 0.3mmol/L， 2(TC, 240rpm， 28h。產物(S)-CHBE的產量 為97.1g/L，產物的得率為97.1%，光學純度e.e。/。為100%。
實施例7:
取實施例2的沉淀用磷酸鉀緩沖(IOO mmol七-l， pH 6.5)洗滌兩次，稱取2g (濕重) 的大腸桿菌菌泥，懸浮于15 mL的pH 6.5磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W， 超聲5s，間歇5s，共5min)，加入15mL乙酸正丁酯(可促進COBE的溶解并解除底物 和產物對酶和細胞的抑制作用)，加入葡萄糖lmol/L, COBE 50g/L(0、 2、 4、 6、 10各 10g/L )， GDH2KU， NADP 0.2mmol/L， 20°C， 240rpm， 28h。產物(S)-CHBE的產量為 47.6g/L，產物的得率為95.2%,光學純度e.e。/c為100% 。
實施例8:
取實施例2的沉淀用磷酸鉀緩沖(IOO mmol七-l， pH 6.5)洗漆兩次，稱取10g (濕
重)的大腸桿菌菌泥，懸浮于200 mL的pH 6.5磷酸鉀緩沖中。超聲處理細胞(功率300W, 超聲5s，間歇5s，共5min)，加入200mL乙酸正丁酯(可促進COBE的溶解并解除底 物和產物對酶和細胞的抑制作用)，加入葡萄糖2mol/L， COBE 300g/L(0、 2、 4、 6、 10 各60g/L )， GDH5KU， NADP 0.5腿ol/L， 25°C， 280rpm， 32h。產物(S)-CHBE的產量 為288.7g/L，產物的得率為96.2%，光學純度e.e。/。為100% 。序 列 表
<110>南京工業大學
<120> —種羰酰還原酶在生產(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應用
<130> njut080822
<160> 2
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 849
<212> DNA
<213>畢赤酵母(PichiastipitisCBS6054)
<220>
<221> CDS <222> (1)..(849)
<400> 1
atg acc aac aac ccg agc atc acc tct cat ate aac get gcc gtg ggt 48 Met Thr Asn Asn Pro Ser lie Thr Ser His lie Asn Ala Ala Val Gly 15 10 15
cct etc cct act aag get ccc aaa ctt gcg tct aac gtg ttg gat tta 96 Pro Leu Pro Thr Lys Ala Pro Lys Leu Ala Ser Asn Val Leu Asp Leu 20 25 30
ttt tct etc aag ggt aag gta get tec att act ggc tct tea gcc ggg 144 Phe Ser Leu Lys Gly Lys VaJ Ala Ser lie Thr Gly Ser Ser Ala Gly 35 40 45
ata ggt ctt get gta gcc gag gca tac get ca_g get ggt get gat gtt 192 lie Gly Leu Ala Val Ala Glu Ala Tyr Ala Gin Ala Gly Ala Asp Val 50 55 60
gca ate tgg tac aac tec cag cct get aag gaa aag gcc gac aag ata 240 Ala lie Trp Tyr Asn Ser Gin Pro Ala Lys Glu Lys Ala Asp Lys lie 65 70 75 80
gcc aag acg tat ggt gta cgt tgc aga get tat aag tgt aat gtt tea 288 Ala Lys Thr Tyr Gly Val Arg Cys Arg Ala Tyr Lys Cys Asn Val Ser 85 90 95
gat cag cag gat gtt gaa acc act gtg get cag ate gag get gac ttt 336 Asp Gin Gin Asp Val Glu Thr Thr Val Ala Gin lie Glu Ala Asp Phe 100 105 110
ggc acc ata gat ate ttt gtt gcc aat gcc ggt gtt ccc tgg act gaa 384 Gly Thr lie Asp lie Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Pro Trp Thr Glu 115 120 125
ggc gaa agt gta gaa att gac aac ttt gac tec tgg aaa aag gtc ata 432 Gly Glu Ser Val Glu lie Asp Asn Phe Asp Ser Trp Lys Lys Val lie 130 135 140
gac tta gac ttg tct ggg get tac tac tgt gca cat gcg get ggt aag 480 Asp Leu Asp Leu Ser Gly Ala Tyr Tyr Cys Ala His Ala Ala Gly Lys 145 150 155 160
ate ttt aag aaa aac ggc aag ggc tec atg att ttc acc get tct atg 528 lie Phe Lys Lys Asn Gly Lys Gly Ser Met lie Phe Thr Ala Ser Met 165 170 175
tct ggt cac att gtg aat att cct caa ttc cag get cct tac aac get 576 Ser Gly His lie Val Asn lie Pro Gin Phe Gin Ala Pro Tyr Asn Ala 180 185 190
gcc aag get gcg gtg ttg cac ttg age aaa teg ttg get ata gaa tgg 624 Ala Lys Ala Ala Val Leu His Leu Ser Lys Ser Leu Ala lie Glu Trp 195 200 205
get cct ttt gcc aga gtc aat acg att teg cca gga tac att gtc acc 672 Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Thr lie Ser Pro Gly Tyr lie Val Thr 210 215 220
gag ate teg gac ttt gtc tea gac gac ate aag tec aag tgg tgg cag 720 Glu lie Ser Asp Phe Val Ser Asp Asp lie Lys Ser Lys Trp Trp Gin 225 230 235 240
ttt att cct ctt ggt aga gag gga gtc aca caa gag ttg gtt ggt gcc 768 Phe lie Pro Leu Gly Arg Glu Gly Val Thr Gin Glu Leu Val Gly Ala 245 250 255
tac ttg tac ttt get tct gat gcc tct aca tat act acg gga tea gat 816 Tyr Leu Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ser Asp 260 265 270
ctt ate gtc gat gga ggc tac tgt gcg cca tag 849 Leu lie Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ala Pro 275 280
<210> 2 <211> 282 <212> PRT
<213> 畢赤酵母(Pichia stipitis CBS 6054) <400> 2
Met Thr Asn Asn Pro Ser lie Thr Ser His lie Asn Ala Ala Val Gly 15 10 15
Pro Leu Pro Thr Lys Ala Pro Lys Leu Ala Ser Asn Val Leu Asp Leu 20 25 30
Phe Ser Leu Lys Gly Lys Val Ala Ser lie Thr Gly Ser Ser Ala Gly 35 40 45
lie Gly Leu Ala Val Ala Glu Ala Tyr Ala Gin Ala Gly Ala Asp Val 50 55 60
Ala lie Trp Tyr Asn Ser Gin Pro Ala Lys Glu Lys Ala Asp Lys lie 65 70 75 80
Ala Lys Thr Tyr Gly Val Arg Cys Arg Ala Tyr Lys Cys Asn Val Ser 85 90 95
Asp Gin Gin Asp Val Glu Thr Thr Val Ala Gin lie Glu Ala Asp Phe 100 105 110
Gly Thr lie Asp lie Phe Val Ala Asn Ala Gly Val Pro Trp Thr Glu 115 120 125
Gly Glu Ser Val Glu lie Asp Asn Phe Asp Ser Trp Lys Lys Val lie 130 135 140
Asp Leu Asp Leu Ser Gly Ala Tyr Tyr Cys Ala His Ala Ala Gly Lys 145 150 155 160
lie Phe Lys Lys Asn Gly Lys Gly Ser Met lie Phe Thr Ala Ser Met 165 170 175
Ser Gly His lie Val Asn lie Pro Gin Phe Gin Ala Pro Tyr Asn Ala 180 185 190
Ala Lys Ala Ala Val Leu His Leu Ser Lys Ser Leu Ala lie Glu Trp 195 200 205
Ala Pro Phe Ala Arg Val Asn Thr lie Ser Pro Gly Tyr lie Val Thr 210 215 220Glu lie Ser Asp Phe Val Ser Asp Asp lie Lys Ser Lys Trp Trp Gin 225 230 235 240
Phe lie Pro Leu Gly Arg Glu Gly Val Thr Gin Glu Leu Val Gly Ala 245 250 255
Tyr Leu Tyr Phe Ala Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ser Asp 260 265 270
Leu lie Val Asp Gly Gly Tyr Cys Ala Pro 275 280
權利要求
1.一種氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰還原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應用。
2、 根據權利要求l所述的應用，其特征在于以氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示 的羰酰還原酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以NADPH為輔因子，不對稱還 原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
3、 根據權利要求2所述的應用，其特征在于表達基因序列如SEQ ID NO: 1所示 的重組菌，經過破碎后與200mmol/L~2mol/L葡萄糖、1.5~300g/L的4-氯乙酰乙酸乙酯、 50U~5KU的葡萄糖脫氫酶和0.05~0.5mmol/L的NADP，在pH6.0 7.5、 20~30°C、 180~280rpm條件下反應16~32h，得到(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
全文摘要
本發明公開了一種氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰還原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應用。即以氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰還原酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，以NADPH為輔因子，不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。本發明首次將氨基酸序列如SEQ ID NO2所示的羰酰還原酶應用于4-氯乙酰乙酸乙酯不對稱還原制備(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中，取得很好的效果，其對底物的得率高達95％、產物的對映體過量值為100％，且產量高，大大降低了生產成本。
文檔編號C12N9/02GK101372699SQ20081012475
公開日2009年2月25日 申請日期2008年9月2日 優先權日2008年9月2日
發明者明 嚴, 齊 葉, 應漢杰, 李振江, 柏建新, 健 熊, 琳 許, 勇 陳 申請人:南京工業大學