專利名稱：金耳與粗毛韌革菌的its區(qū)序列及用其鑒定金耳的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌品種的DNA序列及利用該序列鑒定其品種的方法，更具體地說(shuō)， 本發(fā)明涉及真菌金耳的ITS區(qū)序列及利用該序列鑒定其品種的方法，屬于分子生物學(xué)方法鑒定 真菌品種和檢測(cè)真菌純度技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金耳7>"eme//flflwm"ft'fl/6aBandoni et Zang是銀耳屬的一種珍貴食藥用真菌，營(yíng)養(yǎng)成分豐 富，可提供多種氨基酸、多種維生素和人體必需的礦質(zhì)元素，是一種良好的生物營(yíng)養(yǎng)資源。 金耳藥用歷史悠久，在《名醫(yī)別錄》和《本草綱目》中對(duì)其形態(tài)、藥用部位及性味功能有詳 細(xì)描述?！吨袊?guó)藥用真菌》(參考文獻(xiàn)劉波.中國(guó)藥用真菌.太原:山西人民出版社.1984,37-42)述其主 治肺熱、痰多、感冒咳嗽、氣喘、高血壓等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明金耳富含水溶性多糖，連 續(xù)服用金耳子實(shí)體能化痰止咳并對(duì)四氧嘧啶所致糖尿病大鼠高血糖模型具有顯著的降糖作 用，金耳子實(shí)體多糖也能明顯降低正常小鼠及鏈脲霉素致高血糖小鼠血糖和血漿膽固醇水平， 金耳子實(shí)體也有較強(qiáng)的平喘作用。
金耳的野生資源稀有，但商品需求量較大。市售的金耳來(lái)源復(fù)雜，涉及金黃銀耳7Ve/ne/Za awn2"rifli Schw. ex Fr.、腦狀銀耳7>e/we//a g"ce/ /w/a、黃金銀耳或橙黃銀耳7>"e7ne//a wewWencfl Retz ex Fr.或rrewe//a /wfesce/w Fr.等顏色和外形近似的種，甚至有人工染色后的 銀耳直接冒充金耳，直接影響到金耳的臨床療效和消費(fèi)者的利益?，F(xiàn)行的金耳鑒定方法包括 性狀鑒定和微觀解剖，但這些方法仍未對(duì)金耳品種作出全面客觀的鑒定。
真菌核糖體DNA區(qū)段含有多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，每個(gè)重復(fù)序列包含18S、 5.8S、 28SrRNA 基因及其間隔區(qū)域。其中內(nèi)部間隔區(qū)ITS區(qū)(含5.8S)將18S和28SrRNA基因分隔開(kāi)。不同種 的ITS區(qū)序列是不相同的，如果能對(duì)金耳的子實(shí)體的ITS區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序，獲得其完整的ITS 區(qū)序列，就可通過(guò)對(duì)比其ITS區(qū)序列來(lái)鑒定金耳品種。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有金耳鑒定技術(shù)存在的不足與問(wèn)題，提供一種基于核基因組ITS 區(qū)序列分析的金耳真菌品種的分子鑒定方法，用特定的DNA序列進(jìn)行金耳真菌鑒定，保證了 金耳品種及金耳和粗毛韌革菌菌種的鑒定更可靠、正確。
為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明人從金耳主產(chǎn)區(qū)采集了數(shù)個(gè)金耳樣品，所有金耳樣品均經(jīng) 過(guò)真菌分類專家鑒定。所測(cè)的金耳樣品和組成金耳子實(shí)體的寄主真菌粗毛韌革菌(Stereww / >^/"加(Willd.)Fr.)的ITS區(qū)序列見(jiàn)序列表，以測(cè)得的序列作為金耳的ITS區(qū)序列，金耳的
ITS區(qū)序列長(zhǎng)度為467bp，如SEQ ID NO.l所示；寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列長(zhǎng)度為 548bp，如SEQ ID N0.2所示。金耳ITS區(qū)G+C含量為45%，寄主真菌粗毛韌革菌ITS區(qū)G+C 含量為48%。
上述金耳樣品的ITS區(qū)序列的測(cè)定方法包括下列步驟首先建立了一套金耳高質(zhì)量DNA 的制備方法，然后對(duì)它的ITS區(qū)序列進(jìn)行測(cè)序，建立了ITS區(qū)序列，每個(gè)樣品至少重復(fù)測(cè)序 5次，每個(gè)樣品的序列也在互聯(lián)網(wǎng)上的GenBank中與其他銀耳屬的品種作比較和驗(yàn)證，以保 證本發(fā)明的序列準(zhǔn)確性，再在此基礎(chǔ)上對(duì)待鑒定真菌的ITS區(qū)序列測(cè)序后通過(guò)比對(duì)序列差異 進(jìn)行品種鑒定。
本發(fā)明中利用ITS區(qū)序列鑒定金耳品種所采用的步驟如下
(1) 取待鑒定真菌子實(shí)體或菌種，消毒處理后，研磨成粉末，用DNA提取試劑盒或氯化節(jié)試 劑提取方法提取總DNA;
(2) 以提取得到的DNA樣品為模板，用針對(duì)金耳ITS區(qū)的專用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增 得到待鑒定真菌的ITS片段產(chǎn)物，擴(kuò)增的正向引物P1為5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，， 位于18S上；反向引物P2為5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',位于28S上，在50PL的 體系中完成擴(kuò)增反應(yīng)，以雙蒸水代替模板DNA作空白對(duì)照；
(3) 將擴(kuò)增反應(yīng)得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化；
(4) 將純化后的ITS區(qū)產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，得到待鑒定真菌樣品的ITS區(qū)序列，其中測(cè)序引物 為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所用引物；
(5) 將步驟(4)得到的序列與SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列分別進(jìn)行比較，其中 步驟(4)得到的ITS區(qū)序列與SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列都吻合則判斷為金耳品種。
本發(fā)明中還利用ITS區(qū)序列鑒定金耳菌種或粗毛韌革菌菌種所采用的步驟如下
(1) 從待鑒定真菌樣品中提取基因組DNA;
(2) 以步驟(1)提取得到的DNA樣品為模板，用針對(duì)金耳ITS區(qū)的專用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)擴(kuò)增得到待鑒定真菌的ITS片段產(chǎn)物，擴(kuò)增的正向引物P1為 5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；
反向引物P2為5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，位于28S上，在50^L的體系中完成擴(kuò) 增反應(yīng)，以雙蒸水代替模板DNA作空白對(duì)照；
(3) 將步驟(2)擴(kuò)增反應(yīng)得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化；
(4) 將步驟(3)純化后的ITS區(qū)產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，得到待鑒定真菌樣品的ITS區(qū)序列；
(5) 將步驟(4)得到的序列與SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列分別進(jìn)行比較，其中 若步驟(4)得到的ITS區(qū)序列僅與SEQIDNO.l序列吻合則判斷為金耳菌種； 若步驟(4)得到的ITS區(qū)序列僅與SEQIDN0.2序列吻合則判斷為粗毛韌革菌菌種。
上述鑒定方法中，待鑒定品種的基因組DNA提取采用氯化節(jié)提取純化的方法，其步驟為 取菌體材料加入無(wú)菌研缽中，同時(shí)加入用pH9.0的0.15 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液7mL與 pH為8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至lOOmL配制而成的提取緩沖液， 迅速?gòu)氐籽心セ靹?，取研磨后的液體加入無(wú)菌離心管中，再依次加入質(zhì)量百分濃度為10%的 十二烷基磺酸鈉溶液和氯化芐試劑，混勻，50 'C水浴處理，加入等體積的pH為5.2的3mol/L 醋酸鈉溶液混勻，冰水浴處理，離心取上清，加入等體積的無(wú)水乙醇析出DNA沉淀，離心 棄去無(wú)水乙醇，加入70-75%的乙醇洗滌沉淀，離心棄去乙醇，揮干乙醇后用無(wú)菌水溶解，瓊 脂糖凝膠電泳分析得到基因組DNA樣品。
上述方法步驟(2)中所述的針對(duì)金耳ITS區(qū)的專用引物為寡核苷酸，所述的ITS片段聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)條件如下聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的50pL反應(yīng)液含DNA模板l-5xl0力g,兩 個(gè)2xl(T5 mol/L引物各lpL， 10xbuffer緩沖液(pH 8.3) 5 ^L，四種0.01 mol/L單核苷酸4pL， 5U/nLDNA聚合酶0.25pL;更進(jìn)一步說(shuō)，其所述的ITS片段聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)循環(huán)參 數(shù)為94'C預(yù)變性5分鐘，然后按94'C變性1分鐘，52-57'C退火45秒鐘，72'C延伸1分鐘， 循環(huán)30次，最后在72t:延伸5分鐘，在4。C終止反應(yīng)。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比還具有以下有益效果
1、 本發(fā)明首先建立了一套快速、可靠的金耳高質(zhì)量基因組DNA的制備方法。
2、 本發(fā)明對(duì)食藥用真菌金耳和寄主真菌粗毛韌革菌的核基因組ITS區(qū)序列進(jìn)行了測(cè)序， 獲得了ITS區(qū)的全部序列，運(yùn)用它們可以準(zhǔn)確地判定待鑒定真菌的真?zhèn)?，也可以?duì)人工培養(yǎng) 的金耳酵母狀孢子菌種和寄主真菌粗毛韌革菌菌種進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。本發(fā)明對(duì)于食藥用真菌 生產(chǎn)、銷售部門快速準(zhǔn)確地鑒定金耳子實(shí)體和人工培養(yǎng)的菌種，搞好質(zhì)量控制，是十分必要 的，對(duì)于各地質(zhì)檢部門打擊假冒偽劣，凈化市場(chǎng)具有十分重要的價(jià)值。
3、 本發(fā)明抓住金耳遺傳關(guān)系確立和品種純度檢驗(yàn)這兩個(gè)學(xué)術(shù)和生產(chǎn)上的關(guān)鍵問(wèn)題，建立 了有效的技術(shù)方法。發(fā)明人采集了數(shù)個(gè)金耳真菌子實(shí)體，分析結(jié)果顯示，金耳子實(shí)體中的兩 種ITS區(qū)序列(含5.8S序列)的長(zhǎng)度分別為467bp、 548bp，組成金耳子實(shí)體的兩種ITS區(qū)序 列的長(zhǎng)度和G+C含量存在明顯差異，為同一子實(shí)體中存在的兩個(gè)不同的物種，與金耳子實(shí)體 中有寄主真菌菌絲存在的形態(tài)解剖特征吻合。本發(fā)明的鑒定方法可以直接測(cè)定金耳品種或菌 種的ITS區(qū)序列，準(zhǔn)確區(qū)分和判別金耳品種或菌種的真實(shí)性和純度，為品種鑒定、保護(hù)、菌 種質(zhì)量控制及有效菌種繁育提供可靠技術(shù)。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1利用金耳7>^脂//" awra""fl/6a Bandoni et Zang的ITS區(qū)序列鑒定金耳子實(shí)體品種
(1) 取外形似金耳的真菌子實(shí)體，提取子實(shí)體的基因組DNA，具體方法如下 無(wú)菌收集消毒待鑒定子實(shí)體O.lg置于已滅菌的研缽中，加0.5-1 mL提取緩沖液，此提
取緩沖液為pH9.0的0.15 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液7mL與pH為8.0的0.05 mol/L乙二胺四 乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至100mL配制而成，研磨混勻；將勻漿后的液體移入無(wú)菌離心 管中，加入0.1-0.2 mL質(zhì)量百分濃度為10%的十二烷基磺酸鈉溶液和0.3-0.6 mL氯化芐試齊U， 充分混勻，50 。C保溫1-2小時(shí)；加入0.3 mL3 mol/LNaOAc (pH 5.2)混勻，冰水浴15-20 min， 6000 r/min室溫離心15-20 min;取上清加等體積無(wú)水乙醇室溫沉淀20-50 min，去上清，10000 r/min室溫離心15 min，沉淀用70%乙醇洗一次，風(fēng)干水溶，4。C保存；1.5%瓊脂糖凝膠電 泳(100V電壓下電泳30min)檢測(cè)純度和分子量范圍；提取過(guò)程中均以無(wú)菌水作空白提取對(duì) 照，所有的提取對(duì)照在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中作為陰性對(duì)照的模板，以防止提取和擴(kuò)增過(guò)程 中外源DNA的污染。如用DNA提取試劑盒提取DNA，按試劑盒的操作指南進(jìn)行。
(2) 以提取得到的待鑒定真菌子實(shí)體的基因組DNA樣品為模板，用針對(duì)金耳ITS區(qū)的專用引 物分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到待鑒定真菌子實(shí)體的ITS片段產(chǎn)物，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝 膠電泳，得到了堿基數(shù)分別為500bp和700bp的兩個(gè)條帶；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具體步驟如下
以待鑒定真菌子實(shí)體的基因組DNA分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；以寡核 苷酸作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物，擴(kuò)增ITS區(qū)序列；擴(kuò)增的正向引物P1為 5'陽(yáng)CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3'，位于18S上；反向引物P2為
5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，位于28S上，在50PL的體系中完成擴(kuò)增反應(yīng)，以雙蒸 水代替模板DNA作空白對(duì)照；
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用50pL反應(yīng)體系DNA模板l-5xl(T9g,兩個(gè)2xl(T5 mol/L引物各1 pL， 10xbuffer緩沖液(pH8.3) 5 ^L,四種0.01 mol/L單核苷酸4pL， 5U4iLDNA聚合酶 0.25 ^L，無(wú)菌雙蒸水定容至50 ^L，加好后上蓋石蠟油25
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性5分鐘，然后按94'C變性1分鐘,52-57'C退 火45秒鐘，72°C延伸1分鐘，循環(huán)30次，最后在72'C延伸5分鐘，在4'C終止反應(yīng)；Agrose 瓊脂糖凝膠電泳檢査產(chǎn)物(Marker分子量范圍100-1200 bp)。
(3) 對(duì)每一個(gè)條凝膠電泳條帶進(jìn)行割膠回收純化，每樣平行重復(fù)3次，另設(shè)空白對(duì)照組。
(4) 純化后的ITS區(qū)產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序反應(yīng)后直接進(jìn)行測(cè)序，其中所有序列至少經(jīng)過(guò)正反兩次重復(fù) 測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)序以保證序列的準(zhǔn)確性，包括ITS區(qū)(含5.8S區(qū))的全序列，其中 測(cè)序引物為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所用引物，測(cè)序正向引物P1為
5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，；反向引物P2為5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC國(guó)3，。
(5) 將得到的待鑒定的真菌子實(shí)體品種的兩個(gè)ITS區(qū)序列分別輸入計(jì)算機(jī)后，用DNAStar軟 件包中的Editseq和Seqman進(jìn)行編輯，用Megalign中Clustal W方法，分別與已經(jīng)確定的序 列表中的兩種ITS區(qū)序列進(jìn)行比較判定，用MEGA軟件計(jì)算序列的堿基組成和兩序列間的轉(zhuǎn) 換/顛換比值，統(tǒng)計(jì)和分析序列的差異，用PAUP軟件的PTPtest進(jìn)行序列信息檢驗(yàn)。
(6) 經(jīng)上述步驟(5)的DNA數(shù)據(jù)分析，各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果如下
a、 其中一個(gè)ITS區(qū)序列與本發(fā)明序列表中金耳的ITS區(qū)序列(SEQIDNO.l)的堿基差異為 0;另外一個(gè)ITS區(qū)序列與寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列(SEQ IDN0.2)的堿基差異為0;
b、 其中一個(gè)ITS區(qū)序列與本發(fā)明序列表中金耳的ITS區(qū)序列的轉(zhuǎn)換/顛換比值相等另外一 個(gè)ITS區(qū)序列與寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列的轉(zhuǎn)換/顛換比值相等；
c、 其中一個(gè)ITS區(qū)序列與本發(fā)明序列表中金耳的ITS區(qū)序列的相對(duì)遺傳距離為0°/。；另外一 個(gè)ITS區(qū)序列與寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列的相對(duì)遺傳距離為0%;
d、 在NJ聚類樹(shù)上，待鑒定真菌的兩個(gè)序列分別與金耳和寄主真菌粗毛韌革菌聚在各自的分 支上，置信度為100%。
判定待鑒定真菌子實(shí)體為金耳7>vwe//a咖ra"rifl/6fl Bandoni et Zang子實(shí)體品種。 需要說(shuō)明的是，步驟(5)除了使用軟件進(jìn)行比較外，通過(guò)人工比對(duì)也可，須得出同樣的結(jié)論。
實(shí)施例2利用金耳rreme〃ar "wra"r/a/&a Bandoni et Zang的ITS區(qū)序列鑒定金耳菌種
CGMCC0179
(1) 提取現(xiàn)有待鑒定孢子菌種CGMCC0179 (中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心)的基因組 DNA，具體方法如下
無(wú)菌收集人工培養(yǎng)的待鑒定孢子菌種的培養(yǎng)3天的菌體0.1 g置于已滅菌的研缽中，力口 0.5-1 mL提取緩沖液，提取緩沖液為pH9.0的0.15 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液7mL與pH為 8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至lOOmL配制而成，研磨混勻；將勾 漿后的液體移入無(wú)菌離心管中，力口入0.1-0.2 mL質(zhì)量百分濃度為10%的十二垸基磺酸鈉溶液 和0.3-0.6 mL氯化節(jié)試劑，充分混勻，50 'C保溫1-2小時(shí)；加入0.3 mL 3 mol/L NaOAc(pH 5.2) 混勻，冰水浴15-20 min， 6000 r/min室溫離心15-20 min;取上清加等體積無(wú)水乙醇室溫沉淀 20-50 min，去上清，10000 r/min室溫離心15 min，沉淀用70%乙醇洗一次，風(fēng)干水溶，4°C 保存；1.5%瓊脂糖凝膠電泳(100V電壓下電泳30min)檢測(cè)純度和分子量范圍；提取過(guò)程 中均以無(wú)菌水作空白提取對(duì)照，所有的提取對(duì)照在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中作為空白對(duì)照的模 板，以防止提取和擴(kuò)增過(guò)程中外源DNA的污染。如用DNA提取試劑盒提取DNA，按試劑 盒的操作指南進(jìn)行。
(2) 以提取得到的待鑒定菌種的基因組DNA樣品為模板，用針對(duì)金耳ITS區(qū)的專用引物進(jìn)行 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到ITS片段產(chǎn)物，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到了一個(gè)堿基數(shù)約為 500bp的條帶；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具體步驟如下
以所提取材料的基因組DNA分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物以寡核苷酸作 為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物，擴(kuò)增ITS區(qū)段，所用的引物分別位于18S和28S的保守區(qū)段；
采用雙向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增ITS區(qū)的整個(gè)片段,擴(kuò)增的正向引物Pl為
5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；反向引物P2為 5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，位于28S上；
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系(50nL): DNA模板l-5xl(T9g,兩個(gè)2xl(T5 mol/L引物各1 ^L， 10xbuffer緩沖液(pH 8.3) 5 ^L，四種0.01 mol/L單核苷酸4pL， 5 U/pLDNA聚合酶0.25 ^L， 無(wú)菌雙蒸水定容至50nL，加好后上蓋石蠟油25pL;
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)條件94'C預(yù)變性5分鐘，然后按94'C變性1分鐘,52-57'C退火 45秒鐘，72'C延伸1分鐘，循環(huán)30次，最后在72。C延伸5分鐘，在4'C終止反應(yīng)；Agrose瓊 脂糖凝膠電泳檢査產(chǎn)物(Marker分子量范圍100-1200 bp)。
(3) 對(duì)得到的凝膠電泳條帶進(jìn)行割膠回收純化，每樣平行重復(fù)3次，另設(shè)空白對(duì)照組。
(4) 純化后的ITS區(qū)產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序反應(yīng)后直接進(jìn)行測(cè)序，其中所有序列至少經(jīng)過(guò)正反兩次重復(fù) 測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)序以保證序列的準(zhǔn)確性，包括ITS區(qū)(含5.8S區(qū))的全序列，其中 測(cè)序引物為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所用引物，測(cè)序正向引物P1為
5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，；反向引物P2為5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，。
(5) 將得到的待鑒定菌種的ITS區(qū)序列輸入計(jì)算機(jī)后，用DNAStar軟件包中的Editseq和 Seqman進(jìn)行編輯，用Megalign中Clustal W方法，與已經(jīng)確定的序列表中的金耳ITS區(qū)序列進(jìn) 行比較判定，用MEGA軟件計(jì)算序列的堿基組成和兩序列間的轉(zhuǎn)換/顛換比值，統(tǒng)計(jì)和分析序 列的差異。用PAUP軟件的PTP test進(jìn)行序列信息檢驗(yàn)。
(6) 經(jīng)上述步驟(5)的DNA數(shù)據(jù)分析，各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果如下
a、 待鑒定菌種的ITS區(qū)序列與本發(fā)明的序列表中金耳的ITS區(qū)序列的堿基差異為0;
b、 待鑒定菌種的ITS區(qū)序列與本發(fā)明的序列表中金耳的ITS區(qū)序列的轉(zhuǎn)換/顛換比值相等；
c、 待鑒定菌種的ITS區(qū)序列與本發(fā)明的序列表中金耳的ITS區(qū)序列的相對(duì)遺傳距離為0%; 判定待鑒定真菌菌種CGMCC0179為金耳r^we//a做ra""a/6a Bandoni et Zang菌種。
實(shí)施例3
(1)提取現(xiàn)有待鑒定菌種的菌絲體基因組DNA，具體方法如下
無(wú)菌收集培養(yǎng)5天的待鑒定菌種的菌絲體0.1 g置于已滅菌的研缽中，加0.5-1 mL提取
緩沖液(提取緩沖液為pH9.0的0.15 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液7mL與pH為8.0的0.05 mol/L
乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至lOOmL配制而成)研磨混勻。將勻漿后的液體移入無(wú) 菌離心管中，力n入0.1-0.2 mL質(zhì)量百分濃度為10%的十二垸基磺酸鈉溶液和0.3-0.6 mL氯化 芐試劑，充分混勻，50。C保溫l-2小時(shí)。加入0.3mL3mol/LNaOAc (pH5.2)混勻，冰水 浴15-20 min， 6000 r/min室溫離心15-20 min。取上清加等體積無(wú)水乙醇室溫沉淀20-50 min， 去上清，10000 r/min室溫離心15min，沉淀用70%乙醇洗一次，風(fēng)干水溶，4。C保存。1.5% 瓊脂糖凝膠電泳(100V電壓下電泳30min)檢測(cè)純度和分子量范圍。提取過(guò)程中均以無(wú)菌水 作空白提取對(duì)照，所有的提取對(duì)照在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中作為陰性對(duì)照的模板，以防止提 取和擴(kuò)增過(guò)程中外源DNA的污染。
如用DNA提取試劑盒提取DNA，按試劑盒的操作指南進(jìn)行。
(2) 以提取得到的待鑒定菌種菌絲體的基因組DNA樣品為模板，用針對(duì)金耳ITS區(qū)的專用引 物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到ITS片段產(chǎn)物，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到了一個(gè)堿基 數(shù)約為700bp的條帶。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具體步驟如下
以所提取材料的基因組DNA分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物以寡核苷酸作 為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物，擴(kuò)增ITS區(qū)段，所用的引物分別位于18S和28S的保守區(qū)段；
采用雙向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增ITS區(qū)的整個(gè)片段，擴(kuò)增的正向引物P1為 5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；反向引物P2為 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，位于28S上；
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系(50pL): DNA模板l-5xl(T9g,兩個(gè)2xl(T5 mol/L引物各1 pL， 10xbuffer緩沖液(pH 8.3) 5 nL，四種0.01 mol/L單核苷酸化L， 5 U/pLDNA聚合酶0.25 pL， 無(wú)菌雙蒸水定容至50^L，加好后上蓋石蠟油25 ^L;
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)條件94'C預(yù)變性5分鐘，然后按94'C變性1分鐘,52-57'C退火 45秒鐘，72°C延伸1分鐘，循環(huán)30次；最后在72'C延伸5分鐘，在4。C終止反應(yīng)。Agrose瓊 脂糖凝膠電泳檢査產(chǎn)物(Marker分子量范圍100-1200 bp)。
(3) 對(duì)得到的凝膠電泳條帶進(jìn)行割膠回收純化，每樣平行重復(fù)3次，另設(shè)空白對(duì)照組。
(4) 純化后的ITS區(qū)產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序反應(yīng)后直接進(jìn)行測(cè)序，其中所有序列至少經(jīng)過(guò)正反兩次重復(fù) 測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)序以保證序列的準(zhǔn)確性，包括ITS區(qū)(包括5.8S區(qū))的全序列，其 中測(cè)序引物為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所用引物，測(cè)序正向引物P1為
5，隱CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，；反向引物P2為5'隱TCCTCCGCTTATTGATATGC國(guó)3，。
(5) 將得到的待鑒定菌種的ITS區(qū)序列輸入計(jì)算機(jī)后，用DNAStar軟件包中的Editseq和
Seqman進(jìn)行編輯，用Megalign中Clustal W方法，與已經(jīng)確定的序列表中的金耳ITS區(qū)序列進(jìn)
行比較判定，用MEGA軟件計(jì)算序列的堿基組成和兩序列間的轉(zhuǎn)換/顛換比值，統(tǒng)計(jì)和分析序
列的差異，用PAUP軟件的PTP test進(jìn)行序列信息檢驗(yàn)。 (6)經(jīng)上述步驟(5)的DNA數(shù)據(jù)分析，各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果如下
a、 待鑒定菌種的ITS區(qū)序列與本發(fā)明的序列表中金耳的寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列的 堿基差異為0;
b、 待鑒定菌種的ITS區(qū)序列與本發(fā)明的序列表中金耳的寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列的 轉(zhuǎn)換/顛換比值相等；
c、 待鑒定菌種的ITS區(qū)序列與本發(fā)明的序列表中金耳的寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列的 相對(duì)遺傳距離為0%:
判定待鑒定真菌菌種為金耳的寄主菌粗毛韌革菌Stere鵬/n'ra^附(Willd.)Fr.菌種。 實(shí)施例4
(1) 提取現(xiàn)有待鑒定孢子菌種的菌體基因組DNA，具體方法如下 無(wú)菌收集待鑒定孢子菌種的培養(yǎng)3天的菌體0.1 g置于巳滅菌的研缽中，加0.5-1 mL提
取緩沖液，提取緩沖液為pH9.0的0.15 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液7mL與pH為8.0的0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液8mL混合后定容至100mL配制而成，研磨混勻；將勻漿后的液體 移入無(wú)菌離心管中，加入0.1-0.2 mL質(zhì)量百分濃度為10%的十二垸基磺酸鈉溶液和0.3-0.6 mL 氯化芐試劑，充分混勻，50。C保溫l-2小時(shí)。加入0.3mL3mol/LNaOAc (pH5.2)混勻， 冰水浴15-20 min， 6000 r/min室溫離心15-20 min;取上清加等體積無(wú)水乙醇室溫沉淀20-50 min，去上清，10000 r/min室溫離心15min，沉淀用70%乙醇洗一次，風(fēng)干水溶，4。C保存； 1.5%瓊脂糖凝膠電泳(100V電壓下電泳30min)檢測(cè)純度和分子量范圍；提取過(guò)程中均以 無(wú)菌水作空白提取對(duì)照，所有的提取對(duì)照在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程中作為空白對(duì)照的模板，以 防止提取和擴(kuò)增過(guò)程中外源DNA的污染。如用DNA提取試劑盒提取DNA，按試劑盒的操 作指南進(jìn)行。
(2) 以提取得到的待鑒定菌種的基因組DNA樣品為模板，用針對(duì)金耳ITS區(qū)的專用引物進(jìn)行 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到ITS片段產(chǎn)物，將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到了一個(gè)堿基數(shù)約為 500bp的條帶；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具體步驟如下
以所提取材料的基因組DNA分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物以寡核苷酸作 為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物，擴(kuò)增ITS區(qū)段，所用的引物分別位于18S和28S的保守區(qū)段；
采用雙向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增ITS區(qū)的整個(gè)片段，擴(kuò)增的正向引物P1為 5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；反向引物P2為 5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，位于28S上；
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系(50pL): DNA模板l-5xl0'、兩個(gè)2><10'5 mol/L引物各1 pL，
10xbuffer緩沖液(pH 8.3 )5 ^L，四種0.01 mol/L單核苷酸4pL， 5 U/^iLDNA聚合酶0.25 ^L， 無(wú)菌雙蒸水定容至50 pL，加好后上蓋石蠟油25 ^L;
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)條件94'C預(yù)變性5分鐘，然后按94'C變性1分鐘，52-57'C退火 45秒鐘，72'C延伸1分鐘，循環(huán)30次，最后在72'C延伸5分鐘，在4'C終止反應(yīng)。Agrose瓊 脂糖凝膠電泳檢查產(chǎn)物(Marker分子量范圍100-1200 bp)。
(3) 對(duì)得到的凝膠電泳條帶進(jìn)行割膠回收純化，每樣平行重復(fù)3次，另設(shè)空白對(duì)照組。
(4) 純化后的ITS區(qū)產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序反應(yīng)后直接進(jìn)行測(cè)序，其中所有序列至少經(jīng)過(guò)正反兩次重復(fù) 測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)三次測(cè)序以保證序列的準(zhǔn)確性，包括ITS區(qū)(含5.8S區(qū))的全序列，其中 測(cè)序引物為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)所用引物，測(cè)序正向引物P1為
5'隱CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，；反向引物P2為5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，。
(5) 將得到的待鑒定菌種的ITS區(qū)序列輸入計(jì)算機(jī)后，用DNAStar軟件包中的Editseq和 Seqman進(jìn)行編輯，用Megalign中Clustal W方法，與已經(jīng)確定的序列表中的金耳ITS區(qū)序列進(jìn) 行比較判定，用MEGA軟件計(jì)算序列的堿基組成和兩序列間的轉(zhuǎn)換/顛換比值，統(tǒng)計(jì)和分析序 列的差異。用PAUP軟件的PTP test進(jìn)行序列信息檢驗(yàn)。
(6) 經(jīng)上述步驟(5)的DNA數(shù)據(jù)分析，各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果如下
a、 待鑒定菌種的ITS區(qū)序列與本發(fā)明的序列表中金耳的ITS區(qū)序列的堿基差異為0;
b、 待鑒定菌種的ITS區(qū)序列與本發(fā)明的序列表中金耳的ITS區(qū)序列的轉(zhuǎn)換/顛換比值相等；
c、 待鑒定菌種的ITS區(qū)序列與本發(fā)明的序列表中金耳的ITS區(qū)序列的相對(duì)遺傳距離為0%; 判定待鑒定真菌菌禾中為金耳7>ewe//a awra""a化fl！ Bandoni et Zang菌種。
SEQUENCE LISTING
〈110〉江蘇同源堂生物工程有限公司
〈120〉金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列及利用該序列鑒定金耳的方法 〈■2
〈210>1
〈211〉467
〈212〉DNA
〈213〉金耳(7>ewe//a awmw//of/6a Bandoni et Zang)
〈400〉1
aggatcattagtgstttggcctctgtgcctCC3t3CCtCtgtgaactgtc60
agccctcgggCtC333C3ttgtgt33tgs3tgtct3ta3c3t33CCt33t3333CtttC3120
ac3acgg3tctcttggctctcgcstcgstgcgss3tgcg3taagtaatgt180
gaattgcsgaattcagtgaatC3tcgs3tctttgs3cgcsccttgcgccttttggtattc240
gcctgtttgsgtgtcatgaaCtCtC33tCCcctcgggtttccgsctggst300
tggscttgggtgctgccgtttggctcgcctt33atgscttagtggstgtctcccctsgtc360
gtttcstcggtg33gggtctsgtctgctc3castcgcctttgctggcaac420
3tttgtsctctg3CCtC33Stcsggtsgggctacccgctg467
<210〉2
〈211〉548
〈212〉DNA
〈213〉粗毛韌革菌(&erew附/z/nsw^w (Willd.)Fr.)
〈400〉2
tgactggggttgtsgctggcggcstgtgc3cgctcctttc60
3Ct33tCC3C3C3C3cctgtgcsccttcgcgggggtctcttcgtt33ctcgsagsggctc120
gcgtcccttt3C3C3CCCtttgt3tgtctt3Ctcgatgt3180
tctaat3C33CtttC33C33cggatctcttggctctcgcatcgatgaagascgcagcgaa240
atgcgataagtsstgtg33ttgcsg33ttc3gtgsstC3tcgsstctttg33CgC3CCtt300
gcgccctttggtsttccg33gggcscscctgtttgagtgtcgtg333ttctC33CCCtCt360
tcgcttttgtg33cgtsgtgg3ttggacttggaggctttgccgggcttcaccgctcggct420
CCtCtC333tgcaLtt3gtgcgtcttgttgcgscgtgcgcctcggtgtgst33tt3tCt3C權(quán)
gctgtggtgtgcttgcttctgtgg3g3cgcgctttct33ccgtccg333ggacagctttc540
3tCg33Ct
權(quán)利要求
1、一種金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列，其特征在于所說(shuō)金耳的ITS區(qū)序列，如SEQ ID NO.1所示；金耳的寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列，如SEQ ID NO.2所示。
2、 一種利用權(quán)利要求1所述的金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列鑒定金耳品種的方法，包括以下步驟(1) 從待鑒定真菌樣品中提取基因組DNA;(2) 以步驟(1)提取得到的DNA樣品為模板，用針對(duì)金耳ITS區(qū)的專用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)擴(kuò)增得到待鑒定真菌的ITS片段產(chǎn)物，擴(kuò)增的正向引物P1為 5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；反向引物P2為5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，位于28S上，在50叱的體系中完成擴(kuò) 增反應(yīng)，以雙蒸水代替模板DNA作空白對(duì)照；(3) 將步驟(2)擴(kuò)增反應(yīng)得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化；(4) 將步驟(3)純化后的ITS區(qū)產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，得到待鑒定真菌樣品的ITS區(qū)序列；(5) 將步驟(4)得到的序列與SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列分別進(jìn)行比較，其中 步驟(4)得到的ITS區(qū)序列與SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列都吻合則判斷為金耳品種。
3、 一種利用權(quán)利要求1所述的金耳與寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列鑒定金耳菌種或粗毛 韌革菌菌種的方法，包括以下步驟(1) 從待鑒定真菌樣品中提取基因組DNA;(2) 以步驟(1)提取得到的DNA樣品為模板，用針對(duì)金耳ITS區(qū)的專用引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)擴(kuò)增得到待鑒定真菌的ITS片段產(chǎn)物，擴(kuò)增的正向引物P1為 5，-CGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，，位于18S上；反向引物P2為5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，位于28S上，在50化的體系中完成擴(kuò) 增反應(yīng)，以雙蒸水代替模板DNA作空白對(duì)照；(3) 將步驟(2)擴(kuò)增反應(yīng)得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化；(4) 將步驟(3)純化后的ITS區(qū)產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，得到待鑒定真菌樣品的ITS區(qū)序列；(5) 將步驟(4)得到的序列與SEQIDNO.l和SEQ ID N0.2序列分別進(jìn)行比較，其中 若步驟(4)得到的ITS區(qū)序列僅與SEQIDNO.l序列吻合則判斷為金耳菌種；若步驟(4)得到的ITS區(qū)序列僅與SEQIDN0.2序列吻合則判斷為粗毛韌革菌菌種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種真菌品種的DNA序列及利用該序列鑒定其品種的方法，所說(shuō)的金耳的ITS區(qū)序列如SEQ ID NO.1所示；寄主真菌粗毛韌革菌的ITS區(qū)序列如SEQ ID NO.2所示。鑒定時(shí)，先提取待鑒定樣品的ITS區(qū)序列，交其與與SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列分別進(jìn)行比較，從而得到結(jié)果。本發(fā)明可以準(zhǔn)確地判定待鑒定真菌的真?zhèn)?，也可以?duì)人工培養(yǎng)的金耳酵母狀孢子菌種和寄主真菌粗毛韌革菌菌種進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。，能準(zhǔn)確區(qū)分和判別金耳品種或菌種的真實(shí)性和純度，為品種鑒定、保護(hù)、菌種質(zhì)量控制及有效菌種繁育提供可靠技術(shù)。
文檔編號(hào)C12N15/31GK101348833SQ20081012443
公開(kāi)日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2008年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月16日
發(fā)明者俞建國(guó), 劉春卉, 瞿偉箐, 馬維新 申請(qǐng)人:江蘇同源堂生物工程有限公司