一種獲得蘿卜單倍體的育種方法

專利名稱：一種獲得蘿卜單倍體的育種方法
技術領域：
本發明涉及一種利用游離小孢子培養技術快速獲得蘿卜單倍體的育種方法，屬于植物遺傳育種領域。
背景技術：
游離小孢子培養是作物產生單倍體的有效途徑之一，單倍體自發或人工誘導加倍形成的加倍單倍 體(DH)群體對于作物遺傳和分子育種等研究有著重要的作用(Oleszczuk, S.; Sowa， S.; Zimny, J.Direct embryogenesis and green plant regeneration from isolated microspores of hexaploid triticale(xTriticosecale Wittmack) cv. Bogo. Plant Cell Rep, 22:885-893;2004)。 ( 1 )利用小孢子培養獲得的單倍體植株染色體加 倍，可以在一個世代就獲得性狀穩定的純合體，大大縮短親本純合的時間,加快育種進程,提高所需基因 組合的選擇效率。此外，利用雜交種進行小孢子培養，可以快速分離Fi中的有利基因，并快速獲 得它的自交系。(2)外源基因導入的良好受體。從一個小孢子到一個幼齡的小孢子植株，都可以作為 外源基因轉化和轉導的較佳受體，經轉化和轉導的單倍體細胞，通過染色體自發或秋水仙堿等處理加 倍后可直接獲得純合二倍體轉化株。(3)良好的誘變對象。以小孢子作為誘變對象的小孢子誘變，誘 變后通過染色體加倍的處理，無論顯性還是隱性突變，都將在當代顯現其表現型，易于選擇和鑒定。 蘿卜是典型的異花授粉作物，由于它的自交不親和性和其它的物理屏障很難甚至不可能通過自交得到 蘿卜的純合體。因此，利用游離小孢子培養獲得純合的DH群體用于選育蘿卜優良新品種似乎是唯一 可行的首選方法。
蘿卜是十字花科作物中最不容易進行游離小孢子培養的材料之一，盡管在蕓苔屬很多作物中已實 現通過小孢子培養成功獲得單倍體。有關蘿卜游離小孢子培養研究，目前國內外僅見極少報道。總體看 來，集中表現出來的問題就是蘿卜游離小孢子培養研究中出胚率較低，再生株獲得數量有限(Takahata, Y.; Komatsu， Hisashi.; Kaizuma， Norihiko. Microspore culture of radish (i op/;朋w5 5<2fZvt \L):influence of genotype and culture conditions on embryogenesis. Plant Cell Report, 16:163 166; 1996; 周志國，龔義勤， 王曉武，柳李旺，張延國.不同蘿卜品種游離小孢子的誘導及培養體系優化研究.西北植物學報，2007， 27 (1) :0033 0038)。本研究通過對蘿卜游離小孢子進行培養，并成功獲得一定數量的單倍體再生 植株，為開展蘿卜種質資源的遺傳研究，建立高效簡便的育種方法，縮短育種年限，快速培育優良的 蘿卜新品種提供了重要的理論與技術指導。

發明內容
技術問題
本發明的目的是提出一種快速獲得蘿卜單倍體的育種方法，從熱激、花粉發育時期、不同培養基及其添加物質等幾個方面對蘿卜小孢子進行培養，獲得再生植株，并通過鑒定為單倍體。建立了蘿卜 游離小孢子培養高頻再生技術體系，獲得蘿卜單倍體再生植株，染色體加倍后可以用于蘿卜遺傳育種。 技術方案
快速獲得蘿卜單倍體的育種方法，包括以下步驟
1) 小孢子的培養
從蘿卜供體植株上挑選1.5 5.0mm的花蕾，選取瓣藥比即花瓣長度/花藥長度等長或花瓣微短于 花藥的花蕾，用體積比75X酒精消毒60s,然后再用質量比8。/。的次氯酸鈉溶液表面消毒15min，無菌 水沖洗3次，將花蕾置于已滅菌研缽中，以B5-13液體培養基為洗液，采用擠壓法游離小孢子，以400 目尼龍網過濾，并將懸浮液收集于離心管，1500rmin"離心5min，棄上清液，再加入4ml洗液離心， 重復3次，棄上清液后加入NLN-13液體培養基，調整小孢子密度達2Xl()S個/ml，分裝于60xl5mm 培養皿中，添加活性炭終濃度為0.75g/ L，利用Parafilm膜封口 ，于32.5'C恒溫培養箱熱激處理48h， 然后于25'C條件下靜止黑暗培養2-3周，獲得子葉型胚狀體；
2) 胚狀體的萌發與植株再生
將子葉型胚狀體轉移到25°C、 4000Lx、 16bd—1的光照下培養5 7d，待胚狀體轉綠后接到繼代培 養基上萌發、繼代培養，繼代培養基質量比為Bs+蔗糖3%+瓊脂1.0%+6-BA0.2mg/L+NAA0.02 mg/L+活性炭0.lX， pH5.8;
經過3-4次繼代無根試管苗轉移到生根培養基中生根培養，生根培養基質量比為85+蔗糖3% +瓊脂0.8%+NAA0.2mg/L， pH5.8;
將試管苗在培養室內開瓶煉苗，馴化移栽到澆透水的裝有滅菌基質泥炭、營養土和蛭石的比例 為2:1:1的營養缽中，用塑料薄膜覆蓋，相對濕度皿=85%，將營養缽放于光照培養箱中，保持25'C， 12h光照和12h黑暗的條件，1周后營養缽放置外界陰涼處，逐步煉苗，3周后將其移栽到大田； 4)再生植株倍性鑒定
利用根尖細胞染色體計數法鑒定取再生植株根尖于10ml離心管，經冰水混合物預處理24h,無 水乙醇冰醋酸=3: 1的卡諾固定液固定24 h，蒸餾水沖洗3次，再用1 mol /LHC1于60'C水浴鍋中 解離6 7min，經解離后的材料用蒸餾水充分清洗，卡寶品紅染色，壓片、鏡檢，Nikon顯微鏡觀察 并攝影，確定獲得染色體!1=1=9的單倍體植株(對照二倍體植株染色體數目2n=2x=18);
或利用流式細胞儀鑒定稱取100mg試管苗嫩莖或幼葉，在滴有2ml提取液(15mmo1 Tris-HCl， pH 7.5， 8Ommo1 L-1KC1, 20mmo1 . L-lNaCl， 20mmo1 L-lEDTA-Na-2，15m mol L-l巰基乙醇，體積 比0.05。/。的TritonX-100)的培養皿中剪碎，260目尼龍網過濾，1000r/min離心5min，重復漂洗3次，離 心后棄上清液，收集沉淀細胞加入2ml染色緩沖液，在4'C黑暗條件下染色30min，用標準管收集樣隨 即利用流式細胞儀(American Beckman Co.)進行倍性測定，根據DNA相對含量為100 (二倍體植株DNA相對含量200為對照)，證實獲得蘿卜單倍體植株。 有益效果
本發明研究表明，32.5'C熱激48h對于小孢子啟動分裂非常必要，未經32.5'C熱激處理的小孢子， 在所有基因型中均未誘導出胚狀體。NLN-13液體培養基最有利于蘿卜游離小孢子培養，培養基中大 量元素的減半與否不是影響蘿卜出胚率的主要因素。NLN-13液體培養基中添加0.75g/L的活性炭有助 于提高胚狀體的產量和質量。利用瓣藥比(花瓣長度/花藥長度)可以準確的判斷小孢子的發育時期， 瓣藥等長或花瓣微短于花藥的花蕾最適于進行小孢子培養。
本發明的特點是采用簡便的培養方式，從熱激、花粉發育時期、不同培養基及其添加物質等方 面建立起蘿卜小孢子高效培養體系，使小孢子的胚狀體誘導率提高到17.03個/105，同時擴大了基因型 的范圍；對蘿卜小孢子的再生植株倍性利用根尖細胞染色體計數和流式細胞儀鑒定，證實成功獲得一 定數量的蘿卜單倍體再生植株。
應用前景利用蘿卜小孢子培養獲得的單倍體加倍，可以在一個世代就獲得性狀穩定的純合體，* 大縮短親本純合的時間,加快育種進程,提高所需基因組合的選擇效率。此外，利用F^才料進行小孢子培 養，能夠快速分離Fi中的有利基因，將獲得的有利基因的單倍體加倍，可以快速獲得它的自交系，有 效用于蘿卜雜交育種選育優良新品種。


圖l.蘿卜游離小孢子的胚胎發生與植株再生.
(A)單核靠邊期的小孢子。Bar=10nm。 (B)花蕾中游離出來的小孢子。Bar=35 nm。 (C)膨大的 小孢子。Bar=20nm。 (D)球形胚。Bar= 150 Mm。 (E)心型胚。Bai=200 pm。 (F)魚雷型胚。Bar=200 ^m。 (G)子葉型胚。Bai=200 nm。 (H)轉到繼代培養基上的子葉胚。Bar=l. 5 cm。 (I)再生植株 生根。BaF4cm。 (J)再生株的根尖染色體(n=x=9) 。 Bai=2 pm。 (K)再生株的根尖染色體(2n=2x=18)。 Bar=2pm。 (L)再生株的根尖染色體(4n=4x=36) 。 Bar=2 nm。 圖2.利用流式細胞儀鑒定再生植株的倍性(a，b和c)
(a)小孢子單倍體再生植株。(b)小孢子雙單倍體再生植株。(c)小孢子四倍體再生植株。D和E兩峰 分別代表G〖和G2時期。
具體實施方式
(1) 小孢子的培養
從蘿卜材料NAU-xxxs-03 (王瑋,柳李旺,龔義勤,等.蘿卜肉質根膨大過程中碳水化合物與蔗糖代謝 相關酶活性分析.園藝學報，2007， 34(5): 1313-1316)供體植株上挑選大約1.5 5.0mm左右的花蕾，
利用瓣藥比(花瓣長度/花藥長度)，選取瓣藥比等長或花瓣微短于花藥的花蕾，花蕾用75%酒精消毒60s，然后再用8%的次氯酸鈉溶液表面消毒15min，無菌水沖洗3次。將花蕾置于已滅菌研缽中，以 添加質量比0.015%Ca2+ 、 pH為5.8的B5-13液體培養基(85+13%蔗糖，B5培養基見Gamborg, O丄.； Miller, R.A.; Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells.Exp Cell Res.50:151-158;1968)為洗液，采用擠壓法游離小孢子。以400目尼龍網過濾，并將懸浮液收集于離 心管，1500rmin—1離心5min，棄上清液，再加入4ml洗液離心，重復3次。棄上清液后加入NLN-13 液體培養基(NLN +13%蔗糖，NLN培養基見Lichter, R. Induction of haploid plants from isolated pollen of 5rasWca Twpwj L. Z Pflanzenphysiol,105:427 434;1982)，調整小孢子濃度達2X 105個/ml，分裝于60 xl5mm培養皿中，添加活性炭終濃度為0.75g/L，利用Parafilm膜封口 ，于32.5'C恒溫培養箱熱激處 理48h，然后于25。C條件下靜止黑暗培養2-3周，利用倒置顯微鏡觀察小孢子的發育過程，得到子葉 型胚狀體。
(2) 胚狀體的萌發與植株再生
將子葉型胚狀體轉移到25'C、 4000Lx、 16h'd—1的光照下培養5 7d，待胚狀體轉綠后接到培養基 Bs +蔗糖3%+瓊脂1.0%+6-BA0.2mg/L +NAA0.02 mg/L+活性炭0.1%, pH5.8上萌發、繼代培養。 經過3-4次繼代無根試管苗轉移到培養基Bs+蔗糖3% +瓊脂0.8% +NAA0.2 mg/L，pH5.8中生根培 養。
將試管苗在培養室內開瓶煉苗，馴化移栽到澆透水的裝有滅菌基質泥炭、營養土和蛭石的體積 比為2:1:1的營養缽中，用塑料薄膜覆蓋，相對濕度1111=85%，將營養缽放于光照培養箱中，保持25 'C， 12h光照和12h黑暗的條件，1周后營養缽放置外界陰涼處，逐步煉苗，3周后將其移栽到大田；
(3) 再生植株倍性鑒定
利用根尖細胞染色體計數法和流式細胞儀，鑒定再生植株倍性。取再生植株根尖于10ml離心管， 經冰水混合物預處理24h后。卡諾固定液(無水乙醇冰醋酸=3: 1, V/V)固定24h，蒸餾水沖洗3 次，再用lmol/LHCl于6(TC水浴鍋中解離6 7min，經解離后的材料用蒸餾水充分清洗，卡寶品紅 染色，壓片、鏡檢(段永紅,李素清,牛西午,孫毅.錦雞兒屬植物4個種的核型分析.武漢植物學研 究.2006,24(5):413 417)， Nikon顯微鏡觀察并攝影，確定獲得染色體n=x=9的單倍體植株(對照二倍 體植株染色體數目2n=2x=18)。
或利用流式細胞儀鑒定稱取100mg試管苗嫩莖或幼葉，在滴有2ml提取液(15mmo1 Tris-HCl， pH 7.5, 80m mol L-lKCl, 20m mol L-lNaCl, 20m mol . L-IEDTA-Na-2，15m mol L-l巰基乙醇，體積 比0.05。/。TritonX-100)的培養皿中剪碎，260目尼龍網過濾，1000r/min離心5min，重復漂洗3次，離心 后棄上清液，收集沉淀細胞加入2ml染色緩沖液(RNase: PI=1:25, V/V，張振超,張蜀寧,張偉,張紅亮. 四倍體不結球白菜的誘導及染色體倍性鑒定.西北植物學報，2007，27(l):0028-0032)，在4'C黑暗條件下染色30min，用標準管收集樣隨即利用流式細胞儀(American Beckman Co.)進行倍性測定，根據DNA 相對含量為100 (二倍體植株DNA相對含量200為對照)，證實獲得蘿卜單倍體植株。利用上述方法本發 明還在一些其他蘿卜品種中成功得到單倍體植株。
應用前景利用蘿卜進行小孢子培養獲得的單倍體植株染色體加倍，可以在一個世代就獲得性狀 穩定的純合體，大大縮短親本純合的時間,加快育種進程,提高所需基因組合的選擇效率。此外，利用蘿 卜Fi代雜交種進行小孢子培養，能夠快速分離Fi中的有利基因，將獲得的有利基因的單倍體加倍，可 以快速獲得它的自交系，有效用于蘿卜雜交育種選育優良新品種，對于生產實踐具有廣泛的指導意義 與切實可行性。
權利要求
1.一種獲得蘿卜單倍體的育種方法，包括以下步驟1)小孢子的培養從蘿卜供體植株上挑選1.5～5.0mm的花蕾，選取瓣藥比即花瓣長度/花藥長度等長或花瓣微短于花藥的花蕾，用體積比75％酒精消毒60s，然后再用質量比8％的次氯酸鈉溶液表面消毒15min，無菌水沖洗3次，將花蕾置于已滅菌研缽中，添加質量比0.015％Ca2+、pH為5.8的B5-13液體培養基為洗液，采用擠壓法游離小孢子，以400目尼龍網過濾，并將懸浮液收集于離心管，1500r·min-1離心5min，棄上清液，再加入4ml洗液離心，重復3次，棄上清液后加入NLN-13液體培養基，調整小孢子濃度達2×105個/ml，分裝于60×15mm培養皿中，添加活性炭終濃度為0.75g/L，利用Parafilm膜封口，于32.5℃恒溫培養箱熱激處理48h，然后于25℃條件下靜止黑暗培養2-3周，獲得子葉型胚狀體；2)胚狀體的萌發與植株再生將子葉型胚狀體轉移到25℃、4000Lx、16h·d-1的光照下培養5～7d，待胚狀體轉綠后接到繼代培養基上萌發、繼代培養，繼代培養基質量比為B5+蔗糖3％+瓊脂1.0％+6-BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L+活性炭0.1％，pH5.8；經過3-4次繼代無根試管苗轉移到生根培養基中生根培養，生根培養基質量比為B5+蔗糖3％+瓊脂0.8％+NAA0.2mg/L，pH5.8；將試管苗在培養室內開瓶煉苗，馴化移栽到澆透水的裝有滅菌基質泥炭、營養土和蛭石的體積比為2∶1∶1的營養缽中，用塑料薄膜覆蓋，相對濕度RH＝85％，將營養缽放于光照培養箱中，保持25℃，12h光照和12h黑暗的條件，1周后營養缽放置外界陰涼處，逐步煉苗，3周后將其移栽到大田；3)再生植株倍性鑒定利用根尖細胞染色體計數法鑒定取再生植株根尖于10ml離心管，經冰水混合物預處理24h，無水乙醇∶冰醋酸＝3∶1的卡諾固定液固定24h，蒸餾水沖洗3次，再用1mol/L HCl于60℃水浴鍋中解離6～7min，經解離后的材料用蒸餾水充分清洗，卡寶品紅染色，壓片、鏡檢，Nikon顯微鏡觀察并攝影，確定獲得染色體n＝x＝9的為單倍體植株，對照二倍體植株染色體數目2n＝2x＝18；或利用流式細胞儀鑒定稱取100mg試管苗嫩莖或幼葉，在滴有2ml提取液的培養皿中剪碎，提取液為15m mol·L-1Tris-HCl，pH 7.5，80m mol ·L-1KCl，20m mol·L-1NaCl，20m mol·L-1EDTA-Na-2，15mmol·L-1巰基乙醇，體積比0.05％的TritonX-100；260目尼龍網過濾，1000r/min離心5min，重復漂洗3次，離心后棄上清液，收集沉淀細胞加入2ml RNase和PI體積比為1∶25的染色緩沖液，在4℃黑暗條件下染色30min，用標準管收集樣隨即利用流式細胞儀進行倍性測定，測得DNA相對含量為100相對于對照二倍體植株DNA相對含量為200，證實獲得蘿卜單倍體植株。
全文摘要
本發明公開了一種快速獲得蘿卜單倍體的育種方法，屬于植物遺傳育種領域。包括32.5℃恒溫培養箱熱激處理48h的小孢子培養獲得子葉型胚狀體，25℃、4000Lx、16h·d^-1的光照下培養5～7d，待胚狀體轉綠后接到繼代培養基、生根培養基上萌發與植株再生，再利用根尖細胞染色體計數法或利用流式細胞儀進行再生植株倍性鑒定。通過本發明方法成功獲得蘿卜單倍體再生植株，使小孢子的胚狀體誘導率提高到17.03個/10⁵。本發明利用小孢子培養方法獲得中國蘿卜的單倍體植株，染色體加倍后得到純合自交系，可用于蘿卜遺傳改良與新品種選育。
文檔編號C12N5/04GK101283674SQ20081012389
公開日2008年10月15日 申請日期2008年6月11日 優先權日2008年6月11日
發明者周治國, 張翠萍, 柳李旺, 趙艷玲, 龔義勤 申請人:南京農業大學