專利名稱：：從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白還原酶的方法
技術領域：
：本發明涉及一種蛋白酶的提取純化工藝，具體是從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白還原酶的方法。
背景技術：
：肉色是肉食品生產的重要經濟性狀，被科學家和生產者、消費者共同關注，肉色鮮紅富有光澤表明肉品新鮮、質地優良，它與肌肉中的肌紅蛋白(Mb)及其還原酶體系(Reductase)密切相關。Mb在體內以三種形態存在，分別是脫氧肌紅蛋白，呈紫紅色；氧合肌紅蛋白(oxymyoglobin,Mb02)，呈鮮紅色；二者都可被氧化成高鐵肌紅蛋白(metmyoglobin，MetMb)，呈暗褐色。肌肉中存在著三者相互轉換的氧化還原系統，在酶的作用下相互轉變，并維系動態平衡和穩定的肉色。肌肉離體后，隨著高鐵肌紅蛋白還原酶(MetMbR)活性的逐步喪失，肌肉顏色逐漸褐變，提示肌肉被空氣中雜菌污染和肌肉開始變質，或骨骼肌機能下降等。即使在體外(生鮮肉保藏期間)，利用自身MetMbR氧化還原酶體系的護色機制可干預MetMb的生成，維系肌肉的新鮮度和良好的肉色，在一定時間內體現生鮮肉肉品品質；MetMbR高轉換活性意味著心肌和骨骼肌具有良好攜氧功能等。因此，研究MetMbR與MetMb相互作用關系，就需要得到比較理想MetMbR生物材料作為基準物，才能提高研究的科學性、可靠性等。然而，理想和純化的MetMbR生物材料難以制備，這方面的實驗條件研究進展緩慢，市場上亦無MetMbR生物制品出現。若能夠獲得純品的MetMbR,將為肉品學、運動醫學和心血管疾病的研究提供實驗條件及材料。
發明內容本發明的目的是提供一種提取純化高鐵肌紅蛋白還原酶的方法，該方法選用DEAE-FastFlow、CM-SephadexFF離子交換層析及藍色瓊脂糖凝膠FF三種層析介質，采用色譜法從豬心中分離和純化高鐵肌紅蛋白還原酶的方法，可在較短的時間內得到電泳純的高鐵肌紅蛋白，且得率高，有效地解決了問題。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是一種從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白還原酶的方法，包括以下步驟1)將新鮮豬心肌剁碎，加水勻漿處理，粗勻漿用2NNH40H把pH調至7.5，靜置離心、過濾后得粗提液；2)粗提液經40%-70%硫酸銨鹽析，得到的沉淀用平衡緩沖液重懸，離心后取上清液對平衡緩沖液透析，透析膜的截留分子量為14000，得透析液；所說的平衡緩沖液是0.02M、pH6.0磷酸鹽緩沖液；3)將透析液上樣到緩沖液A平衡的DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析柱，用緩沖液A冼脫雜蛋白，再緩沖液A和緩沖液B進行梯度洗脫，收集合并酶活性部分，濃縮透析所說的緩沖液A是0.002M、pH7.0、含0.001MEDTA磷酸鹽緩沖液；緩沖液B是0.2M、pH7.0，含0.001MEDTA磷酸鹽緩沖液；4)將得到的透析液上樣到緩沖液C平衡過夜的CM-SephadexFastFlow陽離子交換層析柱；用緩沖液C洗脫雜蛋白，洗脫完后，用緩沖液D洗脫，收集合并酶活性部分，透析濃縮所說的緩沖液C是0.02M、pH6.0磷酸鹽緩沖液，所說的緩沖液D是0.2M、pH6.0磷酸鹽緩沖液；5)將具有酶活組分的透析液冷凍干燥后，上樣到用緩沖液E平衡的藍色瓊脂糖凝膠FF親和層析，用緩沖液E洗脫雜蛋白，最后用緩沖液E和含l.OMNaCl緩沖液E進行線性線性梯度，收集具有酶活性組分的洗脫液，即得到純化的高鐵肌紅蛋白還原酶所說的緩沖液E是0.03M、pH6.0，含0.001MEDTA磷酸鹽緩沖液。為了便于保存，還可將上述得到的高鐵肌紅蛋白還原酶液經透析、冷凍干燥后，-S(TC分裝保存。與通常的蛋白酶提取純化相似，其中第25步最好在4'C下進行。本發明方法中所說的動物心肌，優選豬心肌，因為其來源廣、成本低；其他動物如牛、羊等的心肌同樣可做為原材料。對于本領域的技術人員，可以理解，除心肌外，其他富含高鐵肌紅蛋白還原酶的動物肌肉如骨骼肌，同樣可參照本發明的步驟，制備高鐵肌紅蛋白還原酶。本發明方法具有產品純度高，工藝簡單、成本低等優點，既可填補我國該生物試劑制備的空白，又具有較高的經濟價值。下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。圖l是DEAE-S鄰haroseFastFlow層析圖譜圖2是CM-SephadexFastFlow層析圖譜圖3是藍色瓊脂糖FastFlow親和層析4是SDS-PAGE和PAGE電泳圖其中M.蛋白marker1.粗提物2.鹽析物3.陰離子交換物4.陽離子交換物5.親和層析物6.親和層析物(PAGE電泳)圖5是SDS-PAGE電泳圖其中M.蛋白marker1.親和層析物圖6是電泳后凝膠掃描圖其中A是粗提液樣品電泳后凝膠掃描圖B是經陰離子交換層析樣品電泳后凝膠掃描圖C是經陽離子交換層析樣品電泳后凝膠掃描圖D是親和層析后樣品電泳后凝膠掃描圖具體實施例方式在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體的實施例，并參照附圖數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例及附圖只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內容相同。實施例l:高鐵肌紅蛋白還原酶的制備材料新鮮豬心，陰離子交換層析材料(DEAE-SepharoseFastFlow,Pharmacia),陽離子交換層析材料(CM-SephadexFastFlow,Pharmacia),藍色瓊脂糖FastFlow親和層析凝膠(Affi-GelBlueFastFlow,Pharmacia),(豬心肌肌紅蛋白(本實驗室自制)，EDTA(Amresco公司)，NADH(purity98%,Amresco公司)，磷酸鹽、K4Fe(CN)6等為國產分析純，透析袋(14000CoMW)，聚乙二醇，考馬斯亮藍試劑盒，其它試劑均為分析純。主要儀器Spectrumlab54紫外可見分光光度計(上海)、722分光光度計(上海)、FJ-200高速分散勻質機(上海)、PHS-3C型精密pH計(上海)、JB22型恒溫磁力攪拌器、超級恒溫水浴鍋(上海)、生化溫冰箱(REVCO，USA)、LGR10-4.2冷凍高速離心機(北京)、超低溫冰箱(REVCO，USA)、CXG-1電腦恒溫層析系統(上海)、DYY-12型電泳儀和電泳槽、CS-卯OODual-wavelengthFlying-spotscanner(SHIMADZU，JAPAN)方法(1)粗提取去除脂肪和結締組織的新鮮豬心，切成小塊，用冰冷的生理鹽水沖洗，除去殘留的血液。再剁碎，每克肉樣加2mL冷水，在冰浴條件下，用FJ-200高速分散均質機勻漿6090s，粗勻漿用2NNH40H將pH值調至7.5，靜置約30min，13700g離心20min，得上清液。(2)鹽析及透析上清液加入固體硫酸銨至40。/。飽和度，pH值調至7.5，攪動30min，4。C下靜置23h后，13700g離心20min，棄沉淀。上清液加入固體硫酸銨至70%飽和度，pH值調至7.5，攪動30min,4t:下靜置23h后，13700g離心20min。沉淀物先在水中透析后，濃縮至一定體積，于0.002M磷酸緩沖液中(pH6.0)充分透析，22OOOg離心30min，棄沉淀，保留上清液。(3)陰離子交換層析(DEAE-SepharoseFastFlow)將透析液上樣到用0.002M磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含O.OOIMEDTA)平衡的DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析柱(3X20cm)，用同樣的緩沖液冼脫雜蛋白，流速為30ml/h，2ml/管，再用0.002M磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含0.001MEDTA)和0.2M磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含0.001MEDTA)進行梯度洗脫，流速為20ml/h，3m1/管。層析圖譜如圖l，收集合并酶活性部分，濃縮。(4)陽離子交換層析(CM-SephadexFastFlow)將濃縮一定體積的酶液在0.02M磷酸緩沖液(pH6.0)中透析，22OOOg離心30min后，將透析液上樣到用0.02M磷酸緩沖液(pH6.0)平衡過夜的CM-SephadexFastFlow陽離子交換層析柱(2X20cm);用同樣的緩沖液洗脫雜蛋白,流速為20ml/h，待洗脫完后,用0,2M磷酸緩沖液(pH6.0)洗脫，流速為30ml/h，3ml/管。層析圖譜如圖2，收集合并酶活性部分，濃縮。(5)藍色瓊脂糖FastFlow親和層析(A伍-GelBlueFastFlow)將濃縮的上述酶液在0.03M磷酸鹽緩沖液(pH6.0，含0.001MEDTA)中透析,22OOOg離心30min后，將上清液上樣到用同樣緩沖液平衡親和層析柱(0.4X2cm柱)；用0.03M磷酸鹽緩沖液(pH6.0，含0.001MEDTA)洗脫雜蛋白，流速為12ml/h,待洗脫完后，用0.03M磷酸緩沖液(pH6.0，含0.001MEDTA)和同樣的緩沖液(含l.OMNaCl)進行線性梯度洗脫，流速為18ml/h，2ml/管。層析圖譜如圖3,收集合并酶活性部分。(6)將得到的純品于0.002M磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含0.001MEDTA)中透析，冷凍干燥后，于-8(TC保存。實施例2:高鐵肌紅蛋白還原酶的定性與定量實施例1中(1)-(5)步驟得到的粗提樣品、經硫酸銨鹽析樣品、經陰陽離子交換層析樣品和經親和層析處理樣品進行SDS-PAGE和PAGE電泳試驗，電泳圖見圖4。將SDS-PAGE電泳后凝膠用CS-卯OO凝膠分析軟件(A=595nm;WXH:0.05X2.0mm)進行條帶掃描定量分析，結果見圖6。從圖6中可以看出，粗提樣品和經40%70%硫酸銨分段鹽析后含有的蛋白種類較多，且蛋白之間不能很好分開；經陰陽離子交換層析后，大致可以看到2個條帶，條帶也較清晰，且MetMbR所對應條帶濃度最高，經掃描可知MetMb的相對含量已經達到了68.01%;最后經親和層析后，經過SDS-PAGE和PAGE兩種檢測最后都得到單一蛋白酶帶，表明高鐵肌紅蛋白還原酶達到了電泳純，含量大于98%(圖6)，此蛋白的分子量在46KDa左右(圖5)。將親和層析后得到的酶液，通過分光光度計在波長為580nm處，掃描測定酶活性(表1)，由此判定該蛋白為純的高鐵肌紅蛋白還原酶。表l高鐵肌紅蛋白還原酶純化結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1、一種從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白還原酶的方法，包括以下步驟1)將新鮮動物心肌剁碎，加水勻漿處理，粗勻漿用2NNH4OH把pH調至7.5，靜置離心、過濾后得粗提液；2)粗提液經40％-70％硫酸銨鹽析，得到的沉淀用平衡緩沖液重懸，離心后取上清液對平衡緩沖液透析，透析膜的截留分子量為14000，得透析液；所說的平衡緩沖液是0.02M磷酸緩沖液，pH6.0；3)將透析液上樣到用緩沖液A平衡的DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析柱，用緩沖液A冼脫雜蛋白，再用緩沖液A和緩沖液B進行梯度洗脫，收集合并酶活性部分，濃縮透析；所說的緩沖液A是0.002M、pH7.0、含0.001MEDTA的磷酸鹽緩沖液；緩沖液BJ是0.2M、pH7.0、含0.001MEDTA磷酸鹽緩沖液；4)將得到的透析液上樣到用緩沖液C平衡過夜的CM-SephadexFastFlow陽離子交換層析柱；用緩沖液C洗脫雜蛋白，洗脫完后，用緩沖液D洗脫，收集合并酶活性部分，透析濃縮；所說的緩沖液C是0.02M、pH6.0磷酸緩沖液，所說的緩沖液D是0.2M、pH6.0磷酸緩沖液；5)將具有酶活組分的洗脫液冷凍干燥后，上樣到用緩沖液E平衡的藍色瓊脂糖凝膠FF親和層析，用緩沖液E洗脫雜蛋白，最后用緩沖液E和含1.0MNaCl的緩沖液E組成的線性梯度洗脫，收集具有酶活組分的洗脫液，即得到純化的高鐵肌紅蛋白還原酶；所說的緩沖液E是0.03M、pH6.0、含0.001MEDTA磷酸鹽緩沖液。2、根據權利要求l所說的從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白還原酶的方法，其特征在于，還有步驟6):得到的高鐵肌紅蛋白還原酶液經透析后，冷凍干燥，-80"分裝保存。全文摘要本發明涉及一種蛋白酶的提取純化工藝，具體是從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白還原酶的方法。所說的從心肌中提取純化高鐵肌紅蛋白還原酶的方法是先從動物心肌中獲得粗提液，再經鹽析后，選用DEAE-FastFlow、CM-SephadexFF離子交換層析及藍色瓊脂糖凝膠FF三種層析介質，采用色譜法從豬心中分離和純化高鐵肌紅蛋白還原酶。本發明方法具有產品純度高，工藝簡單、成本低等優點，既可填補我國該生物試劑制備的空白，又具有較高的經濟價值。文檔編號C12N9/02GK101294148SQ200810123840公開日2008年10月29日申請日期2008年6月6日優先權日2008年6月6日發明者瑋王,金邦荃申請人:南京師范大學