專利名稱：：微生物催化法生產亞氨基二乙酸及其菌株的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物催化水解亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，及制備過程中所用的一林新菌林——糞產堿桿菌(j/Ca//ge"M/臟幽)ZJUTBIO。(二)
背景技術：
草甘膦，英文名Glyphosate,商品名農達、農民樂等，分子式C3H8N05P,分子量169.08，外觀為白色固體，不溶于有機溶劑，屬芽后內吸非選擇性高效廣譜滅生性除草劑，通過溶解雜草的葉直徑表面蠟質層，藥效迅速進入植物傳導系統產生作用，使雜草枯竭死亡，具有廣譜、低毒、無殘留、內吸傳導和優良的滅生性等特點，對植物無選擇性，一般所有綠色植物，無論是作物還是雜草，著藥后即被殺傷。近年來，草甘膦一直是全球產量最大的農藥原藥除草劑品種，占據世界農藥銷售額首位，且每年以20%左右的速度遞增，預計2010年全^求需求量將達100萬噸。目前，世界農藥市場銷售額高達300億美元左右，全球除草劑共約有600個品種，其中草甘膦占全球除草劑總量高達30%,市場銷售額約為150億美元，占整個農藥市場的50%。美國孟山都(Monsanto)化學公司于20世紀60年代篩選合成了草甘膦，由于該產品能殺死大多年生深根性難除雜草，低毒、無殘留、在動物和水生物中不積累，入土后隨微生物降解，不會造成土壤及地下水的污染等優異特點，因此一經問世即引起世界農業界的廣泛關注。孟山都公司多年來將草甘膦當作主導產品之一，在美國、西歐、南美等地投入數十億美元，建立了幾套萬噸級的原藥生產廠，年產量20萬噸以上，在世界許多地區相繼建立了制劑調配廠。2001年孟山都草甘膦專利到期后，我國企業憑借自有技術迅速發展和數家萬噸級草甘膦生產企業的優勢，已占據世界草甘膦市場的20%左右份額。草甘膦的合成工藝路線很多，但歸納起來，目前國內外在工業生產上采用的合成路線主要是兩條亞氨基二乙酸路線(IDA法)和甘氨酸路線。IDA法是用亞氨基二乙酸(IDA)在強酸環境下(31%鹽酸)與亞磷酸、曱醛縮合反應生成雙甘膦(PMIDA),PMIDA再氧化生成草甘膦。反應原理<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>IDA法由于具有具有流程短、收率高和不產生污染等諸多優勢，該法生產的草甘膦占世界草甘膦生產總量75%。應用IDA法的主要公司是美國孟山都公司。上世紀90年代中后期，孟山都專利到期后國內仿制出IDA路線，由于IDA法生產的草甘膦易于進入歐美市場，因此最近幾年來國內新建企業幾乎都是采用IDA路線。IDA法生產草甘膦的關鍵原料為亞氛基二乙酸，IDA的制備有4種方法氯乙酸法、二乙醇胺脫氬氧化法、氬氰酸法、亞氨基二乙腈化學水解法。1、氯乙酸法氯乙酸法是國內最早研究和投產的IDA生產方法，用氯乙酸和NH3、Ca(OH)2反應制得IDA鈣鹽，再用鹽酸酸化即可得IDA。由于收率低(70%左右)，產品含量低，對環境污染大、勞動條件差、生產規模小。已遭淘汰。2、二乙醇胺法用二乙醇胺在高壓、催化劑作用下與NaOH溶液反應脫氫，得到亞氨基二乙酸二鈉鹽(MSIDA),再用濃鹽酸酸化制取IDA。反應原理如下,CH2CH2OHCH2COONaHNZ+2NaOH^HN\+4H2f\CH2CH20HCH2COOMaCH2COONaCH2COOHH<+2HC1~~H(+2NaClCH2COONaCH2COOH該工藝優點是IDA收率高，產品獲國際認可，副產物H2可回收利用。缺點是原料二乙醇胺主要依賴進口，由于2004年底二乙醇胺反傾銷后，成本大幅提升，導致此工藝盈利能力下降，價格高；需要高壓反應釜，設備投資大，安全要求高，能耗大。3、氫氰酸法用HCN、0120和(CH2)6N4經過縮合、水解、酸化等反應，制得IDA。該工藝是HCN由天然氨和氯合成，濃度較低，HCN劇毒，操作難度大。氫氰酸法是國外主要采用的工藝，國內氫氰酸的原料來源存在問題，該法在我國未得到發展。4、亞氨基二乙腈化學水解法用NH(CH2CN)2經在催化劑作用下經NaOH堿解、濃鹽酸酸化合成IDA。該工藝反應原理如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>亞氨基二乙腈化學水解法是近幾年才發展起來的一種路線，與乙醇胺路線相比，成本低，亞氨基二乙腈廉價易得，所以亞氨基二乙腈法將逐漸成為國內合成IDA的主導工藝，目前亞氨基二乙腈法制備IDA都是采用化學水解法。但這種方法存在的問題是用化學水解法制備1噸亞氨基二乙酸用濃鹽酸酸化至少產生廢水6噸。而且廢水中還含有NH(CH2COONa)2和Na2S04等難處理的鹽類。該法能耗高、反應條件苛刻，而且對i殳備要求高、生產成本高、對環境污染嚴重。采用微生物腈水解酶可能快速地將亞氨基二乙腈水解成亞氨基二乙酸。有望開發反應條件溫和、高效、操作簡便和對環境友好的生物催化法新工藝，克服化學水解法存在的缺點，在提高經濟效益的同時，減小環境污染，降低能耗。目前國內外尚沒有生物催化水解亞氨基二乙腈生產草甘膦中間體亞氨基二乙酸的報道。
發明內容為克服上述技術的缺陷，本發明提供了一種微生物催化水解亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，及制備過程中所用的一林新菌林——糞產堿桿菌(々ecato)ZJUTB10。本發明采用的技術方案是一種微生物催化水解亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸的方法，所述方法包括在以亞氨基乙腈為底物、以糞產堿桿菌ZJUTBIO培養獲得的腈水解酶為催化劑的反應體系中，于pH6.0~9.0、1060°C下進行水解反應，得到所述亞氨基二乙酸。糞產堿桿菌ZJUTBIO可發酵得到腈水解酶，在通過腈水解酶生物催化水解亞氨基二乙腈得到產物亞氨基二乙酸，反應式如CH2CN月青zR解酷^CH2COOHHN、+4H20-^<+訓CH2CN、CH2COOH亞氨基二乙腈亞氨基二乙酸糞產堿桿菌(j/ca"ge"^/aecafc)ZJUTB10,保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，430072，保藏編號CCTCCNo:M208168,保藏日期2008年10月22日。該菌4朱由浙江工業大學生物工程研究所從土壤中分離獲得。所述反應體系中底物亞氨基乙腈初始濃度為0.050.2mol/L。反應過程中，當底物濃度低于0.01M時，可以繼續補入底物亞氨基乙腈至亞氨基乙腈濃度為0.05~0.2mol/L,以達到連續生產的效果。所述腈水解酶存在于菌體細胞中，具體制備時，可直接將發酵獲得的含菌體細胞的發酵液作為催化劑參與反應，也可將菌體細胞分離后，作為催化劑參與反應。本發明中所述腈水解酶來自糞產堿桿菌ZJUTBIO培養獲得的含酶細胞，每10ml反應體系添加所述含酶濕細胞量為0.10.5g(其酶活約為525U/g濕細胞)，反應體系中亞氨基乙腈的濃度為0.05~0.2M。酶活的定義lh轉化亞氨基二乙腈生成1jaM亞氨基二乙酸所需的酶量定義為一個酶活單位(U)。具體的，所述含酶細胞由如下方法制備得到糞產堿桿菌ZJUTBIO接種至適用于糞產堿桿菌的發酵培養基，于2040。C下培養2496小時，并在培養開始o~6小時時間內加入終濃度為0.1%0.5%的誘導劑，所述誘導劑為下列之一正丁腈、異丁腈、己內酰胺，培養得到的發酵液經離心或膜分離，得到所述含酶細胞。所述適用于用于本發明菌種糞產堿桿菌ZJUTB10的培養基，可以是一些含有可以被糞產堿桿菌利用營養物質的常規培養基，液體、固體均可，但是大量工業化生產時，液體培養基較為合適。培養基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、無機鹽等。作為碳源的有葡萄糖，醋酸銨，乙腈，乙酸，乳酸，檸檬酸鈉；作為氮源的有肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米漿、蛋白胨、尿素、氨鹽(硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、醋酸胺等)；另可加有氨基酸類(如谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、甘氨酸、曱硫氨酸等)、微生素(VBi、VB2、VB12、Vc、VE、煙酸等)、核酸類(如噪呤、嘧啶及其衍生物等)。用無機酸或有機酸、堿類調節培養基的pH值，還可加入適量的消泡劑，如泡敵等。本發明中，所述適用于糞產堿桿菌的發酵培養基組成如下醋酸銨0.5%~2.0%，酵母膏0.3%~0.8%,K2HP040.3%~0.8%，MgS040.01%~0.1%,FeSO40.001%~0.01%,NaCl0.05%0.5%,pH7.0~8.5。若沒有特別說明，本發明中百分比濃度均是質量體積百分比濃度(w/v),某組分百分比濃度為1%是指lOOmL溶液中含有該組分lg。發酵培養可采用培養方式有靜置培養、搖動培養、或通風攪拌培養等，大量培養菌體時宜采用深層通風攪拌培養。所述發酵培養可在搖瓶中進行，也可在發酵罐中進行。搖瓶培養在三角瓶中裝入適量的發酵培養基(1070%,v/v),滅菌后用接種針挑入一定量的斜面菌種，在2040。C下，旋轉式搖床(100300rpm)中進行發酵培養，在培養06h的過程中，力口入0.1~0.5%的誘導劑，經過2496小時的發酵培養，獲得含腈水解酶的發酵液。發酵罐培養在種子罐中裝入適量的發酵培養基(40~70%，v/v)，滅菌后接入一定量的菌種，在溫度2040。C，攪拌轉速100300rpm的條件下培養24~72小時，得到種子液，在50L20M3的發酵罐中裝入適量的發酵罐發酵培養基(4070%,v/v),實罐消毒后接入210%(v/v)的種子液，在通氣比0.1-1:1(每分鐘內通過的空氣體積與培養液體積之比)，攪拌轉速100300rpm，溫度2040°C的條件下進行發酵培養，在培養06h的過程中，加入0.1%0.5%的誘導劑，經過648小時的發酵培養，獲得含腈水解酶的發酵液。誘導劑可以是正丁腈、異丁腈、己內酰胺。得到菌體培養液后可采用離心或過濾等方式分離出菌體細胞，利用該微生物細胞或固定化細胞或從該細胞中分離出的腈水解酶催化亞氨基二乙腈制備亞氨基二乙酸。發酵液經過離心或膜過濾系統進行酶細胞菌體的收集，用濕菌體或其固定化細胞作為酶源，然后制備生物催化劑。發酵液在分離因素(離心機旋轉起來，在離心機轉鼓壁上進行分離的物料受到的離心加速度和地球重力加速度g的比值fe3000的條件下離心，棄去上清液，細胞用去離子水洗滌后在離心，收集濃縮的濕細胞；或者發酵液用膜過濾系統進行膜分離過濾，并加入2倍發酵液體積的去離子水洗滌，收集濃縮的濕細胞，收集的含酶細胞可以直接作為催化劑。其中的膜過濾系統可以是中空纖維膜或巻式膜或陶瓷膜或超濾膜。亞氨基二乙腈溶液的生物催化反應可在水或pH69的磷酸鹽緩沖液或水-有機介質或微水有機反應介質中加入生物催化劑，加入底物亞氨基二乙腈進行反應，pH控制在6.0-9.0之間，反應溫度控制在1060。C之間，攪拌速度控制在50500rpm之間。反應方式可以是批式反應或者連續式反應。在批式反應中底物可一次性加入，或者間歇分多次加入，或流加，在任何時刻都必須保證底物的加入量不會使反應液中的底物濃felM,反應時間根據反應的具體情況而定，反應結束時應保證底物濃度盡可能低，這可以通過停止加料后延長反應時間，或通過補加少量生物催化劑反應一段時間來達到這一要求，反應結束后通過離心或膜過濾系統分離得到反應清液；在連續反應中，底物可一次性加入，或間歇分多次加入，或流加，在任何時刻都必須保證底物的加入量不會使反應液中的底物濃度三1M,當產物濃度累積達到一定值20.09M(以亞氨基二乙酸計)時，可通過膜過濾系統一次性，或者分多次間歇地，或者連續地分流出反應清液，同時可一次性，或者間歇分多次地，或者連續地不加反應介質和底物，并根據反應情況，可一次性，或者間歇分多次地。或者連續性的補加新的生物催化劑，以保證反應可連續進行。具體的，所述應用方法如下(1)糞產堿桿菌ZJUTB10接種至種子培養基，30°C、200rpm下培養24小時，得到種子液；所述種子培養基組成如下醋酸4妄1%,酵母膏0.5%,K2HP040.5%,MgS040.02%,FeS040.003%,NaC10.1%,pH7.5;(2)發酵培養基以6%體積比接種量接種種子液，30。C下進行培養，于培養開始6小時時加入終濃度為0.3%的正丁腈，發酵培養總時間4896小時，得到發酵液；所述發酵培養基組成如下醋酸銨1%,酵母膏0.5%,K2HP040.5%，MgS040.02%,FeS040.003%,NaC10.1%，pH7.5;(3)取發酵液，膜過濾分離得到的菌體細胞以去離子水洗滌，得到細胞液，取細胞液以去離子水稀釋至細胞濃度為10~50g/L,加入底物亞氨基乙腈至亞氨基乙腈濃度為0.05~0.2mol/L,于2040°C、100300rpm下進行水解反應2472小時，水解反應結束后，于水解液中得到所述亞氨基二乙酸。本發明中產物的分析測定方法取0.1mL水解液，力。1mL0.5mol/L的NaHC03溶液、0.4mL1%的2，4-二硝基氟苯-乙腈溶液和lmL蒸餾水，在60。C下避光反應30min后，衍生化完后，再加7.5mL0.2mol/LpH為7的磷酸緩沖液。然后進行HPLC分析4全測，色譜柱EliteCl8色譜柱(250nmx4.6nm);流動相曱醇乙酸-乙酸鈉水溶液(曱醇與乙酸-乙酸鈉水溶液體積比為55:45，乙酸、乙酸鈉物質的量濃度均為0.05mol/L);流速1.0mL/min;-險測波長為365nm;柱溫為30°C。本發明技術與現有的技術比較具有明顯的優點1)廢水產量少。用化學水解法制備1噸亞氨基二乙酸如果用濃硫酸酸化至少產生廢水5噸，用濃鹽酸酸化至少產生廢水6噸。而且濃碌u酸酸化法廢水中還含有NH(CH2COONa)2和Na2S04等難處理的鹽類。如果用腈水解酶生物催化法生產亞氨基二乙酸，廢水中難處理的雜質含量少，更利于實現清潔生產。2)反應條件溫和。化學水解法需要在100。C左右進行，必須配備加熱和溫控裝置，反應條件苛刻，能耗高而且對設備要求高。而生物催化法一般都是在常溫下進行，反應條件溫和設備成本相對較低。3)成本低。化學水解法的原料除了亞氨基二乙腈外還有NaOH濃溶液、濃^^酸或濃鹽酸，所需原料多；生產成本高而生物催化法一:l殳只需亞氨基二乙腈作為原料和產腈水解酶細胞作為催化劑，轉化率和產率都可達95%以上，原料簡單易得，轉化率高，成本低。本發明的有益效果主要體現在反應過程中廢水產量少，污染少；反應條件溫和、能耗低；成本低，轉化率高、產率高，易于工業化生產。具體實施方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1:糞產堿桿菌(j/ca//gwes/aecafc)CCTCCNo:M208168的搖瓶發酵培養。分別配制搖瓶發酵培養基A、B、C、D，其培養基組成如下A:醋酸銨0.5%，酵母膏0.3%,K2HPO40.3%,MgSO40.01%,FeS040.001%,NaC10.05%，用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH調節到7.0。B:醋酸銨1%,酵母膏0.5%,K2HPO40.5%，MgSO40.02%,FeS040.003%,NaC10.1%,用2M的鹽酸或2M的氬氧化鈉將pH調節到7.5。C:醋酸銨2.0%,酵母膏0.5%，K2HPO40.8%,MgSO40.05%，FeS040.003%,NaCl0.03%,用2M的鹽酸或2M的氪氧化鈉將pH調節到8.0。D:醋酸銨2.0%,酵母膏0.8%,K2HPO40.8%,MgSO40.1%，FeS040.01%,NaC10.5%,用2M的鹽酸或2M的氬氧化鈉將pH調節到8.5。分別將以上配制好的培養基以lOOmL—份倒入4個250mL搖瓶中，121。C滅菌20分鐘。冷卻室溫后分別接種糞產堿桿菌(爿/^//取"^1/^<^/&)CCTCCNo:M208168到各個培養基中，于30。C，200rpm轉速下培養，在培養剛開始時加入0.3g的己內酰胺作為誘導劑，發酵培養48h結束。發酵培養結束后，分別收集發酵液，6000卬m離心收集菌體，分別稱取O.lg濕菌體置于含有105mM亞氨基乙腈的10ml反應體系中，在30。C和200rpm的攪拌速度下反應4h，加入濃鹽酸溶液終止反應，通過HPLC方法測定反應液中亞氨基二乙酸的量，計算出每克濕細胞中的酶活(U),得到的結果見表l:表l:搖瓶發酵液的濕細胞酶活<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實施例2:糞產石成桿菌(v4/ca^gew&y/"ec"fc)CCTCCNo:M208168的發酵罐發酵培養配制種子培養基醋@吏銨1%,酵母膏0.5%,K2HPO40.5%,MgS040.02%,FeS040.003%，NaCl0.1%，用2M的鹽酸或2M的氬氧化鈉將pH調節到7.5。分別配制發酵罐發酵培養基a、b、c、d,其發酵培養基組成如下a:醋酸銨0.5%,酵母膏0.3%,K2HPO40.3%,MgSO40.01%,FeS040.001%,NaC10.05%,用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH調節到7.0。b:醋酸銨1%，酵母膏0.5%，K2HPO40.5%，MgSO40.02%,FeS040.003%,NaC10.1%,用2M的鹽酸或2M的氬氧化鈉將pH調節到7.5。c:醋酸銨2.0%,酵母膏0.5%,K2HPO40.8%,MgSO40.05%，FeS040,003%,NaC10.03%,用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH調節到8.0。d:醋酸銨2.0%,酵母膏0.8%,K2HPO40.8%,MgSO40.1%,FeS040.01%,NaCl0.5%,用2M的鹽酸或2M的氫氧化鈉將pH調節到8.5。在5L種子罐中裝入3L的種子培養基，滅菌后接入菌種，在溫度30°C，攪拌轉速200rpm的條件下培養24h，得到種子液；在50L的發酵罐中裝入發酵培養基30L,實罐消毒后接入1.8L的種子液，在通氣比0.3:1,攪拌轉速150rpm,罐壓0.05Mpa,溫度30。C的條件下，在培養到6h時加入90g的正丁腈作為誘導劑，發酵培養過程中每隔24h分別收集發酵液，6000rpm離心收集濕菌體細胞測定酶活(測定方法同實施例l),結果見表2。表2.發酵罐發酵液濕細胞的酶活<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實施例3:發酵液離心或膜過濾取實施例2中b培養基發酵得到的發酵液2L,分別用低溫高速離心機離心(在4。C，12000rpm轉速下離心15min)、中空纖維膜過濾(流量150mL/min,壓力0.8Kg/cm2)、巻式膜過濾(流量150mL/min,壓力16Kg/cm2)、陶覺膜過濾(流量150mLZmir"壓力4Kg/cm2)或平板超濾膜(Ultra-fla)過濾(流量150mL/min，壓力3Kg/cm2)方法處理發酵液。然后用4L去離子水洗滌細胞，收集濕細胞測定酶活(測定方法同實施例1)，結果見表3。表3:發酵液處理后的濕細胞酶活發酵液的處理方法處理后的含酶濕細胞酶活U/g<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例4:取實施例3低溫高速離心處理方法得到的濕菌體分別加入lOOmL水中，使濕菌體的濃度為30g/L,加入不同量的底物亞氨基二乙腈，使亞氨基二乙腈的最終濃度分別為0.01M,0.05M，O.IM，0.15M，0.2M。于30。C和200rpm條件下反應24h，用HPLC測定方法測定反應液中亞氨基二乙酸的濃度。結果見表4:表4:濃縮細胞在不同底物濃度下的催化活性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例5:取實施例3低溫高速離心處理方法得到的濕菌體3g,分別加入lOOmL水中，濕菌體的濃度為30g/L，，各加入底物終濃度為0.2M的亞氨基二乙腈，分別在20。C,30°C,40。C條件下，200rpm轉速反應96h。用HPLC測定方法測定反應液中氨基二乙酸的濃度。結果見表5。表5:濃縮細胞在不同的溫度條件下的催化活性溫度(°c)反應結束后轉化體系中亞氨基二乙酸的濃度(mM)201403019540180實施例6:取按照實施例3中空纖維膜過濾處理方法得到的濃縮細胞，用不同pH的磷酸鹽緩沖液稀釋至2L,濕細胞濃度約為30g/L,分別取50mL,各加入終濃度為0.1M的底物亞氨基二乙腈，于30。C和200rpm條件下反應48h,用HPLC測定方法測定反應液中亞氨基二乙酸的濃度。結果見表6。表6.濃縮細胞在不同的pH條件下的催化活性pH反應結束后轉化體系中亞氨基二乙酸的濃度(mM)684799899971實施例7:取按照實施例3陶瓷膜過濾方法得到的含酶細胞40g,用2L水稀釋，裝入于3L的三口反應瓶中，加入底物亞氨基二乙腈的濃度為0.05M,于30°C和200rpm條件下反應，通過HPLC色語跟蹤分析，當底物濃度低于O.OIM時，加入底物亞氨基二乙腈，使其終濃度達到0.05M;反應72小時，底物累計加入次數為9次，反應后HPLC色譜分析反應結果，底物亞氨基二乙腈殘留濃度〈0.01M,終產物濃度0.4M，亞氨基二乙酸產率89.5%。權利要求1.一種微生物催化制備亞氨基二乙酸的方法，所述方法包括在以亞氨基乙腈為底物、以糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTB10培養獲得的腈水解酶為催化劑的反應體系中，于pH6.0～9.0、10～60℃下進行水解反應，得到所述亞氨基二乙酸。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述反應體系中底物亞氨基乙腈初始濃度為0.050.2mol/L。3.如權利要求2所述的方法，其特征在于反應過程中底物亞氨基乙腈濃度低于0.01mol/L時，繼續補入底物亞氨基乙腈至亞氨基乙腈濃度為0.050.2mol/L。4.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述腈水解酶來自糞產堿桿菌ZJUTB10培養獲得的含酶細胞，所述含酶細胞添加量以含酶細胞濕重計為10~50g/L。5.如權利要求2所述的方法，其特征所述反應在水中或pH69的磷酸鹽緩沖液中進行。6.如權利要求3所述的方法，其特征在于所述含酶細胞由如下方法制備得到糞產堿桿菌ZJUTB10接種至適用于糞產堿桿菌的發酵培養基，于2040。C下培養2496小時，并在培養開始06小時時間內加入終濃度為0.1%~0.5%的誘導劑，所述誘導劑為下列之一正丁腈、異丁腈、己內酰胺，培##到的發酵液經離心或膜分離，得到所述含酶細胞。7.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述適用于糞產堿桿菌的發酵培養基組成如下醋酸銨0.5%2.0%，酵母膏0.3%~0.8,K2HP040.3%0.8%,MgS040.01%~0.1%，FeS040.001%~0.01%，NaCl0.05%~0.5%,pH7.08.5。8.如權利要求l所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)糞產堿桿菌ZJUTB10接種至種子培養基，30°C、200rpm下培養24小時，得到種子液；所述種子培養基組成如下醋酸4妄1%，酵母膏0.5%,K2HPO40.5%,MgSO40.02%,FeS040.003%，NaCl0.1%,pH7.5;(2)發酵培養基以6%體積比接種量接種種子液，30。C下進行培養，于培養開始6小時時加入0.3°/。的正丁腈，發酵培養總時間4896小時，得到發酵液；所述發酵培養基組成如下醋酸銨1%,酵母膏0.5%,K2HPO40.5%,MgSO40.02%，FeS040.003%，NaCl0.1%,pH7.5;(3)取發酵液，膜過濾分離得到的菌體細胞以去離子水洗滌，得到細胞液，取細胞液以去離子水稀釋至細胞濃度為10~50g/L，加入底物亞氨基乙腈至亞氨基乙腈濃度為0.05~0.2mol/L,于20~40°C、100~300rpm下進行水解反應2472小時，水解反應結束后，于水解液中得到所述亞氨基二乙酸。9.糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTBIO，保藏于中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，430072,保藏編號CCTCCNo:M208168,保藏日期2008年10月22日。全文摘要本發明公開了一種生物催化生產草甘膦合成的關鍵中間體亞胺基二乙酸的方法及其過程中所用的新菌株，本方法以亞胺基二乙腈為原料，以通過發酵培養糞產堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)ZJUTB10而得到的具有腈水解酶活性的微生物酶為催化劑，在一定的條件下進行水解反應，得到產物亞胺基二乙酸。本發明的有益效果主要體現在反應過程中廢水產量少，污染少；反應條件溫和、能耗低；成本低，轉化率高、產率高，易于工業化生產。文檔編號C12P13/00GK101392276SQ20081012219公開日2009年3月25日申請日期2008年11月10日優先權日2008年11月10日發明者徐建妙,柳志強,沈寅初,薛亞平,鄭裕國申請人:浙江工業大學