專利名稱：：用于鑒定寄生曲霉和黃曲霉的引物序列及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及用于鑒定寄生曲霉和黃曲霉的引物序列及其鑒定方法。
背景技術(shù)：
：曲霉屬真菌寄生曲霉(Apergz7/ws;"raw'"cw)和黃曲霉(A^"v附)表型特征相近且都可產(chǎn)生嚴(yán)重致癌代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素。黃曲霉毒素是迄今發(fā)現(xiàn)的污染農(nóng)產(chǎn)品毒性最強的一類生物毒素。其中，毒性最強、危害最大的為黃曲霉毒素Bl,其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，被列入嚴(yán)管的特劇毒物質(zhì)。農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素污染已成為影響食品安全和危害人們身體健康的隱形殺手。目前對寄生曲霉和黃曲霉的鑒定十分困難，主要采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法，根據(jù)分生孢子梗的排列方式、分生孢子的形狀、分生孢子壁的厚度和光滑程度及菌落在一系列培養(yǎng)基(察氏培養(yǎng)基(CZ)、黃曲霉鑒別培養(yǎng)基(AFPA)和椰漿培養(yǎng)基(CCA))上的顏色和形態(tài)來加以鑒定區(qū)分。已有大量研究報道了產(chǎn)毒素黃曲霉菌抹的檢測方法，但從未報道過寄生曲霉和黃曲霉的分子鑒定方法。傳統(tǒng)的鑒定方法費時、費力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了用于鑒定寄生曲霉和黃曲霉的引物序列，該引物特異性高，能夠快速鑒定寄生曲霉和黃曲霉。用于鑒定寄生曲霉和黃曲霉的引物序列，包括兩組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO:l所述的堿基序列，笫一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO:2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO:3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO:4所述的堿基序列。寄生曲霉和黃曲霉共有糖利用基因簇中的g/W基因序列，而其它真菌沒有該基因序列，第一組引物就^/"基因序列中部分序列，利用第一組引物對寄生曲霉和黃曲霉的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，可得到745-bp的DNA片斷，對其它真菌的DNA進(jìn)行PCR擴增則不能得到任何DNA片斷。寄生曲霉能產(chǎn)生Bl、B2、Gl和G2四種毒素，黃曲霉只能產(chǎn)生Bl和B2兩種毒素，對產(chǎn)毒寄生曲霉和產(chǎn)毒黃曲霉的毒素合成基因簇進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)毒黃曲霉中的毒素合成基因"oW、c》;/W或它們兩者之間的間隔序列發(fā)生缺失，而產(chǎn)毒寄生曲霉則含有完整的毒素合成基因簇。如圖1所示，產(chǎn)毒黃曲霉在"o^和cyp4間存在兩種缺失類型(I和II):缺失類型I:產(chǎn)毒黃曲霉缺失的1-280位氨基酸、qy/W基因的1-112位氨基酸以及mr^和cy/W的間隔區(qū)。缺失類型II:產(chǎn)毒黃曲霉缺失wo^基因的1-181位和300-310位氨基酸、c用j基因的1-29位氨基酸和ww5和qyp^的間隔區(qū)(如圖1所示)。第二組引物就是兩種缺失類型產(chǎn)毒黃曲霉的共有缺失片段的部分序列，利用第二組引物對寄生曲霉基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，可以得到462-bp的DNA片段，對其它真菌或黃曲霉的DNA進(jìn)行PCR擴增則不能得到任何DNA片斷。本發(fā)明還提供了一種利用上述引物序列鑒定寄生曲霉和黃曲霉的方法，包括以下步驟(1)提取待測菌的DNA;(2)以待測菌的DNA為模板，使用第一組引物和第二組引物進(jìn)行PCR擴增；(3)PCR產(chǎn)物凝膠電泳后用EB顯色，根據(jù)凝膠上的DNA條帶數(shù)量，判斷待測菌的類型；當(dāng)DNA條帶數(shù)量為2時，判定待測菌為寄生曲霉；當(dāng)DNA條帶數(shù)量為1時，判定待測菌為黃曲霉；當(dāng)DNA條帶數(shù)量為0時，判定待測菌為其它真菌或細(xì)菌。本發(fā)明提供了用于鑒定寄生曲霉和黃曲霉的引物序列，該序列特異性高，通過利用該引物序列通過PCR擴增鑒定寄生曲霉和黃曲霉，速度快，可靠性高，為研究黃曲霉毒素污染的土壤或農(nóng)作物中兩種真菌的分布和動態(tài)變化奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為黃曲霉毒素的治理提供科學(xué)依據(jù)。圖l為本發(fā)明引物序列在"o"-c^B基因序列上的位置圖譜；圖2為特異性檢測中各菌抹PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖"i普。具體實施方式所選菌林蕓苔鏈格孢(茲e畫"a6ra肌'認(rèn))、甘藍(lán)鏈格孢(」.6ra咖'c/co/")、尖孢鐮刀菌(Fw^Wwwcay^poraw)、禾谷鐮刀菌(Egramz'"ean/m)、小麥纟丈枯病菌(i/z/zotow'"cere"/^)灰葡萄孢(^Bo/7fe"'werea)、指狀青霉菌(Pew'c/〃/ww^g/tofww)、核果褐腐病菌(Mo"http:///"/a/n/"/co/a)以及3個寄生曲霉菌林(SD1-1、SX6-6和ZJHZ27)和5個黃曲霉菌抹(SD3-6、SD5-1、SX6-8、GS10-1和ZJHZ2)。上述菌株保藏于浙江大學(xué)生物技術(shù)研究所，也可通過常規(guī)的平板劃線分離純化得到，上述菌林只是作為實驗材料，當(dāng)然也可選擇其它菌抹，對本發(fā)明實施沒有影響。提取DNA用接種針從PDA平板上刮取菌絲(100mg)，置于1.5-mLEppendorf管中，加500pLDNA提取裂解液(200mMTris-HCl,50mMEDTA,20mMNaCl，l%SDS,pH8.0)，用電鉆充分研磨，振蕩混勻，室溫靜止10min;13200r/min4°C，離心5min;取上清液約400)iL于新的1.5-mLEppendorf管中，加750pL無水乙醇，混和混勻，13200r/min4°C，離心5min,棄上清；沉淀用70%乙醇洗滌，室溫放置干燥5-10min,溶于S0^iLTE(pH8.0),-20。C保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜龅?種真菌以及寄生曲霉和黃曲霉的DNA均采用上述方法提取。引物合成根據(jù)寄生曲霉和黃曲霉共有糖利用基因簇中的g/"基因序列，設(shè)計了引物組GLF1和GLR1;如
發(fā)明內(nèi)容中所述，相對于寄生曲霉的基因組DNA,黃曲霉的基因組DNA中的毒素合成基因"or5、和兩者之間的間隔序列發(fā)生缺失，缺失類型分為兩種，根據(jù)這兩種缺失類型的共同缺失片斷，設(shè)計了引物組NCF2和NCR2。上述引物的具體序列與序列表中序列對應(yīng)關(guān)系如下表所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述引物在"w^-c^B基因序列上物理位置如圖l所示。上述序列的引物由上海博彩合成，也可通過常規(guī)的引物合成方法合成。菌林鑒定以上述所有菌抹的DNA為模板，用GLF1/GLR1和NCF2/NCR2兩組引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)均包含一個陰性對照(用無菌水代替DNA模板)。25jiL反應(yīng)體系1^LDNA模板(約0.4ng),引物各0.2pmol廠1，dNTP0.2^imol「、MgCl22mmoll"，lx緩沖液(北京東勝公司生產(chǎn))，聚合酶L5U個單位，雙蒸水補足至25pL。反應(yīng)條件為95。C預(yù)變性3min，94。C變性30s，56。C退火30s,72°C延伸30s,進(jìn)行35個循環(huán)，最后72。C延伸5min。PCR產(chǎn)物用1.5。/。的瓊脂糖在lxTAE緩沖液中電泳后，用EB(溴化乙錠))顯色拍照。從電泳照片上看(如圖2所示)，寄生曲霉的擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后顯色，凝膠上顯現(xiàn)兩條DNA條帶，即745-bp和462-bp擴增產(chǎn)物；黃曲霉的擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后顯色，只顯現(xiàn)一條DNA條帶，即745-bp擴增產(chǎn)物，其它真菌的擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后顯色，凝膠上不顯現(xiàn)DNA條帶，即說明沒有擴增到任何產(chǎn)物。SEQUENCELISTING<110>浙江大學(xué)<120>用于鑒定寄生曲霉和黃曲霉的引物序列及其鑒定方法<130><160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)<400>1aagacacagtcatcgcctgtt21<210>2<211>20<212>DNA<213>寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)<400>2acgcctttatcgagccaata20<210>3<211>21<212>DNA<213>寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)<400>3attcgccaaacatctctccgt21<210>4<211>21<212>DNA<213>寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)<400>4cacagtcaaggccaccaacaa2權(quán)利要求1、用于鑒定寄生曲霉和黃曲霉的引物序列，包括兩組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO1所述的堿基序列，第一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO4所述的堿基序列。2、一種鑒定寄生曲霉和黃曲霉的方法，包括以下步驟(1)提取待測菌的DNA;(2)以待測菌的DNA為模板，使用第一組引物和第二組引物進(jìn)行PCR擴增；(3)PCR產(chǎn)物凝膠電泳后用EB顯色，根據(jù)凝膠上的DNA條帶數(shù)量，判斷待測菌的類型；當(dāng)DNA條帶數(shù)量為2時，判定待測菌為寄生曲霉；當(dāng)DNA條帶數(shù)量為1時，判定待測菌為黃曲霉；當(dāng)DNA條帶數(shù)量為0時，判定待測菌為其它真菌或細(xì)菌。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于鑒定寄生曲霉和黃曲霉的引物序列，包括兩組引物，第一組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO1所述的堿基序列，第一組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO2所述的堿基序列；第二組引物的正向引物具有序列表中SEQIDNO3所述的堿基序列，第二組引物的反向引物具有序列表中SEQIDNO4所述的堿基序列。本發(fā)明引物列特異性高，通過利用該引物序列通過PCR擴增鑒定寄生曲霉和黃曲霉，速度快，可靠性高，為研究黃曲霉毒素污染的土壤或農(nóng)作物中兩種真菌的分布和動態(tài)變化奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為黃曲霉毒素的治理提供科學(xué)依據(jù)。文檔編號C12Q1/04GK101376911SQ20081012149公開日2009年3月4日申請日期2008年10月8日優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日發(fā)明者尹燕妮,馬忠華申請人:浙江大學(xué)