專利名稱：一種用昆蟲卵建立細胞系的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物技術，尤其涉及一種用昆蟲卵建立細胞系的方法。
背景技術：
自1965年第一株昆蟲細胞系成功建立后至今，近40年的時間內，已經建 立的昆蟲細胞系超過500種。昆蟲細胞系作為研究材料， 一直是生理學、發育 生物學、細胞生物學、分子生物學和生物化學等科學研究的重要工具，而且昆 蟲細胞作為桿狀病毒表達載體系統的重要組成部分，表達了大量的具有重大經 濟意義或科學意義的外源蛋白質；同時作為生物反應器，擴增昆蟲桿狀病毒用 作生物殺蟲劑，特別是擴增含有外源基因的重組桿狀病毒殺蟲劑，昆蟲細胞也 發揮了重要的作用。
大量的來源于鱗翅目昆蟲商品化的細胞系已得到人們廣泛的應用。鱗翅目 的細胞系來源于很多組織，包括卵巢、胚胎、血細胞、脂肪體等。對于每一株 細胞系，無論是來自同一種昆蟲甚至同一個體，同一器官組織，在細胞系的建 立和細胞的培養過程中，都會出現不同程度的變異，其細胞生物學特性，對特 定桿狀病毒的感受性都有可能不同。因而科學家們根據研究的需要或某些商業 目的，會嘗試從不同種昆蟲，同一昆蟲不同器官組織中，建立和篩選各種類型 的細胞系，以滿足不同的需求。
傳統的昆蟲細胞系的建立方法，帶有很大的隨機性和不確定性。多將相應 的昆蟲器官或組織剪碎，或用胰蛋白酶把昆蟲組織消化，釋放出單個或成團的 細胞，放入特定的細胞培養液中培養，并定時更換培養液。昆蟲胚胎細胞系的 建立方法，多是將多個昆蟲卵粒用勻衆器研碎過濾后培養，對胚胎細胞傷害很 大。因此，細胞系建立成功與否隨機性很強，有很大的不確定性，多數情況下以失敗告終，而且這個過程很長， 一般一個細胞系建立成功需要1.5-2年甚至 更長時間。
發明內容
本發明的目的是提供一種用昆蟲卵建立細胞系的方法，其能夠快速、有效、 可重復地建立昆蟲細胞系。
為實現上述目的，本發明采用如下方法-
一種用昆蟲卵建立細胞系的方法，方法步驟如下
1) 將產下90—100小吋的昆蟲卵受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸 泡5—10分鐘后用無菌水清洗，再將卵粒用乙醇溶液消毒后用生理鹽水 Ringer' s清洗；
2) 將上述步驟處理后的卵粒倒入昆蟲細胞培養液中，逐 一 輕擠壓卵粒釋放出胚
胎；
3) 將歩驟2)得到的胚胎剪碎成組織塊，轉入密閉培養瓶中，放入25 28。C無光照的細胞培養箱中培養20 30小時；
4) 加入細胞培養液，使胚胎的組織塊完全或超半部分浸沒在該培養液中， 在與步驟3)同樣條件下培養；
5) 每7—15天更換培養液，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細胞充滿 了整個培養瓶；
6) 從培養瓶中吸出半量的細胞培養液，其中含有新增殖出的單個細胞， 放入新培養瓶中，并加入等量的新細胞培養液；而原培養瓶中再加入同吸出量 同樣多新的細胞培養液；將兩個培養瓶再放回培養箱中與歩驟3)同樣條件下培 養；得到昆蟲卵胚胎第一代傳代細胞，細胞系建立成功；
整個過程都是在無菌條件下進行的。
所述的昆蟲卵尤指鱗翅目昆蟲卵，如可以是楊扇舟蛾卵或美國白蛾卵、
春尺蠖卵。
本發明所使用的細胞培養液是常規采用的昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細胞培養液pH在6. 2-6.6之間。昆蟲細胞培 養液可以是各種商品化的昆蟲細胞培養瓶如1M-FH， Grace' s， TC_100， IPL-41， ExKMl 405等等。
本發明所使用的細胞培養液中青霉素與鏈霉素的含量各為50 100 U/mL; 動物血清含量為細胞培養液的體積比為5% 15%。
本發明的積極效果是本發明方法可以在短期內建立需要研究或生產用的 昆蟲細胞系，能夠提供大量的昆蟲細胞種類的來源，并供使用者篩選，使建立 細胞系成為實驗室的常規實驗方法成為可能。
具體實施例方式
本發明用昆蟲卵建立細胞系的方法具體步驟如下
(1) 將產下約四天(90— 100小時)的受精卵片放入10ral試管中，然后 用10%次氯酸鈉溶液浸沒約2-5分鐘并輕振蕩，倒掉次氯酸鈉溶液并用無菌水 清洗卵粒，倒掉無菌水后用75%乙醇溶液消毒卵粒10-20分鐘，期間不斷輕輕 振蕩，倒掉乙醇后用Ringer' s清洗卵粒; (2) 將卵粒倒入或用移液器移入裝有1-2nd的昆蟲細胞培養液中，在解 剖鏡下用彎頭眼科鑷逐一輕擠卵粒釋放出胚胎；
(3) 用移液器輕輕轉移胚胎入另一裝有0. 5mL昆蟲細胞培養液的培養皿 中，用眼科剪將胚胎剪碎，長度約l-2mm。用移液器將胚胎組織塊轉入含有0. 5mL 細胞培養液潤洗過的細胞培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27'C無光照的細胞培養箱 中培養24小時；
(4) 加入適量的細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中， 在與步驟(3)同樣條件下培養；
(5) 每7—15天吸出半量的培養液，并同時換入半量新的細胞培養液， 直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細胞充滿了整個培養瓶；
(6) 把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培 養瓶中，并加入新的細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多新的細胞培養液，兩個培養瓶放入培養箱中培養，細胞開始傳代，細胞 系建立成功；
整個過程都是在無菌條件下進行的。
本發明方法所使用的細胞培養液是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素和胎 牛血清的混合物，配成的細胞培養液pH在6.2-6. 6之間。其中所述的昆蟲細 胞培養液選自商品化的昆蟲細胞培養液TNM-FH， Grace， s， TC-100， IPL-41， 或Ex-Cell 405中的任何一種，優選TNM-FH;青霉素含量為50— 100U/mL，優 選100U/mL;鏈霉素含量為50— 100U/mL，優選100U/mL;胎牛血清含量為細胞 培養液的5 — 20 '。(體積比)，優選10%。
以下可以通過實驗來說明優選方案的確立
① 選取TNM-FH， Grace' s， TC-100， IPL-41, Ex-Cell 405五種細胞培 養液進行楊扇舟蛾胚胎細胞原代培養，每種培養液培養三瓶，用TNM-FH培養 的三瓶比用其他幾種培養液較快游離出細胞，并且成功建立成系。其他幾種培 養液在最初三個月有生長，但沒有成功建立成系。
② 加5%胎牛血清時組織中細胞游離出來較慢(一個月左右)；加10%胎牛 血清時組織中細胞游離出來較快(一周左右)，而且較快建成細胞系。加15% 胎牛血清時培養液容易結晶，不利細胞生長。
相對于傳統的細胞系建立方法，本發明方法的細胞系建立過程由通常的耗 時1.5-2年縮減到1-3個月，其優勢非常明顯，而且重復性很強，用同樣方法 建立同樣昆蟲組織的細胞系，在預定的時間內可以使細胞傳代，因而大大提高 了昆蟲細胞系建立的效率。第一次傳代以后，根據細胞生長增殖的情況，用傳 統培養昆蟲細胞系的方法對細胞進行分瓶傳代處理。根據不同細胞系的特性， 細胞系的生長將在第一次傳代l-3個月后達到穩定狀態。此時可以定期傳代， 并用傳統細胞凍存的方法對一定代次的部分細胞進行凍存處理，保存細胞的種 資，其它細胞用于常規的細胞生物學特性鑒定，并進行相應的科學實驗和生產 應用。下面以具體實施例詳細說明
實施例l:楊扇舟蛾細胞系的實現
在無菌操作臺內(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經過滅菌或 消毒處理)將產下約四天的楊扇舟蛾(Gosfera s/ sc/ orfs Fabricius)受精 卵片放入10ml試管中，然后用10%次氯酸鈉溶液浸沒約2-5分鐘并輕振蕩， 倒掉次氯酸鈉溶液并用無菌水清洗卵粒，倒掉無菌水后用75。/。乙醇溶液消毒卵 粒10-20分鐘，期間不斷輕輕振蕩，倒掉乙醇后用Ringer' s清洗卵粒；將卵 粒倒入或用移液器移入裝有1-2ml的昆蟲細胞培養液中(以T畫-FH為主，含 100U/mL的青霉素，100U/mL的鏈霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH=6. 3)，在 解剖鏡下用彎頭眼科鑷逐一輕擠卵粒釋放出胚胎；用移液器輕輕轉移胚胎入另 一裝有0. 5mL昆蟲細胞培養液的培養皿中，用眼科剪將胚胎剪碎，長度約 1-2mm。用移液器將胚胎組織塊轉入含有0. 5mL細胞培養液潤洗過的25cn^細胞 培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27卩無光照的細胞培養箱中培養24小時；加入適 量的細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中，放入同樣條件下 培養。
該方法成功建立細胞系的關鍵是選取產下四天左右的受精卵；擠出的 胚胎要剪成卜2mm;瓶中裝適量培養液，使組織塊緊貼在細胞培養瓶底，勿使 組織塊懸浮在細胞培養液中。以后每7-10天左右吸出半量的培養液，并同時 換入半量的新培養液。在此操作第7-10天后可以觀察到組織塊周圍游離出大 量單個的細胞，并逐漸向外圍擴展。第20天后見到細胞不斷增殖并充滿整個 培養瓶，把含有新增殖出的細胞的培養液吸出放入新培養瓶中，并加入等量 (l-2mL)新的細胞培養液。細胞系建立初步成功。在細胞開始傳代的第7天 后開始第二次分瓶傳代，以后傳代時間逐漸縮短，傳到第5代時，細胞生長開 始穩定，最終該細胞系被命名為Clan I 。并于2008年7月11日保藏在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 2579。實施例2:美國白蛾細胞系的實現
在無菌操作臺內(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經過滅菌或 消毒處理)將產下約四天的美國白蛾(份/ 力朋m'a Drury)受精卵片放
入10ml試管中，然后用10%次氯酸鈉溶液浸沒約2-5分鐘并輕振蕩，倒掉次 氯酸鈉溶液并用無菌水清洗卵粒，倒掉無菌水后用75%乙醇溶液消毒卵粒 10-20分鐘，期間不斷輕輕振蕩，倒掉乙醇后用Ringer， s清洗卵粒將卵粒 倒入或用移液器移入裝有1-2ml的昆蟲細胞培養液中(以TNM-FH為主，含 100'J/mL的青霉素，100U/mL的鏈霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH=6.5)，在 解剖鏡下用彎頭眼科鑷逐一輕擠卵粒釋放出胚胎；用移液器輕輕轉移胚胎入另 一裝有0. 5mL昆蟲細胞培養液的培養皿中，用眼科剪將胚胎剪碎，長度約 l-2mm。用移液器將胚胎組織塊轉入含有0. 5mL細胞培養液潤洗過的25cn^細胞 培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27'C無光照的細胞培養箱中培養24小時；加入適 量的細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中，放入同樣條件下 培養。以后每7-10天左右吸出半量的培養液，并同時換入半量的新培養液。 在此操作第10天后可以觀察到組織塊周圍游離出大量單個的細胞，并逐漸向 外圍擴展。第25天后見到細胞不斷增殖并充滿整個培養瓶，把含有新增殖出 的細胞的培養液吸出放入新培養瓶中，并加入等量(1-2mL)新的細胞培養液。 細胞系建立初步成功。在細胞開始傳代的第7天后開始第二次分瓶傳代，以后 傳代時間逐漸縮短，傳到第8代時，細胞生長開始穩定，最終該細胞系被命名 為Hycu I 。
實施例3:春尺蠖細胞系的實現
在無菌操作臺內(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經過滅菌或 消毒處理)將產下約四天的春尺蠖c/y7ersn7AS Erschoff)受精 卵片放入10ml試管中，然后用10%次氯酸鈉溶液浸沒約2-5分鐘并輕振蕩， 倒掉次氯酸鈉溶液并用無菌水清洗卵粒，倒掉無菌水后用75%乙醇溶液消毒卵 粒10-20分鐘，期間不斷輕輕振蕩，倒掉乙醇后用Ringer' s清洗卵粒；將卵粒倒入或用移液器移入裝有1-2ml的昆蟲細胞培養液中(以T畫-FH為主，含 100U/mL的青霉素，100U/mL的鏈霉素和10% (v/v)的胎牛血清，pH=6. 5)，在 解剖鏡下用彎頭眼科鑷逐一輕擠卵粒釋放出胚胎；用移液器輕輕轉移胚胎入另 一裝有0.5mL昆蟲細胞培養液的培養皿中，用眼科剪將胚胎剪碎，長度約 l-2mm。用移液器將胚胎組織塊轉入含有0. 5mL細胞培養液潤洗過的250012細胞 培養瓶中，蓋緊瓶蓋，放入27"C無光照的細胞培養箱中培養24小時；加入適 量的細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中，放入同樣條件下 培養。以后每7-10天左右吸出半量的培養液，并同時換入半量的新培養液。 在此操作第15天后可以觀察到組織塊周圍游離出大量單個的細胞，并逐漸向 外圍擴展。第35天后見到細胞不斷增殖并充滿整個培養瓶，把含有新增殖出 的細胞的培養液吸出放入新培養瓶中，并加入等量(l-2mL)新的細胞培養液。 細胞系建立初步成功。在細胞開始傳代的第10天后開始第二次分瓶傳代，以 后傳代時間逐漸縮短，傳到第8代時，細胞生長開始穩定，最終該細胞系被命 名為Apci I 。
上述各實施例可在不脫離本發明的范圍下加以若干變化，而非用以限制本 發明的申請專利范圍。
權利要求
1、一種用昆蟲卵建立細胞系的方法，方法步驟如下1)將產下90—100小時的昆蟲受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡5一10分鐘后用無菌水清洗，再將卵粒用乙醇溶液消毒后用生理鹽水Ringer’s清洗；2)將上述步驟處理后的卵粒倒入昆蟲細胞培養液中，逐一輕擠壓卵粒釋放出胚胎；3)將步驟2)得到的胚胎剪碎成組織塊，轉入密閉培養瓶中，放入25～28℃無光照的細胞培養箱中培養20～30小時；4)加入細胞培養液，使胚胎的組織塊完全或超半部分浸沒在該培養液中，在與步驟3)同樣條件下培養；5)每7—15天更換培養液，直至觀察到不斷擴展并開始增殖的細胞充滿了整個培養瓶；6)從培養瓶中吸出半量的細胞培養液，其中含有新增殖出的單個細胞，放入新培養瓶中，并加入等量的新細胞培養液；而原培養瓶中再加入同吸出量同樣多新的細胞培養液；將兩個培養瓶再放回培養箱中與步驟3)同樣條件下培養；得到昆蟲胚胎第一代傳代細胞，細胞系建立成功；整個過程都是在無菌條件下進行的。
2、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于繼續得到昆蟲卵胚胎后一 代傳代細胞的方法步驟如下周期重復權利要求2所述的步驟5)及步驟6)。
3、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)中用5% — 20% 的次氯酸鈉溶液浸泡昆蟲受精卵片2-15分鐘，或用0.2°/。一1%的甲醛溶液浸泡 10-30分鐘，用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡及用乙醇溶液消毒期間均可不斷 輕輕振蕩。
4、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于胚胎剪碎成卜2mm組織塊， 所述步驟5)中更換培養液的具體方法是每7—15天吸出半量的培養液，并同時換入半量新的細胞培養液。
5、 根據權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的細胞培養液是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素和胎牛血清的混合物，配成的細胞培養液pH 在6. 2-6. 6之間，其中細胞培養液中的青霉素與鏈霉素的總含量不超200U/mL; 胎牛血清的體積容量占細胞培養液體積容量的5 % — 15 % 。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特征在于其中細胞培養液中的青霉 素與鏈霉素的含量分別為0 100U/mL;胎牛血清的體積容量占細胞培養液體積容量的5% 15%。
7、 根據權利要求1所述的昆蟲細胞的構建方法，其特征在于其中所述的昆蟲細胞培養液選自商品化的昆蟲細胞培養液T麗-FH， Grace， s， TC-100， IPL-41，或Ex-Cell 405。
8、 根據權利要求1或2所述的昆蟲細胞的構建方法，其特征在于對得 到的昆蟲卵胚胎后一代傳代細胞進行凍存處理，以保存細胞的種資供使用時再復蘇。
9、根據權利要求1所述的昆蟲細胞的構建方法，其特征在于其中所述 的昆蟲卵可以是楊扇舟蛾卵或美國白蛾卵、春尺蠖卵。
全文摘要
一種用昆蟲卵建立細胞系的方法，步驟如下1)將產下90～100小時的昆蟲受精卵片用次氯酸鈉溶液或甲醛溶液浸泡后再消毒；2)處理后的卵粒倒入昆蟲細胞培養液中，逐一擠壓卵粒釋放出胚胎；3)將胚胎剪碎成組織塊放入培養箱中培養；4)加入細胞培養液繼續培養；5)定時更換培養液，直至增殖的細胞充滿整培養瓶；6)吸出半量的細胞培養液，其中含有新增殖出的單個細胞，放入新培養瓶中并加入等量的新細胞培養液，繼續放回培養箱中培養；7)周期重復步驟5)及6)，細胞開始傳代，細胞系建立成功；整過程在無菌下進行。所述的昆蟲卵可以是鱗翅目昆蟲卵；本發明方法由傳統耗時1.5-2年縮減到1-3個月，優勢非常明顯，且重復性很強。
文檔編號C12N5/06GK101423817SQ200810118629
公開日2009年5月6日 申請日期2008年8月20日 優先權日2008年8月20日
發明者張永安, 曲良建, 溫發園, 王文歡, 王玉珠 申請人:中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所