專利名稱：一種構建生產外源蛋白用的轉基因用模型雞的方法
技術領域：
本發明涉及一種構建生產外源蛋白用的轉基因用模型雞的方法。
背景技術：
上個世紀70年代DNA重組技術的建立，使異源DNA可以被引入到真核細胞 中，這種基因轉移技術為人類提供了從遺傳上改變高等動物細胞的能力，并成為制 備轉基因動物和進行基因治療的基礎。應用DNA重組技術，目前人們已經成功地 獲得了包括小鼠、牛、豬、兔、雞、魚、線蟲和海膽等多種轉基因動物，1990年， 轉基因方法也被用于人類基因治療的研究中。對于許多高等動物，特別是具有完善 的免疫系統的脊椎動物而言，基因傳遞系統存在潛在的免疫刺激性，異源基因的表 達容易引起宿主產生免疫應答。通常情況下，無論是制備轉基因動物還是進行基因 治療，其目的就是為了高效的獲得外源基因的表達產物。由于宿主本身并沒有這些 蛋白，自然將其識別為非自身抗原而加以清除，造成轉基因蛋白的瞬時表達，甚至 引發炎癥反應。為了避免這種情況的發生，需要宿主對特定的外源蛋白產生免疫寬 容，不發生免疫排斥反應，即形成免疫耐受。
免疫耐受是指免疫系統與機體固有成分或被引入的抗原不發生破壞性免疫反 應的一種生理狀態，這種狀態可以通過將抗原引入發育中的免疫系統而人為誘導。 根據抗體產生的克隆選擇學說，正常情況下，胚胎與外部抗原刺激是隔離開的，胚 胎的淋巴系統只會遇到自身抗原，從而導致了自身免疫反應的消除(免疫寬容)。 免疫系統在發育過程中學會了耐受，它的任務是通過T細胞和B細胞抗原受體基因 的重排產生隨機的結構多樣性，識別不期而遇的分子并作出反應，因而是一種獲得 性現象，需要抗原誘導才能產生，即便是對自身抗原的耐受也是如此。但是對于大 多數轉基因動物，特別是作為生物反應器的轉基因動物，外源基因通常在免疫系統 已發育完全的成年動物中表達，因此需要建立一種通過向發育早期的胚胎中引入外 源抗原誘導免疫耐受的方法。
抗原性物質進入機體后能否誘導產生免疫耐受，主要取決與抗原和機體兩方面 的原因， 一般而言，小分子可溶性、非聚合狀態的抗原，如血清蛋白、多糖和脂多 糖等多為耐受原。這些小分子可溶性抗原在體內不易被吞噬細胞攝取，有可能以最 適濃度通過直接與淋巴細胞作用的方式誘導機體產生免疫耐受。而大分子顆粒性物 質和蛋白質聚合物，如血細胞、細菌或人丙種球蛋白聚合物等為良好的免疫原。這 些大分子物質易被吞噬細胞攝取，經加工處理后可有效刺激淋巴細胞產生免疫應 答。誘導耐受所需的抗原劑量隨抗原種類、耐受細胞類型、動物屬種、品系和年齡 而異。 一般而言，抗原經靜脈注射最易產生免疫耐受，腹腔注射次之，皮下和肌肉 注射最難，但不同部位靜脈注射引起的結果也不相同。例如人丙種球蛋白經腸系膜 靜脈注入可引起耐受，經頸靜脈注入則引起免疫應答；IgG或白蛋白注入門靜脈能 引起耐受，注入周圍靜脈則引起免疫應答。誘導免疫耐受形成的難易還與機體免疫 系統的發育程度有關， 一般在胚胎期最容易，新生期次之，成年期最難。體外實驗 證實，未成熟免疫細胞易于誘導產生免疫耐受，成熟免疫細胞則難以誘導產生耐受； 誘導成熟免疫細胞耐受所需的抗原量比誘導未成熟免疫細胞耐受所需的抗原量高 數十倍。目前大量的實驗證據表明，免疫耐受的形成與免疫系統初次接觸抗原時所 處的發育階段密切相關，免疫耐受可以通過對胚胎或新生幼雛接種抗原而誘導。
與哺乳動物不同的是，禽類的胚胎發育是在離開母體的密閉蛋殼內獨立完成 的，這為胚胎期接種抗原提供了更為方便的條件。
發明內容
本發明的目的是提供一種構建生產外源蛋白用的轉基因用模型雞的方法。 本發明所提供的構建生產外源蛋白用的轉基因用模型雞的方法包括以下步驟
1) 將外源蛋白導入種蛋的卵黃囊內；
2) 將上述步驟l)的種蛋靜置孵育46 — 50小時后，再繼續孵化至出雛，得到生 產外源蛋白用的轉基因用模型雞。
上述方法中，所述種蛋的胚齡為5-7天。
所述外源蛋白為牛血清白蛋白、牛乳酪蛋白或人血清白蛋白，優選為牛血清白 蛋白；所述牛血清白蛋白的濃度為0.8 —1.2g/L，導入的劑量為每只種蛋80 — 120pl。
具體操作時，可在種蛋的氣室上打兩個孔，其中一個孔位置在于氣室邊緣下方 0.3-0.5cm處，通過氣室上的窗孔將外源蛋白導入卵黃囊中。
本發明在雞胚胎發育早期，其免疫系統尚未完善之前，通過向種蛋的卵黃囊中 導入外源蛋白，使其與卵黃營養物質一起被發育中的胚胎吸收，進入到胚胎的血液 循環系統，隨著血液循環經過胸腺時與正在發育的免疫細胞相互作用，誘導雞胚免 疫系統產生對外源蛋白的免疫沉默，最終獲得對特定外源蛋白免疫耐受的轉基因用
模型雞。
在對種蛋卵黃囊導入外源蛋白時，要盡量縮短時間，平均每只種蛋的操作時間 控制在1-1.5分鐘。整個過程需在超凈工作臺中進行，封閉蛋殼上的針孔時不能出 現滲漏的情況。整個操作過程可以在室溫條件下完成，為縮短操作時間，可一人扎 孔、 一人導入外源蛋白、 一人封蛋，盡量縮短每只種蛋在孵化器外的時間，以減少 環境變化對雞胚孵化的影響，大大提高其孵化率，進而提高免疫耐受率。
本發明的方法具有操作條件簡單易得、成本低廉、可操作性強、外源蛋白的導 入劑量低、可重復性好、耐受率和孵化率高及維持耐受的時間久等優點，且本發明
方法對雞胚胎發育的影響較小，可以獲得73-83%的孵化率，成功地解決了轉基因 產物可能引起生物個體免疫應答的問題，并且免疫耐受維持的時間較久，60日齡的 轉基因用模型雞仍然存在對特定外源蛋白抗原的免疫耐受。本發明方法為解決轉基 因產物引起的免疫應答提供了一個簡單、高效的解決方案，為在轉基因動物研究中 高效獲得外源基因產物，建立對基因產物免疫耐受的禽類模型和提高雞輸卵管生物 反應器的應用價值提供了科學依據和有效的方法。
圖1為對孵化3 — 7天的種蛋胚胎導入牛血清白蛋白后獲得的轉基因用模型雞 的血清ELISA檢測結果
具體實施例方式
下面通過具體實施例對本發明做進一步的說明。 實施例l、對不同胚齡的種蛋導入外源蛋白-牛血清白蛋白(BSA) 取胚齡分別為3、 4、 5、 6和7天的白萊航雞種蛋(購自中國農業大學種雞場) 各30枚，用酒精棉擦拭蛋殼表面消毒后，通過顯微光源照蛋確定胚胎所處的位置， 然后用鉛筆在胚胎對側的蛋殼上標注出氣室的邊緣，這樣在打孔時可以有效的避開 胚胎血管網，避免導入外源蛋白時對胚胎血管的機械損傷。在標注的氣室邊緣下方 0.3-0.5cm處做一個打孔標記，為了保持氣室和胚室的氣壓平衡，在氣室頂部再做一 個打孔標記，用酒精棉擦拭打孔標記處，使用解剖針在種蛋打孔標記處快速扎兩個 小孔(孔徑為lmm)。
用lml—次性注射器，使用1號針頭，針頭內徑為0.1mm，吸取100pl濃度為 lg/L的外源蛋白-牛血清白蛋白溶液，自氣室邊緣下方0.3-0.5cm處的小孔處垂直種 蛋蛋殼切面扎入蛋內直至針頭完全沒入種蛋中，輕推注射器活塞將外源蛋白-牛血
清白蛋白溶液導入卵黃囊內。維持原角度緩緩地抽出注射器，用液體石蠟封閉兩孔。
將封閉后的種蛋放回孵化器中，在不轉蛋的條件下靜置孵育48小時后，再在 常規條件下繼續孵化直至出雛，得到轉基因用模型雞。
統計孵化率，結果表明，不同胚齡接種牛血清白蛋白的轉基因用模型雞的孵化 率分別為76.67%、 80.00%、 83.33%、 80.00%和73.33%，孵化率在73%-83%之間。
實施例2、利用酶聯免疫反應(ELISA)檢測不同胚齡接種牛血清白蛋白的轉 基因用模型雞的免疫耐受結果
牛血清白蛋白經弗氏佐劑(弗氏完全佐劑用于第一次免疫時抗原乳化，弗氏不 完全佐劑用于其他日齡階段的抗原乳化)乳化后，在上述實施例1獲得的不同胚齡 接種牛血清白蛋白的轉基因用模型雞孵出后的第20天、第30天、第40天和第50 天分別用lOOiil濃度為lg/L的牛血清白蛋白溶液，進行4次皮下注射，第4次皮下 注射后的第7天，取轉基因用模型雞的血清，進行ELISA檢測。同時以胚胎期未經 處理的小雞出生后按照上述劑量進行四次免疫后的雞血清作為陽性對照，以采用無 特定病原菌(SPF)處理的雞血清作為陰性對照。
在檢測各組雞血清樣本前，需要先通過系列倍比稀釋實驗組、陽性對照組和陰 性對照組的雞血清，以確定抗原抗體的最佳反應濃度。選取陽性對照組OD值在1. 0 左右，且與同樣稀釋度下的陰性對照組OD值差異最大時對應的抗原包被濃度以及 血清稀釋倍數作為檢測實驗組血清樣本時使用的抗原濃度和稀釋倍數。當實驗組樣
本的0D值大于陰性對照組0D值的2. l倍時，判定該樣本為陽性，反之則為陰性。 所有實驗數據采用SPSS 11.5統計軟件進行統計分析。數據用平均值士標準差 (mean士SEM)的方式表示。采用獨立樣本t檢驗(雙尾)，P<0. 05時認為差異顯 著。
具體檢測結果如圖1所示。從圖1中可以看出，對胚齡為3天或4天的種蛋接 種牛血清白蛋白的轉基因用模型雞血清中的抗-牛血清白蛋白抗體的平均水平分別 為1.03±0.13 (n=21)和0.92土0.12 (n=20)，與陽性對照(1.02±0.04， n=6)相 比差異不顯著(p=0.984， p=0.636)，表明在胚齡為3天或4天時導入牛血清白蛋 白對誘導雞的耐受性的效果不好，其血液中仍具有較高水平的抗-牛血清白蛋白抗 體；而對胚齡為5天、6天或7天的種蛋接種牛血清白蛋白的轉基因用模型雞血清 中的抗-牛血清白蛋白抗體的平均水平分別為0.55±0.08 (n=21) 、 0.66±0.08 (n =20)和0.44士0.04 (n=16)，顯著低于陽性對照(p=0.003， 5天組;p=0.020， 6
天組；p<0.001， 7天組)，表明在胚齡為5天、6天或7天時導入牛血清白蛋白對 誘導雞的耐受性的效果較好。進一步分析比較這五組數據，結果發現，胚齡為5天、 6天或7天組的雞血清中抗-牛血清白蛋白抗體的平均水平顯著低于胚齡為3天或4 天組的轉基因用模型雞血清中抗-牛血清白蛋白抗體的平均水平(p<0.05)，說明只 有在特定的發育時期接種外源抗原才能使雞血清中抗-牛血清白蛋白抗體的水平最 低，并非時間越早越好，在胚齡為5-7天時導入外源蛋白的效果最好。
實驗組的轉基因用模型雞經過四次免疫后，此時小雞已達60日齡，其體內抗-牛血清白蛋白抗體的平均水平顯著低于陽性對照(p=0.003， 5天組；p=0.020， 6天 組；pO.OOl， 7天組)，說明耐受期限可維持較長時間。
權利要求
1、一種構建生產外源蛋白用的轉基因用模型雞的方法包括以下步驟1)將外源蛋白導入種蛋的卵黃囊內；2)將上述步驟1)的種蛋靜置孵育46-50小時后，再繼續孵化至出雛，得到生產外源蛋白用的轉基因用模型雞。
全文摘要
本發明公開了一種構建生產外源蛋白用的轉基因用模型雞的方法。本發明的方法包括以下步驟1)將外源蛋白導入種蛋的卵黃囊內；2)將上述步驟1)的種蛋靜置孵育46-50小時后，再繼續孵化至出雛，得到生產外源蛋白用的轉基因用模型雞。本發明的方法具有操作條件簡單易得、成本低廉、可操作性強、外源蛋白的導入劑量低、可重復性好和孵化率高等優點，且本發明方法對雞胚胎發育的影響較小，可以獲得73-83％的孵化率，并且免疫耐受維持的時間較久，60日齡的轉基因用模型雞仍然存在對特定外源蛋白抗原的免疫耐受。
文檔編號C12N15/09GK101352157SQ20081011843
公開日2009年1月28日 申請日期2008年8月15日 優先權日2008年8月15日
發明者李贊東, 晨 趙 申請人:中國農業大學