一種生產文多靈的方法

文檔序號：598422閱讀：347來源：國知局

專利名稱：一種生產文多靈的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產文多靈的方法，特別涉及一種利用植物細胞大規模培養和代謝調控技術生產文多靈的方法。
技術背景長春花(periwinkle)拉丁名為(Q^ara"Aws (L) G. Don)是夾竹桃科中生物堿含量較為豐富的一屬。長春花生物堿主要有Aspicospermatan型如文多靈(Vindoline) 等、Ibogan型如長春質堿(Catharanthine)等、Corynanthean型如阿瑪堿(Ajmalicine)和蛇根堿(Serpentine)等和Bisindoles型如長春堿(Vinblastine)和長春新堿(Vincristine)等。五十年代中期，一些學者在研究長春花植物降血糖作用時分別發現長春花植物的提取物還具有降低白血球的作用，1958年，加拿大Noble和Beer等共同分離了這一活性成分，命名為Vinblastine(長春堿)并制備了其硫酸鹽。隨后美國Lilly公司證明了長春花粗生物堿和VLB可治療急性淋巴白血病，同時證明Leurosine(洛諾生)也具有抗癌作用，隨后又發現Leurosidine(長春羅賽定)和Leurocristine(長春新堿)也有抗癌作用 (CuttsJH,etal Cancer Res. 1960,20: 1023)。后來，藥理學家證明長春堿和長春新堿的抗癌機理是其與微管蛋白結合，阻滯微管蛋白聚合形成微管和誘導微管解聚，因而使細胞停止在細胞分裂中期而死亡(Cutts JH, et al Cancer Res. 1960， 20: 1023Johnson IS. Cancer Res. 1960, 20: 1016~1022)。這一發現震動世界，人們迅速開始研究長春花抗癌活性。隨后美國Lily公司證明了長春花粗生物堿可治療急性淋巴白血病；長春新堿(Vincristine)具有抗癌作用；并開發了長春花堿和長春新堿，應用于臨床。長春花堿在臨床上主要用做治療何杰金氏病以及絨毛膜癌，對乳腺癌效果也較好，長春新堿主要用于治療兒童急性淋巴白血病和髓白血病，它們同時具有光譜抗癌活性。藥理學家證明長春堿和長春新堿的抗癌機理是其與微管蛋白結合，阻滯微管蛋白聚合形成微管和誘導微管解聚，因而使細胞停止在細胞分裂中期而死亡。至今長春堿和長春新堿仍主要從長春花植物中提取，長春花是該生物堿的唯一來源植物。由于這兩種生物堿在植物體內含量很低，分別為十萬分之幾和百萬分之幾，并無法用化學合成的方法生產，使市場價格非常高。盡管其在臨床上有劑量依賴的神經毒副作用，使其應用受到一定限制。但由于其廣泛的臨床和其它應用及改造潛力，藥物化學家們仍在努力試圖用化學方法合成它們，或進行結構改造以尋求高效低毒的類似物。生物學家也很早便開始研究用植物組織細胞培養的方法來生產這些生物堿(Jian Zhao, Wei Hua Zhu, Qiu Hu.Enhanced catharanthine production in Catharanthus roseus cell cultures by combined elicitor treatment in shake flasks and bioreactors, Enzyme and Microbial Technology. 2001, 28: 673~681; Kutney JP, Awery B, Choi LS, et al. The synthesis and biosynthesis of indole alkaloids, Tetrahedron, 1983， 39, 3781 )。自60年代國外就開始研究長春花組織培養生產吲哚生物堿，從70年代末開始，用此來生產長春花生物堿的研究成為生物工程領域的一個熱點，但至目前為止，仍未能從懸浮培養細胞中獲得這兩種抗癌生物堿，僅可生產阿瑪堿、蛇根堿和長春質堿，也未能實現工業化生產。由于文多靈是目前半合成長春堿或長春新堿的重要前體物質，也就是說可以用長春質堿和文多靈在體外人工半合成長春堿。所以只要用植物細胞大規模培養生產出長春質堿和文多靈這兩種原料，就可以半合成長春堿。發明內容本發明的目的是提供一種生產文多靈的方法。本發明所提供的生產文多的方法，是將長春花多倍體細胞株接種于合成培養基中，于20 28'C，培養3 7天得到富含文多靈的細胞；所述合成培養基為在基本培養基中添加0 4mg/L植物細胞生長素、0 4mg/L植物細胞分裂素，30 60g/L蔗糖、10 40嗎/L乙酰輔酶A、 0.5 1.5pmol/L苯丙三氮唑、5 30|imol/L苯環丙胺、10 40|il/L乙酸酐和10 40mg/L 二硫蘇糖醇得到的液體培養基。所述方法中，所述長春花多倍體細胞株接種于合成培養基的接種量為200 300g/L。所述合成培養是在80 130rpm/分轉速搖培。所述合成培養的溫度優選為25 28°C，所述合成培養的時間可為4-7天。所述方法中，所述長春花多倍體細胞株是將長春花愈傷組織細胞進行多倍體誘導培養得到的。所述多倍體誘導培養是將長春花愈傷組織細胞用含10-40mg/L秋水仙堿的基本培養基培養得到長春花多倍體細胞株。所述方法中，所述長春花多倍體細胞株在合成培養之前在20 25i:，避光條件下擴增培養2 3周；所述擴增培養基為基本培養基中添加0 4mg/L植物細胞分裂素， 0 4mg/L植物細胞生長素，20 50g/L蔗糖得到的固體培養基。所述方法中，所述長春花多倍體細胞株在所述擴增培養之前進行繼代培養3代以上；所述繼代培養用培養基為基本培養基中添加20-60g/L蔗糖，1.0-5mg/L植物細胞生長素和1.0-5mg/L植物細胞分裂素的培養基；所述繼代培養的條件為20 25°C，避光條件。所述方法中，所述基本培養基均為按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞血酸得 '到的培養基；所述植物細胞分裂素為6 —卞氨基嘌呤或激動素；所述植物細胞生長素為吲哚乙酸或a—奈乙酸。所述方法中，所述擴增培養基的pH值為5.6 7.0;所述合成培養基的pH值為 5.8 7.0。所述方法中，還包括將所述富含文多靈的細胞用溶劑萃取獲得含有文多靈的粗提物，再經過純化獲得文多靈；所述溶劑為體積百分濃度為95%的乙醇溶液或甲醇溶液。本發明的方法合理地解決了長春花細胞生長與文多靈合成的相互矛盾，可以在3 周內獲得300 500g/L新鮮細胞，并利用活細胞作為微反應器，采取代謝調控技術快速促進文多靈的合成，可以在3 7天內將文多靈的含量提高到細胞干重的千分之一，超過天然植物枝葉的40倍左右。本發明的方法用長春花細胞培養生產文多靈，可穩定的實現文多靈的工業化生產，并且其生產成本較低，培養周期短，不受自然環境以及氣候的影響，可以實現周年生產。
具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中所述的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。實施例l、利用長春花細胞大規模培養生產文多靈1、長春花細胞系的培養-1) 長春花愈傷組織的獲得將長春花的幼莖作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作臺中將幼莖切成2毫米長的莖斷，接種到脫分化培養基中，在20001x， 12-16小時照光， 25度左右室溫下培養3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放在步驟2)所述繼代馴化培養基中繼代培養3次以上，同時篩選得到生長速度快，質地松軟，生長量穩定的細胞系。脫分化培養基的配制在MS培養基中，添加吲哚乙酸1.0mg/L，細胞分裂素6-BA 1.0mg/L， 20g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到5.8，再添加6. 5g/L瓊脂，在 115°C， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后，經冷卻制成斜面脫分化培養基。2) 長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養將步驟1)所述誘導形成的愈傷組織細胞系接種在下述繼代培養基中進行3次以上的繼代培養，培養條件為2(TC室溫，避光條件，培養周期為3周。在繼代培養過程中，篩選出結構疏松以及生長速度較快的愈傷組織進行繼代培養；繼代馴化培養基的配制在MS培養基的基礎上添加1. 0mg/L的植物細胞生長素 NAA， 1. Omg/L的植物細胞分裂素6-BA， 20g/L蔗糖、6. 5 g/L瓊脂，經115°C， 0. lMPa 壓力下消毒15分鐘后經冷卻制成平板繼代馴化培養基。3) 長春花多倍體細胞的誘導在MS培養基中加入10mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915)，做成液體誘導培養基，步驟2)獲得的結構疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該誘導培養基內，在2(TC，避光，100rpra/分轉速的搖床上振蕩培養7天。收集細胞后再接種在無秋水仙堿的繼代培養基中，反復馴化培養三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生長速度超過5倍接種細胞量/培養周期)的多倍體細胞系；經細胞醋酸洋紅或銀染色后通過顯微檢測表明，該細胞系為混合多倍體細胞系。4) 長春花多倍體細胞的擴增培養將步驟3)得到的長春花混合多倍體細胞系接種在擴增培養基上，在25。C，黑暗條件下進行擴增培養3周后，獲得接種量10倍以上的生長旺盛的多倍體細胞；擴增培養基的制備方法為在改良MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L 的抗壞血酸得到的培養基)中，添加2mg/La—萘乙酸(NAA) ， 2mg/L6 —卞氨基嘌呤 (6—BA)和30g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到5.7，再添加4.5g/L瓊脂，在 115°C， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養基。2、文多靈合成將步驟1擴增培養得到的生長旺盛長春花多倍體細胞接種到合成培養基內，接種量為200g/L，在25X:，避光條件，90轉/分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養7天得到富含文多靈的細胞。收獲細胞，培養液經調整后可返回反應器繼續反復利用。合成培養基在改良MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中-的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞血酸得到的培養基)中，添加蔗糖30g/L，巧I哚乙酸(IAA) lmg/L， KT lmg/L，用酸或堿將 pH值調整到5.8，在115X:， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后冷卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A 10|iig/L、苯丙三氮唑0.5nmol/L、苯環丙胺5pmol/L、乙酸酐l(Hil/L、二硫蘇糖醇10mg/L)，用無菌的酸或堿將pH值調整到5.8，制成合成 i肯養基；3、文多靈的提取將步驟2合成培養得到的富含文多靈的細胞置于提取灌中，經過高速攪拌(300轉/分)破碎，加入lml/g鮮細胞量的體積百分濃度為95%的乙醇溶液，在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸乙酯，用硫酸調pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有文多靈的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中文多靈的含量，結果表明，文多靈含量達到lmg/g細胞干重。實施例2、利用長春花細胞大規模培養生產文多靈 1、長春花細胞系的培養1) 長春花愈傷組織的獲得將長春花的節間作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作臺中將節間切成2毫米長的莖斷接種到脫分化培養基中，在20001x， 12-16小時照光， 25度左右室溫下培養3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放在步驟2)所述繼代馴化培養基中繼代培養3次以上，同時篩選得到生長速度快，質地松軟，生長量穩定的細胞系。脫分化培養基的配制在MS培養基中，添加吲哚乙酸2.0mg/L，細胞分裂素6-BA 2.0mg/L， 30g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到5. 8，再添加6. 5g/L瓊脂，在 115°C， 0. IMPa壓力下消毒15分鐘后，經冷卻制成斜面脫分化培養基。2) 長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養將步驟1)所述誘導形成的愈傷組織細胞系接種在下述繼代培養基中進行3次以上的繼代培養，培養條件為20。C室溫，避光條件，培養周期為3周。在繼代培養過程中，篩選出結構疏松以及生長速度較快的愈傷組織進行繼代培養；繼代培養基的配制在MS培養基的基礎上添加2. Omg/L的植物細胞生長素NAA， 2. Omg/L的植物細胞分裂素6-BA， 30g/L蔗糖、6. 5 g/L瓊脂，經115。C， 0. IMPa壓力下消毒15分鐘后經冷卻制成平板馴化培養基。3) 長春花多倍體細胞的誘導在MS培養基中加入20mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915)，做成液體誘導培養基，步驟2)獲得的結構疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該誘導培養基內，在2(TC，避光，100rpm/分轉速的搖床上振蕩培養7天。收集細胞后再接種在無秋水仙堿的繼代培養基中，反復馴化培養三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生長速度超過5倍接種細胞量/培養周期)的多倍體細胞系；經細胞醋酸洋紅或銀染色后通過顯微檢測表明，該細胞系為混合多倍體細胞系。4)長春花多倍體細胞的擴增培養將步驟3)得到的長春花混合多倍體細胞系接種在擴增培養基上，在25X:，黑暗條件下進行擴增培養2.5周后，獲得接種量10倍以上的生長旺盛的多倍體細胞；擴增培養基的制備方法為在改良的MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L 的抗壞血酸得到的培養基)中，添加0.5mg/L 口引哚乙酸(IAA) ， lmg/L KT和40g/L 蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到6.5，再添加5g/L瓊脂，在115"， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養基。2、文多靈合成將步驟1擴增培養得到的旺盛生長的長春花多倍體細胞接種到合成培養基內，接種量為300g/L，在26C，避光條件，110轉/分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養6 天得到富含文多靈的細胞。收獲細胞，培養液經調整后可返回反應器繼續反復利用。合成培養基在改良的MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞血酸得到的培養基)中，添加蔗糖40g/L， a—萘乙酸(NAA) 0mg/L， 6 —卞氨基嘌呤(6 — BA) 0.5mg/L，用酸或堿將pH值調整到6.5，在115°C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后冷卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A 20pg/L、苯丙三氮唑 lpmol/L、苯環丙胺10pmol/L、乙酸酐20|il/L、二硫蘇糖醇20mg/L)，用無菌的酸或堿將pH值調整到6.5，制成合成培養基；3、文多靈的提取將步驟2合成培養得到的富含文多靈的細胞置于提取灌中，經過高速攪拌(300 轉/分)破碎，加入lml/g鮮細胞量的體積百分濃度為95%的乙醇溶液，在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸乙酯，用硫酸調pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有文多靈的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中文多靈的含量，結果表明，文多靈含量達到Umg/g細胞干重。實施例3、利用長春花細胞大規模培養生產文多靈 1、長春花細胞系的培養 1)長春花愈傷組織的獲得將長春花的葉片作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作臺中將葉片延葉脈切成0.5厘米見方的小塊接種到脫分化培養基中，在20001x, 12-16 小時照光，25度左右室溫下培養3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放在步驟2)所述繼代馴化培養基中繼代培養3次以上，同時篩選得到生長速度快，質地松軟，生長量穩定的細胞系。脫分化培養基的配制在MS培養基中，添加吲哚乙酸3.0mg/L，細胞分裂素6-BA 3.0rag/L， 40g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到5. 8，再添加6. 5g/L瓊脂，在 U5。C， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后，經冷卻制成斜面脫分化培養基。2)長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養將步驟1)所述誘導形成的愈傷組織細胞系接種在下述繼代培養基中進行3次以上的繼代培養，培養條件為2(TC室溫，避光條件，培養周期為3周。在繼代培養過程中，篩選出結構疏松以及生長速度較快的愈傷組織進行繼代培養；繼代培養基的配制在MS培養基的基礎上添加3. Omg/L的植物細胞生長素NAA， 3. Omg/L的植物細胞分裂素6-BA， 40g/L蔗糖、6. 5 g/L瓊脂，經115。C， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后經冷卻制成平板繼代馴化培養基。3、長春花多倍體細胞的誘導在MS培養基中加入30mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915)，做成液體誘導培養基，步驟2)獲得的結構疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該誘導培養基內，在2(TC，避光，100rpm/分轉速的搖床上振蕩培養7天。收集細胞后再接種在無秋水仙堿的繼代培養基中，反復馴化培養三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生長速度超過5倍接種細胞量/培養周期)的多倍體細胞系；經細胞醋酸洋紅或銀染色后通過顯微檢測表明，該細胞系為混合多倍體細胞系。4)長春花多倍體細胞的擴增培養將步驟3)得到的長春花混合多倍體細胞系接種在擴增培養基上，在25。C，黑暗條件下進行擴增培養3周后，獲得接種量10倍以上的生長旺盛的多倍體細胞；擴增培養基的制備方法為在改良的MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L 的抗壞血酸得到的培養基)中，添加Omg/La—萘乙酸(NAA) ， 0.5mg/L6 —卞氨基嘌呤(6—BA)和50g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到7，再添加5g/L瓊脂，在115°C ， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養基。2、文多靈合成將步驟1擴增培養得到的旺盛生長的長春花多倍體細胞接種到合成培養基內，接種量為250g/L，在27"C，避光條件，120轉/分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養4天得到富含文多靈的細胞。收獲細胞，培養液經調整后可返回反應器繼續反復利用。合成培養基在改良的MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞血酸得到的培養基)中，添加蔗糖40g/L， a—萘乙酸(NAA)0.5mg/L， 6 —卞氨基嘌呤(6 — BA)0mg/L，用酸或堿將pH值調整到7，在115"， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后冷卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A 30pg/L、苯丙三氮唑 1.5pmol/L、苯環丙胺20^imol/L、乙酸酐30pl/L、二硫蘇糖醇30mg/L)，用無菌的酸或堿將pH值調整到7，制成合成培養基。3、文多靈的提取將步驟2合成培養得到的富含文多靈的細胞置于提取灌中，經過高速攪拌(300 轉/分)破碎，加入lml/g鮮細胞量的體積百分濃度為95%的乙醇溶液，在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸乙酯，用硫酸調pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有文多靈的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中文多靈的含量，結果表明，文多靈含量達到1.05mg/g細胞干重。實施例4、利用長春花細胞大規模培養生產文多靈 1、長春花細胞系的培養1) 長春花愈傷組織的獲得將長春花的葉片作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作臺中將葉片延葉脈切成0.5厘米見方的小塊接種到脫分化培養基中，在20001x， 12-16 小時照光，25度左右室溫下培養3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放在步驟2)所述繼代馴化培養基中繼代培養3次以上，同時篩選得到生長速度快，質地松軟，生長量穩定地細胞系。脫分化培養基的配制在MS培養基中，添加吲哚乙酸4.0mg/L，細胞分裂素6-BA 4.0mg/L， 45g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到5. 8，再添加6. 5g/L瓊脂，在 115°C, O.lMPa壓力下消毒15分鐘后，經冷卻制成斜面脫分化培養基。2) 長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養將步驟1)所述誘導形成的愈傷組織細胞系接種在下述繼代培養基中進行3次以上的繼代培養，培養條件為20。C室溫，避光條件，培養周期為3周。在繼代培養過程中，篩選出結構疏松以及生長速度較快的愈傷組織進行繼代培養；繼代培養基的配制在MS培養基的基礎上添加4. 0mg/L的植物細胞生長素NAA, 4. Omg/L的植物細胞分裂素6-BA， 50g/L蔗糖、6. 5 g/L瓊脂，經115。C， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后經冷卻制成平板馴化培養基。3) 長春花多倍體細胞的誘導在MS培養基中加入35mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915)，做成液體合成培養基，步驟2)獲得的結構疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該合成培養基內，在2(TC，避光，100rpm/分轉速的搖床上振蕩培養7天。收集細胞后再接種在無秋水仙堿的繼代培養基中，反復馴化培養三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生長速度超過5倍接種細胞量/培養周期)的多倍體細胞系；經細胞醋酸洋紅或銀染色后通過顯微檢測表明，該細胞系為混合多倍體細胞系。4) 長春花多倍體細胞的擴增培養將步驟3)得到的長春花混合多倍體細胞系接種在擴增培養基上，在25X:，黑暗條件下進行擴增培養3周后，獲得接種量10倍以上的生長旺盛的多倍體細胞；擴增培養基的制備方法為在改良的MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L 的抗壞血酸得到的培養基)中，添加3mg/La—萘乙酸(NAA) ， 2.5mg/L6 —卞氨基嘌呤(6—BA)和30g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到6.0，再添加5g/L瓊脂，在 U5°C， 0.1MPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養基。2、文多靈合成將步驟1擴增培養得到的旺盛生長的長春花多倍體細胞接種到合成培養基內，接種量為300g/L，在28"C，避光條件，130轉/分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養5 天得到富含文多靈的細胞。收獲細胞，培養液經調整后可返回反應器繼續反復利用。合成培養基在改良的MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞血酸得到的培養基)中，添加蔗糖50g/L， a—萘乙酸(NAA)1.5mg/L， 6 —卞氨基嘌呤(6 — BA)0mg/L，用酸或堿將pH值調整到6.0，在115°C， 0.1MPa壓力下消毒15分鐘后冷卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A 40|ig/L、苯丙三氮唑 0.5|imol/L、苯環丙胺30nmol/L、乙酸酐35pl/L、二硫蘇糖醇35mg/L)，用無菌的酸或堿將pH值調整到6.0，制成合成培養基。3、文多靈的提取將步驟2合成培養得到的富含文多靈的細胞置于提取灌中，經過高速攪拌(300 轉/分)破碎，加入lml/g鮮細胞量的體積百分濃度為95%的乙醇溶液，在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸乙酯，用硫酸調pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有文多靈的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中文多靈的含量，結果表明，文多靈含量達到1.2mg/g細胞干重。實施例5、利用長春花細胞大規模培養生產文多靈1、長春花細胞系的培養1) 長春花愈傷組織的獲得將長春花的幼莖作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作臺中將幼莖切成2毫米長的莖斷，接種到脫分化培養基中，在20001x， 12-16小時照光， 25度左右室溫下培養3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放在步驟2)所述繼代馴化培養基中繼代培養3次以上，同時篩選得到生長速度快，質地松軟，生長量穩定地細胞系。 '脫分化培養基的配制在MS培養基中，添加吲哚乙酸5.0rag/L，細胞分裂素6-BA 5.0mg/L， 50g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到5. 8，再添加6. 5g/L瓊脂，在 115。C， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后，經冷卻制成斜面脫分化培養基。2) 長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養將步驟1)所述誘導形成的愈傷組織細胞系接種在下述繼代培養基中進行3次以上的繼代培養，培養條件為2(TC室溫，避光條件，培養周期為3周。在繼代培養過程中，篩選出結構疏松以及生長速度較快的愈傷組織進行繼代培養；繼代培養基的配制在MS培養基的基礎上添加5. Omg/L的植物細胞生長素NAA， 5.0mg/L的植物細胞分裂素6-BA， 60g/L蔗糖、6. 5 g/L瓊脂，經115。C， 0. lMPa壓力下消毒15分鐘后經冷卻制成平板馴化培養基。3) 長春花多倍體細胞的誘導在MS培養基中加入40mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915)，做成液體誘導培養基，步驟2)獲得的結構疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該誘導培養基內，在2(TC，避光，100rpm/分轉速的搖床上振蕩培養7天。收集細胞后再接種在無秋水仙堿的繼代培養基中，反復馴化培養三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生長速度超過5倍接種細胞量/培養周期)的多倍體細胞系；經細胞醋酸洋紅或銀染色后通過顯微檢測表明，該細胞系為混合多倍體細胞系。4) 長春花多倍體細胞的擴增培養將步驟3)得到的長春花混合多倍體細胞系接種在擴增培養基上，在25t:，黑暗條件下進行擴增培養3周后，獲得接種量10倍以上的生長旺盛的多倍體細胞；擴增培養基的制備方法為在改良的MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L 的抗壞血酸得到的培養基)中，添加4mg/La—萘乙酸(NAA) ， 1.5mg/升6 —卞氨基嘌呤(6 — BA)和40g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到5.6，再添加4.5g/L瓊脂，在 115°C， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養基。2、文多靈合成將步驟1擴增培養得到的旺盛生長的長春花多倍體細胞接種到合成培養基內，接種量為300g/L，在28。C，避光條件，80轉/分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養6 .天得到富含文多靈的細胞。收獲細胞，培養液經調整后可返回反應器繼續反復利用。合成培養基在改良的MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞血酸得到的培養基)中，添加蔗糖60g/L，卩引哚乙酸(IAA)2mg/L， 6 —卞氨基嘌呤(6—BA) 3mg/L，用酸或堿將pH值調整到5.6，在115。C， 0.1MPa壓力下消毒15分鐘后冷卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A10^ig/L、苯丙三氮唑1.5nmol/L、苯環丙胺20nmol/L、乙酸酐40pl/L、二硫蘇糖醇20mg/L)，用無菌的酸或堿將pH值調整到5.6，制成合成培養基；3、文多靈的提取將步驟2合成培養得到的富含文多靈的細胞置于提取灌中，經過高速攪拌(300 轉/分)破碎，加入lml/g鮮細胞量的體積百分濃度為95%的甲醇溶液，在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸乙酯，用硫酸調pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸干后獲得含有文多靈的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中文多靈的含量，結果表明，文多靈含量達到1.1mg/g細胞干重。實施例6、利用長春花細胞大規模培養生產文多靈 1、長春花細胞系的培養-1)長春花愈傷組織的獲得將長春花的幼莖作為外植體，用70%的乙醇表面殺菌30-50秒后投放到5-15% 次氯酸鈉溶液中二次殺菌10-20分鐘，然后用無菌水沖洗三次，取出后在超凈工作臺中將幼莖切成2毫米長的莖斷，接種到脫分化培養基中，在20001x， 12-16小時照光，25度左右室溫下培養3-4周，即可獲得白色愈傷組織。再將愈傷組織放在步驟2)所述繼代馴化培養基中繼代培養3次以上，同時篩選得到生長速度快，質地松軟，生長量穩定地細胞系。脫分化培養基的配制在MS培養基中，添加吲哚乙酸5.0mg/L，細胞分裂素6-BA 5.0mg/L， 50g/L蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到5.8，再添加6. 5g/L瓊脂，在 115°C， 0. IMPa壓力下消毒15分鐘后，經冷卻制成斜面脫分化培養基。2) 長春花愈傷組織塊的繼代馴化培養將步驟1)所述誘導形成的愈傷組織細胞系接種在下述繼代培養基中進行3次以上的繼代培養，培養條件為2(TC室溫，避光條件，培養周期為3周。在繼代培養過程中，篩選出結構疏松以及生長速度較快的愈傷組織進行繼代培養；繼代培養基的配制在MS培養基的基礎上添加5. Omg/L的植物細胞生長素NAA， 5. Omg/L的植物細胞分裂素6-BA， 60g/L蔗糖、6. 5 g/L瓊脂，經U5。C， 0. IMPa壓力下消毒15分鐘后經冷卻制成平板馴化培養基。3) 長春花多倍體細胞的誘導在MS培養基中加入40mg/L秋水仙堿(Sigma， C3915)，做成液體誘導培養基，步驟2)獲得的結構疏松生長速度較快的愈傷組織接種在該誘導培養基內，在2(TC，避光，100rpm/分轉速的搖床上振蕩培養7天。收集細胞后再接種在無秋水仙堿的繼代培養基中，反復馴化培養三次以上，通過生物積累量測定篩選到生長速度更快(生長速度超過5倍接種細胞量/培養周期)的多倍體細胞系；經細胞醋酸洋紅或銀染色后通過顯微檢測表明，該細胞系為混合多倍體細胞系。4) 長春花多倍體細胞的擴增培養將步驟3)得到的長春花混合多倍體細胞系接種在擴增培養基上，在25t:，黑暗條件下進行擴增培養2.5周后，獲得接種量IO倍以上的生長旺盛的多倍體細胞。擴增培養基的制備方法為在改良的MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L 的抗壞血酸得到的培養基)中，添加2mg/La—萘乙酸(NAA) ， 4mg/升KT和30g/L 蔗糖，然后用酸或堿將pH值調整到6，再添加6g/L瓊脂，在115'C， O.lMPa壓力下滅菌15分鐘后，制成擴增固體培養基。2、文多靈合成將步驟1擴增培養得到的旺盛生長的長春花多倍體細胞接種到合成培養基內，接種量為300g/L，在27'C，避光條件，80轉/分的搖床或大型生物反應器中懸浮培養7 天得到富含文多靈的細胞。收獲細胞，培養液經調整后可返回反應器繼續反復利用。合成培養基..在改良的MS培養基(按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞血酸得到的培養基)中，添加蔗糖50g/L，卩引哚乙酸(IAA)lmg/L， 6 —卞氨基嘌呤(6—BA) 2mg/L，用酸或堿將pH值調整到6，在115。C， O.lMPa壓力下消毒15分鐘后冷卻處理；冷卻后再添加過濾除菌的組合前體(乙酰輔酶A25嗎/L、苯丙三氮唑1.0nmol/L、苯環丙胺25pmol/L、乙酸酐25pl/L、二硫蘇糖醇40mg/L)，用無菌的酸或堿將pH值調整到6，制成合成培養基；3、文多靈的提取將步驟2合成培養得到的富含文多靈的細胞置于提取灌中，經過高速攪拌(300 轉/分)破碎，加入lml/g鮮細胞量的體積百分濃度為95%的乙醇溶液，在室溫條件下萃取，然后減壓(0.01MP)濃縮獲得粗提物，再加入二倍體積的乙酸乙酯，用硫酸調pH值為8.0后，迅速搖蕩，萃取生物堿三次，減壓蒸千后獲得含有文多靈的混合物。用高效液相色譜(HPLC)檢測該混合物中文多靈的含量，結果表明，文多靈含量達到1.07mg/g細胞干重。
權利要求
1、一種生產文多靈的方法，是將長春花多倍體細胞株接種于合成培養基中，于20～28℃，培養3～7天得到富含文多靈的細胞；所述合成培養基為在基本培養基中添加0～4mg/L植物細胞生長素、0～4mg/L植物細胞分裂素，30～60g/L蔗糖、10～40μg/L乙酰輔酶A、0.5～1.5μmol/L苯丙三氮唑、5～30μmol/L苯環丙胺、10～40μl/L乙酸酐和10～40mg/L二硫蘇糖醇得到的液體培養基。
2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述長春花多倍體細胞株接種于合成培養基的接種量為200 300g/L。
3、根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述合成培養是在80 130rpm/ 分轉速搖培。
4、根據權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述長春花多倍體細胞株是將長春花愈傷組織細胞進行多倍體誘導培養得到的。
5、根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述長春花多倍體細胞株在合成培養之前在20 25"C，避光條件下擴增培養2 3周；所述擴增培養基為基本培養基中添加0 4mg/L植物細胞分裂素，0 4mg/L 植物細胞生長素，20 50g/L蔗糖得到的固體培養基。
6、根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述長春花多倍體細胞株在所述擴增培養之前進行繼代培養3代以上；所述繼代培養用培養基為基本培養基中添加20-60g/L蔗糖，1. 0-5mg/L植物細胞生長素和1. 0-5mg/L植物細胞分裂素的培養基；所述繼代培養的條件為20 25。C，避光條件。
7、根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述多倍體誘導培養是將長春花愈傷組織細胞用含10-40mg/L秋水仙堿的基本培養基培養得到長春花多倍體細胞株。
8、根據權利要求1-7中任意一項所述的方法，其特征在于所述基本培養基為按照Murashige&Skoog培養基的配方，將其中的CuS04 5H20和CoCl2 6H20的添加量提高到0.1mg/L，再添加lmg/L的抗壞血酸得到的培養基；所述植物細胞分裂素為6 —卞氨基嘌呤或激動素；所述植物細胞生長素為吲哚乙酸或a—奈乙酸。
9、根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述擴增培養基的pH值為5.6 . 7.0;所述合成培養基的pH值為5.8 7.0。
10、根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述方法中，還包括將所述富含文多靈的細胞用溶劑萃取獲得含有文多靈的粗提物，再經過純化獲得文多靈；所述溶劑為體積百分濃度為95%的乙醇溶液或甲醇溶液。
全文摘要
本發明公開了一種生產文多靈的方法。該方法是將長春花多倍體細胞株接種于合成培養基中，于20～28℃，培養3～7天得到富含文多靈的細胞；所述合成培養基為在基本培養基中添加0～4mg/L植物細胞生長素、0～4mg/L植物細胞分裂素，30～60g/L蔗糖、10～40μg/L乙酰輔酶A、0.5～1.5μmol/L苯丙三氮唑、5～30μmol/L苯環丙胺、10～40μl/L乙酸酐和10～40mg/L二硫蘇糖醇得到的液體培養基。本發明的方法用長春花細胞培養生產文多靈，可穩定地實現文多靈的工業化生產，并且其生產成本較低，培養周期短，不受自然環境以及氣候的影響，可以實現周年生產。
文檔編號C12N5/04GK101333511SQ20081011776
公開日2008年12月31日申請日期2008年8月5日優先權日2008年8月5日
發明者云劉, 郭志剛申請人:清華大學

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