專利名稱：：利用牛體細胞核移植克隆胚胎的方法
技術領域：
：本發明涉及哺乳動物繁殖
技術領域：
，具體涉及一種利用利用牛體細胞核移植克隆胚胎的方法。
背景技術：
：體細胞核移植在20世紀末期出現了突破性進展，自從多莉羊誕生之后，越來越多的體細胞克隆動物降生，體細胞核移植的重耍意義逐步得到人們的認可。但是該技術構建的重構胚的發育率低，而在制作重構胚的技術中，供核細胞的前處理以及顯微注核去核操作是關鍵的限制步驟。目前人們對供核細胞的前處理主要有血清饑餓法(Campbelletal.,1996)和接觸抑制法(Kasinathanetal.,2001),以期達到細胞同期化的目的。還有人認為傳代次數(.干.玉閣等，1999)對核移植的效果也有影響。此外還有一些其它特殊處理(Sullivanetal.，2004)的報道。但是各種方法是否有顯著的效果尚無定論。在卵母細胞的去核方法上，目前的主流方法是盲吸法，盲吸法以第一極體為參照進行去核，乂包括吸引除核法(McGrathJetal.Science,1983,220:1300)和擠壓除核法(Shigaetal.,1999)兩種方法。去核方法還有(干.振飛等，2006)和手工克隆法(Peuraetal.，1998)。這三種方法各有利弊，盲吸法沒有對卵母細胞的化學性損傷，但是第一極體勾核的位置隨著卵母細胞的成熟會發生偏移，閃此i核率不太高，卵母細胞胞質損火較多。去透明帶核移植法操作較為繁瑣，而且其實驗步驟中也有染色及紫外照射的過程，同樣會對細胞有傷害。在構建克隆胚哪種方法最佳上至今無統一觀點。在重構胚的構建上主耍有電融合法(Wilmutetal.,1997)和胞質內注射法(Wakay咖aetal.，1998)兩種。"多莉"就是使用電融合法構建的。然而，上述方法所面臨著共同的難題是效率低下、過程繁瑣。顯微鏡下的操作環境是不利T細胞生存的，操作時間過長可能對胚胎發育有害。由于顯微操作對儀器設備要求高并且技術性強，閃此操作人員的熟練程度也是一個制約因素，培養一名熟練的實驗人員也需要很長的時間，所以當前亟待解決的一個難題就是發明一種簡單、高效的核移植方法，以利丁-核移植技術在更廣范圍的推廣與應用。胞質內直接注射法是由精子胞質內直接注射法(ICSI:intracytopasmicsper邁injection)發展而來(CollasandBarnes,1994)。胞質內注射的關鍵是注核以前的破膜處理以使供體細胞的質膜破裂。直接注核法主要分為兩種方式Piezo驅動裝置輔助的S接注核和恃通顯微操作系統輔助的直接注核(Wolfetal.,1998:Fulkaetal.,1998;Heymanetal.，1998;Campbelletal.，2007)。胞質內直接注射法是將供體破膜后,借助Piezo驅動注射裝置將核胞體直接注入到受體胞質中，研究人員采用此種方法以成功獲得克隆小鼠(Wakayamaetal.,1998)、克隆豬。后者則不需要該裝置，用普通的顯微操作系統即可實現復雜的胞質內H接注射。為了進一步簡化核移植操作過程,一些研究人員嘗試利用未進行破膜處理的供體細胞進行全細胞直接注射核移植，從而避開了核的分離和電融合的過程，該種方法也成功獲得克隆亞洲黃羊后代(Leeetal.,2005:Chenetal.，2007;Zhouetal.，2000)。胞質內全細胞直接注射法大大簡化了核移植操作流程，降低了對SCNT對操作人員和試驗設備的耍求為該技術的推廣應用奠定了基礎。有關胞質內注射法硏究的進展情況見表1。表1體細胞克隆發展過程中重大里程碑<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>迄今為止，尚未見有關利用不經血清饑餓和破膜處理的供體細胞做供體，采用全細胞直接注射法生產牛克隆胚胎的研究。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術存在的缺陷，利用利用牛卵母細胞去核，利用核移植方法獲得牛胚胎克隆的方法。本發明在供體細胞培養方面盡量簡化不必耍的步驟，在去核操作中改進了現有的盲吸法去核，采用全細胞直接注射法成功的獲得了牛克隆囊胚。本發明經過火量重復試驗己經證明了該方法簡便、快速、有效和和穩定，能夠獲得比較理想的囊胚率，對于其他哺乳動物的核移植有一定參考和借鑒意義。本發明是這樣實現的一種獲得牛克隆胚胎的方法，其步驟包括1)取牛卵母細胞在成熟培養液中培養；2)將牛供體細胞注入受體卵母細胞中，獲得重構卵母細胞；3)將步驟2)的重構卵母細胞激活，獲得重構胚，本發明的特征在于，將取出的牛卵母細胞在改良的成熟培養液中培養22h,培養溫度391C,使所述的牛卵母細胞處于第二次減數分裂中期，去除成熟卵母細胞的細胞核，獲得牛受體細胞，采用全細胞直接注射法(Chenetal.,2007)將牛供體細胞注入所述的牛受體細胞中，獲得牛重構胚，將所述牛重構胚置于改良的成熟培養液的微滴中培養3-4h，然后將所述的牛胚胎暴露于激活劑l中激活5min，然后轉移到激活劑2中激活3-4h，將激活的牛重構胚在胚胎培養液中培養7天(在牛重構胚培養第一天不添加胎牛血清，從體外培養的第二天開始添加10%體積的胎牛血淸，以達到提高牛重構胚發育潛能的效果)。本發明采用的培養液或培養基組成成分及配比如下輯酸緩沖液(DPBS):氯化鈉8.0g/L+氯化鉀0.2g/L+磷酸氫鈉1.15g/L+磷酸二氨鉀0.2g/L吸卵液肝素10ug/mL、3mg/mLBSA+丙酮酸鈉2.2mg/100mL+青霉素100IU/mL+鏈霉素100IU/mL+磷酸緩沖液(D-PBS),4"保存卞個月改良的成熟培養液配比如下以TCM-199商品培養基(液體培養基，購G美國Gibco公司產品，貨號12340)為基本培養基，附加胎牛血清10%,乙基哌嗪乙磺酸25mmo1，閃酮酸鈉0.55mg/mL,青霉素100IU/mL，鏈毒素100IU/mL,促卵泡素0.1IU/mL、促黃體素0.1IU/mL、雌激素lug/mL、表皮生長因于100ng/mL，pH7.0-7.2;激活培養基-1配比如下基礎液為改良的成熟培養液+離子霉素(Ionopbore,購CI美國Sigma公司，貨號19657)5,1/L,pH7.0-7.2;激活培養基-2配比如下基礎液為改良的成熟培養液+二甲基氨基嘌呤(6-DMAP,購自美國Sigma公司，貨號P2629)2咖ol/L，pH7.0-7.2;胚胎培養液基配比如下氯化鈉107.63mmol/L+氯化鉀7.16mmol/L+磷酸二氫鉀1.19i咖ol/L+硫酸鎂1.51,ol/L+青毒素鈉0.012g/L+硫酸鏈霉素50wg/L+乳酸鈉5.35mmol/L+碳酸氫鈉25.00mmol/L+丙酮酸鈉7,27咖ol/L+氯化鈣1.78咖ol/L+肌醇2.77mmol/L+酚紅10.0ug/mL+枸杞酸鈉0.34咖ol/L+必需氨基酸30.0u1/ml+非必霜氨基酸10u1/mL+L-谷氨酰胺0.20mmol/L+BSA3mg/mL，pH7.0-7.2。卵母細胞去核液基礎液為成熟培養液，添加5ng/mL細胞松弛素B(CytochalsinB,購自美國Sigma公司，貨號C6762)+10%聚乙烯吡咯烷酮(重量/體積)卵母細胞注核液注核液的基礎液為成熟培養液，然后在基礎液中添加l(m聚乙烯吡咯烷酮(重量/體積)。作為本發明的關鍵操作步驟，下列的技術特征是重要的上述步驟中所述的牛供體細胞不經過血清饑餓和體外培養。所述的供體細胞是牛卵丘細胞，該牛供體細胞可以是顆粒細胞。該牛供體細胞可以不經破膜處理。其中所述的牛重構胚的培養采用卵丘細胞單層共培養。所述的牛卵丘細胞單層與受體卵母細胞同源。所述的牛重構胚的培養采用牛卵丘細胞單層共培養。本發明的有益效果是1、本發明在供體細胞處理方面作了大膽的嘗試，對核移植的供體細胞未做任何處理，直接采用從牛卵丘細胞-卵母細胞復合體上脫下的卵丘細胞，省i了血淸饑餓和細胞膜的破碎過程，從而簡化了試驗步驟，降低了對操作人員的試驗操作技能的耍求，節省了試驗時間，降低了細胞被污染的兒率，有益于牛重構胚的后續發育。2、本發明在去核注核方面運用了改進的去核方法即以去核針尖刺破透明帶，然后在刺破口旁以針尖擠壓透明帶依靠透明帶內的正壓將卵母細胞核擠出，減少了丟失卵胞質的量，同時減少了對卵母細胞的損傷，從而有利于重構胚的后續發育。更詳細的技術方案見《具體實施方式》。圖l:是培養前的牛卵母細胞(光學顯微鏡，100x);圖2:是培養成熟的牛卵母細胞(光學顯微鏡，200x);圖3:是脫除卵丘細胞的牛卵母細胞(150X);圖4:是經Hoechst染色的成熟牛卵母細胞(400x);圖5:是以卵丘細胞為供體構建的4-細胞期牛克隆胚胎(400x);圖6:發育至16-32-cell細胞期牛重構胚(400x);圖7:是擴張的牛重構胚(300X);圖8:是孵化中的牛重構胚(400x)。具體實施例方式實施例l1、采樣將從湖北省武漢市紅旗肉牛居宰場采集的健康黃牛卵巢保存于39"C的DPBS，配方見《
發明內容》，3小時內帶回實驗室2、牛卵母細胞收集與培養用吸有少量吸卵液的，配方見《
發明內容》，注射器(18號針頭)從牛卵巢表面3-8mm卵泡中吸取牛卵丘細胞-卵母細胞復合體(COCs),將該COCs經DPBS洗滌3遍后，用成熟培養液(配方如上所述)洗潘3遍，轉入100ul成熟培養液微滴中培養22h(培養條件是39X:、相對濕度為1009i，5%(^培養箱)；3、牛卵母細胞的成熟度判定將在成熟培養液中培養了22h的牛卵母細胞在0.1%透明質酸酵中經反復吹打3min以脫凈外圍卵丘細胞。然后將胞質均勻，形狀規則，脂滴含量豐富并且排除第一極體的牛卵母細胞轉入含有10ug/mL細胞松弛素B(Cytochalasin)的50ul的去核微滴或去核液(配制方法是在上述的改良的成熟培養液中添加10ug/mL細胞松弛素B)中。用石蠟油覆蓋該微滴，置于39'C,相對濕度為100%,5%002的培養箱中培養備用。在直徑為60咖的培養皿蓋中制作去核和注核微滴；4、供體細胞的準備從來自于一頭遺傳背景確定的優良雌性黃牛卵巢中抽取牛卵丘細胞-卵母細胞復合體(COCs)單獨進行成熟培養。在培養22h后用0.1%透明質酸酶在培養微滴中用自制吸管(willi柳，2006)輕輕吹打，脫下牛卵丘細胞-卵母細胞復合體外圍卵丘細胞，然后，吸取10ul上述成熟培養液在90ul的去核液中，配方見《
發明內容》，充分混勻，經3次10倍稀釋后，吸取10ul含卵丘細胞的細胞懸液加入50ul的去核微滴，配方見《
發明內容》，中；5、將步驟3中獲得成熟的牛卵母細胞去核使成熟的牛卵母細胞第一極體位于類似于鐘表盤的3點方向，固定針位于牛卵母細胞笫一極體正對面，用去核針的針尖輕輕刺破透明帶，然后用針尖在刺破點旁邊輕輕擠壓透明帶,使牛卵母細胞的細胞核連同紡錘體被擠到透明帶外；在熒光顯微鏡下觀察卵母細胞有無熒光特征，如無藍色炎光者為去核成功。最后將成功去核的牛卵母細胞轉移到注核微滴中，配方《
發明內容》，培養10min。6、牛重構胚的構建先將步驟3獲得的牛卵丘細胞加入注核微滴做供體，再用注核針吸如一個細胞膜完整、形態正常的細胞作為供體，然后用尚定針問定該牛卵母細胞，找到第一極體并使其位于類似于鐘表盤的3點方向。用注核針沿極體方向刺入牛卵母細胞，并將刺口適量擴大。抽出注核針在刺口上下—擠壓卵母細胞，以便將極體和細胞核一并擠山。如擠山物質收縮成緊湊的團，可判斷為去核成功。擠出細胞核后馬上將供體細胞沿上述刺破口注入卵母細胞胞質內，然后將構建的重組胚胎轉移到微滴的一邊并釋放，重復以上步驟直到所有卵母細胞的顯微操作完成為止。7、將步驟6所得的重構胚轉到改良的成熟培養液的微滴中培養(使其休整)3-4h。8、將步驟7所得的細胞膜完整的重構胚轉移到激活培養基-l中激活5min，然后轉移到激活培養基-2中3-4h,激活完成后轉入胚胎培養液微滴中培養，每大換液一次，觀察記錄發育情況。表3不同類型牛供體細胞對SCNT牛重構胚發育潛能的影響細胞類荊重復次數卵裂率(％)囊胚率(％)雜胚率i囊胚率n新鮮牛卵丘細胞438.18±6.02(63/165)原代牛卵丘細胞341.35±3.71(53/128)第3代牛顆粒細胞439.86±6.07(57/143)38.10±5.65(24/63)15.46±3.69(19/165)39.62±4.62(21/53)16,41±4.23(21/128)40.35±6.54(23/57)16.08±5.89(23/143)注同列不同上標者差異顯著(P〈0.05);囊胚率I:囊胚數/卵裂胚胎數；囊胚率II:囊胚數/成熟卵母細胞數表4不同處理的牛供體細胞對SCNT牛重構胚發育潛能的影響不同處理的細胞重復次數卵裂率(％)囊胚率(％)囊胚率I囊胚率II饑餓3d原代卵丘441.97±2.16(61/147)匯合3d原代卵丘541.35±3.71(67/162)匯合4d原代卵丘439.69±6.07(52/131)31,15±5.65(19/61)12.93±5.69(19/147)32.83±7.68(22/67)13.58±4.23(22/162)34.61±5.47(18/52)13,74±5.47(18/131)注同列不同上標者差異顯著(P〈0.05);囊胚率I:囊胚數/爽i裂胚胎數本表中卵丘(即細胞)為牛卵丘細胞。囊胚率n:囊胚數/成熟卵母細胞數參考文獻1-CollasP，BarnesFLNucleartransplantationbymicroinjectionofinnercellmassandgranulosacellnuclei,iftx)印rorfZtev;1994，38:264—2672.WolfE，ZakhartchenkoV，BremG.Nucleartransferinmammals:recentdevelopmentsandfutureperspectives,/5/otec/"o_/，1998，65:99-1103-Fulka丄Jr.，FirstNL，LoiP，MoorRM.Cloningbysomaticcellnucleartransfer.5ioes幼7S1998,20:847-8514.HeymanY，VignonX,ChesneP,LeBourhisD,MarchalJ,RenardJP.Cloningincattle:fromembryosplittingtosomaticnucleartransfer,y印ro0^Ai/trZter，1998,38:595-6035.CampbellKH,FisherP,ChenWC，ChoiI，KellyRD，LeeJH,XhuJ.Somaticcellnucleartransfer:Past,presentandfutureperspectives.7Serio卵加Jo57'2007，68Su卯l1:S214-2316.WakayamaT，PerryAC，ZuccottiM,JohnsonKR，YanagimachiR.Full—termdevelopmentofmicefromenucleatedoocytesinjectedwithcumuluscellnuclei,他fure,1998,394:369-3747.LeeBC，KimMK,JangG,0hHJ,YudaF，KiraHJ，HosseinMS,KimJJ,KangSK，SchattenG，HwangWS.Dogsclonedfromadultsomaticcells.Afefure,2005,436:6418.ChenDY,J"iangMX,ZhaoZJ,WangHL,SunQY,ZhangLS，LiRC,CaoHH，ZhangQJ，MaDLCloningofAsianyellowgoat(C.hircus)bysomaticcellnucleartransfer:telophaseenucleationcombinedwithwholecellintracytoplasmicinjection,ifoi/e/rc/Zfev;2007，74:28-349國ZhouQ，BoulangerL，RenardJP.Asimplifiedmethodforthereconstructionoffullycompetentmousezygotesfromadultsomaticdonornuclei.C7。77i恥2000，2:35-44。權利要求1、一種獲得牛克隆胚胎的方法，其步驟包括1)取牛卵母細胞在成熟培養液中培養；2)將牛供體細胞注入受體卵母細胞中，獲得重構卵母細胞；3)將步驟2)的重構卵母細胞激活，獲得重構胚，其特征在于，將取出的牛卵母細胞在改良的成熟培養液中培養22h，培養溫度39℃，使所述的牛卵母細胞處于第二次減數分裂中期，去除成熟卵母細胞的細胞核，獲得牛受體細胞，采用全細胞直接注射法將牛供體細胞注入所述的牛受體細胞中，獲得牛重構胚，將所述牛重構胚置于改良的成熟培養液的微滴中培養3-4h，然后將所述的牛胚胎暴露于激活培養基-1中激活5min，然后轉移到激活培養基-2中激活3-4h，將激活的牛重構胚在胚胎培養液中培養7天，其中改良的成熟培養液配比如下以TCM-199商品液體培養基為基本培養基，附加胎牛血清10％，乙基哌嗪乙磺酸25mM，丙酮酸鈉0.55mg/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100IU/mL，促卵泡素0.1IU/mL、促黃體素0.1IU/mL、雌激素1ug/mL、表皮生長因子100ng/mL，pH7.0-7.2；激活培養基-1配比如下基礎液為改良的成熟培養液+離子霉素5μmol/L，pH7.0-7.2；激活培養基-2配比如下基礎液為改良的成熟培養液+二甲基氨基嘌呤2mmol/L，pH7.0-7.2；胚胎培養液配比如下氯化鈉107.63mmol/L+氯化鉀7.16mmol/L+磷酸二氫鉀1.19mmol/L+硫酸鎂1.51mmol/L+青霉素鈉0.012g/L+硫酸鏈霉素50μg/L+乳酸鈉5.35mmol/L+碳酸氫鈉25.00mmol/L+丙酮酸鈉7.27mmol/L+氯化鈣1.78mmol/L+肌醇2.77mmol/L+酚紅10.0μg/mL+枸杞酸鈉0.34mmol/L+必需氨基酸30.0μl/ml+非必需氨基酸10μl/mL+L-谷氨酰胺0.20mmol/L+BSA3mg/mL，pH7.0-7.2。2、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的牛供體細胞不經過血淸饑餓和體外培養。3、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的牛供體細胞是牛卵丘細胞。4、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的牛供體細胞是牛顆粒細胞。5、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的牛供體細胞不經破膜處理。6、根據權利耍求l所述的方法，其特征是牛重構胚的培養采用牛卵丘細胞單層共培養。7、根據權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的牛卵丘細胞單層與受體牛卵母細胞同源。8、根據權利耍求l所述的方法，其特征在于，在牛重構胚培養第一犬不添加胎牛血清，從體外培養的第二天開始添加10%體積的胎牛血清。全文摘要本發明屬于哺乳動物繁殖
技術領域：
，具體涉及一種利用牛體細胞獲得克隆胚胎的方法。公開了一種簡單高效生產牛克隆胚胎的方法。根據豬體細胞膜在注入卵胞質內會在30min后自動溶解消失的研究成果，在牛中提出采用不破膜的全細胞為供體進行全細胞胞質內直接注射構建牛克隆胚胎；從而簡化了體細胞核移植的操作流程。發明特征是(1)牛卵丘-卵母細胞復合體的采集與培養；(2)卵母細胞的去核；(3)供體細胞的制備；(4)共培養細胞單層的制備；(5)重構胚的構建；(6)重構胚的激活；(7)重構胚的培養等。本發明最大的特點是易于操作、步驟簡單、結果穩定，為牛體細胞核移植技術的推廣以及進一步研究提供了一種新的思路和方法。文檔編號C12N5/10GK101302497SQ20081011582公開日2008年11月12日申請日期2008年6月27日優先權日2008年6月27日發明者于孟飛,易建明,楊利國,高國龍申請人:華中農業大學