專利名稱：新型牛卵母細胞體外成熟培養液的制作方法
技術領域：
本發明涉及胚胎工程領域，特別是涉及牛卵母細胞體外成熟液。
背景技術：
作為胚胎生物工程技術研究的基礎之一的牛卵母細胞體外成熟培養技術，自上世紀30年代起至今，許多科學研究人員在牛卵母細胞體外生長、發育領域做了大量工作，對牛卵母細胞培養條件進行了廣泛而深入地研究，并取得了較大的進展，目前牛卵母細胞體外成熟(hv"ramatrue ， IVM)培養技術體系已建立，但由于卵母細胞成熟機理、成熟調控方面尚存在
許多尚未闡明和一些亟待解決的問題，以致目前現行方法存在對卵母細胞質量要求高，體外受精率和囊胚形成率低等問題。
羊膜形成于原腸胚之前的受精第8天，羊膜組織細胞保持有前原腸胚胚胎細胞的可塑性，羊膜組織主要由來源于外胚層的羊膜上皮(amniotic epithelial cells, AECs)和來源于中胚層的羊膜間充質(amniotic mesenchyme cells, AMCs) 2類細胞組成(Whittle WL, Gibb W, ChallisJR.: The characterization of human amnion epithelial and mesenchymal cells: the cellularexpression, activity and glucocorticoid regulation of prostaglandin output. Placenta. 2000May;21(4):394-401.)，羊膜上皮細胞具有三種胚原基層細胞的分化潛能，內胚層(肝、胰)、中胚層(心肌細胞)和外胚層(神經細胞)(MikiT，LehmannT,CaiH，etal.: Stem CellCharacteristics of Amniotic Epithelial Cells. Stem Cells. 2005 Aug 4; [Epub ahead of print])。羊膜上皮細胞具有合成釋放兒茶酚胺(Elwan MA. :Synthesis of dopamine fromL-3,4-dihydroxyphenylalanine by human amniotic epithelial cells. Eur J Pharmacol. 1998 Jul3 l;354(l》Rl-2; Elwan MA, Ishii T, Sakuragawa N. et al.: Characterization of the dopaminetransporter gene expression and binding sites in cultured human amniotic epithelial cells. NeurosciLett. 2003 May 15;342(l-2):61-4.)、乙酰膽堿(Horikoshi T, Fujii T， Kawashima K, et al.:Acetylcholine increase in amniotic fluid of experimental rats for intrauterine growth retardation.Life Sci. 2003 Mar 28; 72(18-19): 2145-9; Uchida S， Suzuki Y， Araie M， Kashiwagi K, et al.:Factors secreted by human amniotic epithelial cells promote the survival of rat retinal ganglion cells.Neurosci Lett. 2003 Apr 24;341(l):l-4.)神經遞質的神經生物學功能，還可以分泌神經營養因子等生物活性物質，具有神經營養功能。目前已檢測到腦源性神經營養因子(brain-derivedneurotrophic factor, BDNF)、 NT-3、神經生長因子(nerve growth factor, NGF)和睫狀神經營 養因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF) (Uchida S, Suzuki Y, Araie M, Kashiwagi K， et al.: Factors secreted by human amniotic epithelial cells promote the survival of rat retinal ganglion cells, Neurosci Lett. 2003 Apr 24;341(l):l-4; Marvin KW, Keelan JA, Eykholt RL, et al.: Expression of angiogenic and neurotrophic factors in the human amnion and choriodecidua. Am J Obstet Gynecol. 2002 Sep;187(3):728-34.)，提示羊膜組織通過分泌釋放神經營養因子進入羊水，對胚胎神經發 育的早期階段具有重要調節作用(Uchida S, Inanaga Y, Kobayashi M, et al.: Neurotrophic function of conditionedmedium from human amniotic epithelial cells. J Neurosci Res. 2000 Nov 15;62(4):585-卯.)。此外，羊膜上皮細胞還可以分泌合成TGF、 EGF、 bFGF禾P HGF等生長因 子，因此應該可以運用去細胞羊膜基質作為滋養層促進體外培養胚胎干細胞的分化，運用羊 膜組織提取物促進未成熟卵細胞體外成熟。綜上所述，羊膜上皮細胞可能分泌的已知和某些 未知生物活性物質，能夠正向調節培養細胞的生物學特性。
發明內容
針對牛卵母細胞受精率低和囊胚形成率低的問題，結合羊膜上皮細胞的特點，本發明提 供一種新型牛卵母細胞體外成熟培養液，提高了牛卵母細胞成熟率、卵母細胞受精率和囊胚 形成率。
新型牛卵母細胞體外成熟培養液，其特征在于在IVM培養基內添加羊膜上皮細胞或/ 和羊膜上皮細胞培養液的上清液。
所述羊膜上皮細胞培養液的上清液為培養5-7天的羊膜上皮細胞的上清液。 所述羊膜上皮細胞培養液的上清液的加入量為100ml IVM培養基中加入2-20ml羊膜上皮 細胞培養液的上清液.
所述羊膜上皮細胞為l-7代的羊膜上皮細胞。 所述羊膜上皮細胞為人或牛的羊膜上皮細胞。
所述IVM培養基為M199+10% FBS+10嗎/ml FSH+0.1嗎/ml LH+l嗎/ml E2。
利用上皮細胞的特性，我們在體外培養羊膜上皮細胞，最后分離得到羊膜上皮細胞和羊 膜上皮細胞培養液的上清液，將其添加到IVM培養液中構成新型牛卵母細胞體外成熟培養 液。羊膜上皮細胞和羊膜上皮細胞培養液的上清液對牛卵母細胞成熟進行正向調節，羊膜上
皮分泌、合成牛卵母細胞體外成熟生物活性物質，從而提高牛卵母細胞成熟率，實驗證明
與原IVM培養液相比，新型牛卵母細胞體外成熟培養液能提高卵母細胞受精率和囊胚形成本發明在常規的IVM培養液中添加羊膜上皮細胞或其培養上清液，建立牛未成熟卵母細 胞IVM培養新體系，以提高IVM牛卵母細胞質量和成熟率，解決目前培養方法中受精率低 和囊胚形成率低的問題。
圖1體外培養牛卵母細胞成為成熟卵細胞的方法流程示意圖
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明。 實施例1
1、卵母細胞體外成熟培養方法(羊膜上皮細胞培養液的上清液作為IVM培養基添加物) U羊膜上皮細胞培養上清液-體外成熟(AECS-IVM)添加物及培養基制備 l丄l約lmm3的牛或人羊膜剪成碎片，在含0.125^Trypsins (胰酶)的D-hank's， 37'C震搖 30min，轉速400 600rpm;
l丄2以細胞篩過濾混懸液，收集羊膜上皮細胞；
12丄3按常規濃度(細胞數在105~106個/瓶)接種羊膜上皮細胞于75cmH音養瓶；
l丄4體外培養羊膜上皮細胞，取5-7天內的培養上清液；
1.1.5離心去細胞及細胞碎片，4°C， 1500—2500rpm， 15-30分鐘；
l丄6取上清液，去沉淀物，0.22pm過濾器過濾上清液，分裝儲于存-80'C深低溫冰箱，作為備用。
1.1.7 AECS-IVM培養基制備每100ml IVM培養基(M199+10% FBS+10^g/ml FSH+0.1嗎/ml LH+l嗎/ml E2)，添加培養羊膜上皮細胞上清液2-20ml， 1N NaOH調節pH7.4-7.8， 4。C儲存待用。
1.2未成熟牛卵子的體外成熟培養 1.2.1常規采集、收集牛卵母細胞；
1.2.2牛卵母細胞AECS-IVM培養基中在充分平衡2小時，用含HEPES的AECS-IVM培養基 洗三遍，不含HEPES的AECS-IVM培養基洗兩遍。
1.3 體外成熟(IVM)
1.3.1將處理好的牛卵母細胞上述AECS-IVM培養基中，再一起將其放入C02培養箱內培養 22小時，培養條件38.5。C,4.5。/()C02飽和濕度。
1.3.2整個操作過程盡量縮短時間，從檢卵到入培不超過30分鐘，以60枚計算。1.3.3培養22小時后檢測鑒定成熟卵母細胞情況，卵母細胞外圍的顆粒細胞會出現明顯的擴散 現象，而且可看到第一極體。
1.4體外受精(IVF) 1.4.1常規準備精液；
1.4.2常規處理IVM牛卵細胞，選擇成熟牛卵母細胞置IVM培養基中，體外受精備用。 1.4.3受精時將成熟牛卵母細胞和準備的精液放入IVF培養盤，放入C02培養箱，培養19-32 小時。培養條件38.5'C,4.5。/。C02飽和濕度。
1.5體外培養(IVC)
將IVF液滴中受精卵母細胞撿出，放入IVC液滴中，放入C02培養箱中進行培養。每隔48
小時更換培養液一次。
培養第一天出現2-細胞胚胎
培養第二天出現4-細胞胚胎
培養第三天出現8-細胞胚胎
培養第四天出現16-細胞胚胎
培養第五天出現32-細胞胚胎
培養第六天出現晚桑及早期囊胚
培養第七天出現囊胚。
實施例2
1、卵母細胞體外成熟培養方法(羊膜上皮細胞作為IVM培養基添加物) U培養羊膜上皮細胞作為IVM滋養細胞
l丄l約lmm3的羊膜剪成碎片，在含0.125%Trypsins D-hank's， 37'C震搖30min，轉速400 600rpm
l丄2以細胞篩過濾混懸液，收集羊膜上皮細胞 l丄3按常規濃度接種羊膜上皮細胞于75cmn音養瓶
l丄4體外培養牛或人羊膜上皮細胞，傾出上清液，加入100ml IVM培養基(M199+10% FBS+10昭/mlFSH+0.1嗎/mlLH+l嗎/mlE2)，作為羊膜上皮細胞-體外成熟(AEC-IVM)培養
體系1.2未成熟牛卵子的體外培養 1.2.1常規采集、收集牛卵母細胞；
1.2.2牛卵母細胞AEC-IVM培養基中在充分平衡2小時，用含HEPES的AEC-IVM培養基洗 三遍，不含HEPES的AEC-IVM培養基洗兩遍。
1.3 體外成熟(IVM)
1.3.1將處理好的牛卵母細胞放入AEC-IVM培養基中，再一起放入C02培養箱內培養22小時， 培養條件38.5°。，4.5%<:02飽和濃度。
1.3.2整個操作過程盡量縮短時間，從檢卵到入培不超過30分鐘；以60枚計算。
1.3.3培養22小時后檢測鑒定成熟牛卵細胞，成熟卵母細胞情況，卵母細胞外圍的顆粒細胞會
出現明顯的擴散現象，而且還會看到第一極體(包裹較嚴的不容易看清)。
1.4體外受精(IVF) 1.4.1常規準備精液；
1.4.2常規處理IVM牛卵細胞，選擇成熟牛卵母細胞置IVM培養基中，體外受精備用。 1.4.3受精時將IVF培養盤放入C02培養箱，培養19-32小時。
1.5體外培養(IVC)
將IVF液滴中受精卵母細胞撿出，放入IVC液滴中，放入C02培養箱中進行培養。每隔48
小時更換培養液一次。
培養第一天出現2-細胞胚胎
培養第二天出現4-細胞胚胎
培養第三天出現8-細胞胚胎
培養第四天出現16-細胞胚胎
培養第五天出現32-細胞胚胎
培養第六天出現晚桑及早期囊胚
培養第七天出現囊胚。
對照組用上述IVM培養基，不添加任何其它物質，培養方法及操作與實施例1同。實驗結 果見表1
表l培養基處理卵 母 細胞數成熟率 (%)受精率 (%)囊胚率 (%)
常規IVM培養基16675.3a (125/166)48.8a (81/166)28.3a (47/166)
加入羊膜上皮細胞 上清液的IVM培養 基21389.2b (1術213)59.2b (126/213)35.2a (75/213)
加入羊膜上皮 細胞的IVM培養基23588.5b (208/235)59.6b (140/235)36.2a (85/235)
上表用t檢驗進行統計分析。同一欄數值中具有不相同上標字母a、 b表示差異顯著(PO.05) 從上表可以看出，實施例1添加了培養羊膜上皮細胞上清液的IVM培養基和實施例2中添加 了羊膜上皮細胞的IVM培養基，較常規IVM培養基成熟率大大提高，且在統計學意義上有 顯著差異(P<0.05)，在受精率上也有顯著差異(PO.05);而囊胚率在統計學上沒有差異 (P〉0.05)，但在數值上有較大的提高。
權利要求
1、新型牛卵母細胞體外成熟培養液，其特征在于在IVM培養基中添加羊膜上皮細胞或/和羊膜上皮細胞培養液的上清液。
2、 根據權利要求1所述的新型牛卵母細胞體外成熟培養液，所述羊膜上皮細胞培養液 的上清液為培養5-7天的羊膜上皮細胞的上清液。
3、 根據權利要求2所述的新型牛卵母細胞體外成熟培養液，所述羊膜上皮細胞培養液 的上清液的加入量為100mlIVM培養基中加入2-20ml羊膜上皮細胞培養液的上清液。
4、 根據權利要求1所述的新型牛卵母細胞體外成熟培養液，所述羊膜上皮細胞為1-7 代的羊膜上皮細胞。
5、 根據權利要求1所述的新型牛卵母細胞體外成熟培養液，所述羊膜上皮細胞為人或 牛的羊膜上皮細胞。
6.根據權利要求1所述的新型牛卵母細胞體外成熟培養液，所述IVM培養基為 M199+10% FBS+10嗎/ml FSH+0.1嗎/ml LH+l嗎/ml E2。
全文摘要
本發明涉及“新型牛卵母細胞體外成熟培養液”屬于胚胎工程領域。本發明在常規的IVM培養液中添加羊膜上皮細胞或其培養液的上清液，建立牛未成熟卵母細胞IVM培養新體系，以提高IVM牛卵母細胞質量和成熟率，解決目前培養方法中受精率低和囊胚形成率低的問題。
文檔編號C12N5/06GK101591637SQ20081011259
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月26日 優先權日2008年5月26日
發明者李榮旗 申請人:李榮旗