專利名稱：：小立碗蘚抗低溫基因Ppviolaxanthinde-epoxidase及其蛋白和載體的制作方法
技術領域：
：本發明屬于生物基因工程領域，具體地，本發明涉及一種小立碗蘚抗低溫脅迫基因基因尸/w'o7a,a/7f/j'/7flfe-印on'c/ase及其編碼的蛋白質、含有該基因的載體、和轉基因細胞系。
背景技術：
：低溫、干旱、高鹽是限制植物生長發育、地理分布、形態建成等的重要環境脅迫因素。這些脅迫因素作用的結果均導致植物細胞失水，影響植物細胞的滲透壓，進而影響植物正常的生理代謝，嚴重時導致植物的死亡。通過對一些模式植物的研究發現這三種脅迫因素誘導表達的功能蛋白及轉錄因子相互交差，因此，尋求同時具有忍耐低溫、干旱、高鹽脅迫的綠色植物來研究植物的非生物脅迫極有必要。對苔蘚植物的基礎研究標明苔蘚植物是極地低溫度環境的先鋒植物之一，同時它也分布在極端干旱的沙漠。在漫長的生物進化歷程中，苔蘚植物形成了一套獨特的適應低溫干燥等惡劣環境的機制。對小立碗蘚非生物脅迫研究發現(Frank等，2005)，與其他高等植物相比，小立碗蘚(州/sc譜/fre〃apateys)可以忍耐極端的生態環境。如，擬南芥在lOOmM的NaCl處理下即受到傷害(Sunkar等，2003),而小立碗蘚可以忍耐350mM的NaCl溶液，在緩慢的逐漸提高的鹽處理條件下，小立碗蘚可以忍耐600mM的NaCl脅迫。500mM的山梨醉處理三天后，小立碗蘚仍可以幸存。當小立碗蘚失水92%時仍可恢復正常生長發育。在脫水、鹽漬和滲透脅迫條件下，Frank等(2003)分析鑒定了一系列上調基因，其編碼的蛋白主要有膽堿脫氫酶(cholinedehydrogenase)、甜菜堿(glycinebetaine)、三氫吡咯羧酸鹽(delta11-pyrroline-5-carboxylate)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、韋丐依賴蛋白激酶(calcium-dependentproteinkinase)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPkinase)等。在(TC低溫脅迫七天后小立碗蘚仍可恢復生長(Minami等，2005)，且在冷馴化過程中激活了LEA(late-embryogenesis-abundant)蛋白的轉錄，提高了其冰凍耐受能力。因此從苔蘚植物中克隆抗逆相關基因并進一步通過轉基因等技術應用于提高農作物的抗逆性是目前研究的熱點之一。
發明內容為了解決上述問題提出并完成了本發明。本發明的目的是提供一種高效的抗低溫脅迫相關基因。本發明的另一目的是提供上述基因編碼的蛋白質。本發明的再一目的是提供含有上述基因的載體。本發明的再一目的是提供表達上述基因的轉基因細胞系。具體地，本發明的發明人將培養至15葉左右的小立碗蘚莖葉體在0。C下經過不同時間的處理與非處理小立碗蘚莖葉體組成差異材料，通過cDNA-AFLP技術得到差異表達的EST，隨后在分子水平進行表達分析或蛋白質水平的分析，挑選出了一種具有顯著抗逆特性的基因一小立碗蘚抗逆基因尸pWo7a;ray7t力j'/jofe-epon'fikse，其堿基序列如SEQIDNo.1所示，其cDNA序列如SEQIDNo.2。進一步，本發明還提供了上述基因編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQIDNo.3所示。在本發明的完成過程中，還提供了包含上述基因的載體、以及表達該基因的轉基因細胞系。本發明獲得的基因具有高效的抗逆性。通過常用的基因工程技術，可以利用該基因培育出優質的轉基因農作物，從而提高農作物的抗逆性。圖1為/^w'o^3;ra/7Z^z'/ofe-eparz'okse基因的cDNA-AFLP圖譜，其中，Maker:分子量標記；1、未馴化的24小時的材料；2、未馴化的12小時的材料；3、冷馴化的24小時的材料；4、冷馴化的12小時的材料。圖2為尸p7io7a;ra/7t/i/7ofe-epo義iokse基因的Real-timeRT-PCR相對表達量變化圖。具體實施例方式1、小立碗蘚的培養及冷脅迫處理將小立碗蘚培養至15葉左右，移入0。C處理0、3、6、12、24、48、72小時，分別取材用于cDNA-AFLP分析。附小立碗蘚培養基配方及制備大量元素Ca(N0丄4H200.8g/L0.0125g/L0.25g/LFeS047H20MgS047H20微量元素CuS045H20ZnS047H20H3B030.055mg/L0.055mg/L0.614mg/L0.389mg/L0.055mg/L0.028mg/L0.025mg/LMnCl2■CoCl26H20Na2Mo042H20Glucose酒石酸銨磷酸鹽緩沖液5g/L0.5g/Llml/L微量元素配制成1000X母液，4'C存放。固體基本培養基，加入濃度為0.8%瓊脂粉。磷酸緩沖液的配制取25gKH2P(V溶解于100ml蒸餾水，用4MK0H調整pH7.0，4'C存放。2、cDNA-AFLP分析cDNA-AFLP方法參照Christian,1998。1)小立碗蘚RNA提取(TE3D法)和DNaseI處理2)mRNA的分離mRNA從總RNA中分離，按照Promega公司試劑盒PolyATractraRNAIsolationsystem介紹的方法進《亍。3)cDNA的合成cDNA按照TaKaRa公司試劑盒cDNASynthesisKit(M-MLVVersion)介紹的方法進行。4)雙酶切采用EcoRI和Msel兩種限制性內切酶對cDNA進行雙酶切。模板cDNA(200ng/u1)1.25u1緩沖液(10X)2ulEcoRI5U/u11U1Msel5U/ullulddH2014.75u1總體積20ul混勻離心，37°C酶切至少3個小時，最好過夜直至cDNA被完全酶切；酶切完全后，反應混合物置65'C加熱15min，使限制性內切酶失火，之后將反應管置冰上冷卻；1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，呈現均勻彌散為較好酶切效果。5)接頭連接采用EcoRIadaptor和Mselad鄰tor兩種接頭連接，所用接頭見表2.1。酶切反應液緩沖液(10X)T4-連接酶(10U/u1)ATP(10mM)EcoRI接頭Msel接頭ddH20總體積50pmo1/ii150pmol/ii120y12u10.lu10.2"lu1lii15.7u130u1混合離心，37。C至少連接3小時，-20。C可長期保存。6)預擴增以E0和M0為引物做預擴增，所用引物見表2.1。加入以下試劑于反應管中模板DNA(連接反應液)緩沖液(10X)MgC12(25mM)EcoRI引物(E0，50ng/u1)Msel引物(M0，50ng/ul)Taq酶(5U/u1)dNTP(10mM)H20總體積PCR反應程序94'C、3min;94°C-環；68°C、10min;4'C保存。2.0u12.On11.2u10.6u10.6u10.2u10.2u113.2u120ti130s，56°C、30s，72°C、lmin，15個循<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>7)選擇性擴增以El、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8禾BMl、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8為引物做選擇性擴增，所用引物見表2.1。加入以下試劑于反應管中模板DNA(預擴稀釋物)5.0ul緩沖液(10X)2.0nlMgCl2(25mM)1.2uldNTP(10mM)0.2iilEcoRI引物(Ex，50pmol/nl)0.6ulMsel引物(Mx，50pmol/u1)0.6ulTaq酶(5U/iU)0.2ix1H2010.2u1總體積20nlPCR反應采用"touchdown"策略。程序如下94。Clmin94。C65°C72°C94°C30s30slmin30s7個循環(每個循環降低0.7°C)20個循環56°C30s72°Clmin68。ClOmin4°C保存8)電泳檢測——銀染技術記錄試驗結果拍照或掃描，統計檢測位點數及其多態性位點。以冷馴化3h，6h，12h，24h，48h，72h和未馴化0h的小立碗蘚為材料，進行cDNA-AFLP分析。統計200bp-1000bp之間的可讀帶，結果表明小立碗蘚冷馴化和未冷馴化的基因表達存在著明顯差異。有些cDNA片段在冷馴化后表達量逐漸增加，有些cDNA片段表現出先增加后降低，有些cDNA片段表達量先降低后增加，還有少數表達量明顯降低。3、尸;w'o7ara/7t/w'/7ofe—epo義i(/ase全長基因的獲得1)RT-PCR分析將由cDNA-AFLP分析得到的差異片段與P.patensEST數據庫(http:〃moss.nibb.ac.jp/blast/blast.html)進行BLAST比對后，進行聚類分析和功能分類，顯示小立碗蘚在冷馴化過程中細胞內的代謝活性和生長狀態發生了極大的變化。特別值得一提的是，發現了與膜穩定性相關的轉錄本，尸pC^Pi7J編碼/^w'o73X3/7"i/7c/e-印awVase。該基因的表達分析顯示尸payi7J在冷馴化中下調表達，Ppviolaxanthinde-印oxidase是木質素循環中的關鍵酶，催化紫黃質轉變為玉米黃質。violaxanthinde-印oxidase的活性依賴于脂肪酸的不飽和程度，并且受細胞膜流動性的調節(Latowskietal.，2002;Bugosetal.，1998)。通過同源序列設計引物，通過RT-PCR反應擴增得到尸/w'o7a;ra/7t力//7ofe-epo;n'okse。尸pfa'o7ar朋t力i/A-epo;nWase基因的上游引物序列為CTATTACCGAGGCAAGAATG;下游引物序列為CGTGTGTTGTCAGTTGTGGT。PCR反應體系如下cDNA3u110XLAPCR緩沖液2ix1d證(2.5mM)1.6ulprimerF(50pmo1/ti1)primerF(50pmo1/n1)LAPolymeraseddH20總體積PCR反應程序0.15u10.15u10.lix113u120u195°Clmin95°C45s65°C45s68°C2min32個循環72°ClOmin4°C保存2)純化后的差異片段與pGEM-Teasy(Promega)載體連接3)連接產物的轉化5)陽性克隆的測序以載體兩端的T7或SP6引物進行序列測定。測序儀為ABI3100(A卯liedBiosystems)<>該基因的基因組序列如下CTAAACCTGCGCACCTCGTGATCCTGGATGGTAGAGGGAATGGGGGGGGGGGGGGGCCTTGTGGATGACGACTCAAAAGCACTGGAGCTCGCAGTGCCTCCATTTGTGGAGTGAGTTAGAGCGAAAGAGAGCTTGCAGGGTCTGTTATCTTGTTCCGAATCTAGTTTGGGTTTTGGAGCGTTTGTAATTTTTAGGCTTGCGTTGAGCTGC11GTTGATTGGTTGCGTAGGGTGGAATTAGCGAAATGCATTGCAGACCCGAAGTGTGCAGCTAATGTAGCATGTTTACAAACCTGTAATGGACGACCTGACGAGACCGAGTGTCAGGTCTGGCAATTCACCAGCTTTCTCTTGTTGTTGCTCAGTGTTGCGCAAATTGATTATTGTTCCTGGTGGTTCTGTTCTGTGAAGTCTGATCATTTTGGAGATTTTGTGGGAGTTTATGAGAATGATGCGCATGTTTAGTCTCAACTTGCGTAAGGATAAAAGATAAAGTGCAGGAAAGTTTTGAACAAAGATTACATCTTACACGTAGGCACACTTGGCTATATCTCTGGAAATCTGACGGTGAAMTGTCTTGCAGATTGGTTGTGGTGATTTATTCGAGAACAAAGTTGTCGATGAATTCAACGAATGTGCTGTAACAAGAAAAGGCTGCGTCCCTCAGAAGGCTGATGAAGGTCGCTTCCCGGTGCCCGCTCCGTGCTTTCATTGTCACTGAAGTGCCAACATCCTAGTGAGATGGCAGTAAAAGCTCCAGCATTGGCTGCAGCAGTGAATTGTTGACAAGCTTAGCTTTGGAAAACTTGCAGGCGGAGGAAGGAGAGAAATTCCTGGAGAAGGAGGTGGTGGAAGGGGAGAAGTTTGTGGAGAAAGAAGTGGAGGAAGGAGAGAGCTTCTTTGTAAAGGAGGCACAAGAGGTGGAGCAAGGTGGCGAGAAGATTATCCAGAAGCTGGGACGACTGTGGGCTCAGCTGACCAAAGGCGCTGAAGAGGTGCGGCGTGACGAGGAGCAGCTCCTCAAGGAGCTTGGAGAGTTCGGAAAGAGTGCTCAAATGAACGAGGAGGAGTTCATGCAATCTTTGGGAGATGAAGAGAAG磁TTGCTTGAAGACTTGGGGAATCAGATTTTGGCTCGTCAGAAAAAGCCCAGCAGCTTGTGAATTCACGTTAAAAAGAGAGGTTTTCTTCATGTTGAATTTGTACTTTCCTTAACTGCATAGAGATGACATCTATTCAATATCTTCDSSequence(1596bp)CAGCTGTTGCAACGGGGTTTTTGCTATGGGGTGGATCAAGCGCGTTGGCTGCTGACCCTCTAAAAACATGCTCATGTCTTCTTAAGGAATGCCGGGTGGAATTAGCGAAATGCATTGCAGACCCGAAGTGTGCAGCTAATGTAGCATGTTTACAAACCTGTAATGGACGACCTGACGAGACCGAGTGTCAGATTGGTTGTGGTGATTTATTCGTTCTACTGTGCAGAACTTCGTACAAGACGAAAAGCAACCAGGAATCTTATTAAACCACGGAAACGAGTTCACCACAACTGACAACACATGTGGACCGGAACCGCCATTGCTTGCCAGACTGGAAAAGAAGGCGGAGGAAGGAGAGAAATTCCTGGAGAAGGAGGTGGTGGAAGGGGAGAAGTTTGTGGAGAAAGAAGTGGAGGAAGGTTTTGGGAAGGAAGGTC氨基酸序列MAVVHALLSLPHPAAGNPLQLSVQSNSRNTSASAGRLSSLSSRPCLGGLVSRSSKTKWISTRGGCRRACVVNMRLSKSQCKEQGQTECSNGEIASTSAIVAREASSVQSPRWRLQILPRNVAQGFALQAAAAVATGFLLWGGSSALAADPLKTCSCLLKECRVELAKCIADPKCAANVACLQTCNGRPDETECQIGCGDLFENKVVDEFNECAVTRKGCVPQKADEGRFPVPAPSSLVQDFDTTRFTGTWYITSGLNKTFDTFDCQK冊FTAEPAKLSGNLSWRIATPDGGFFTRSTVQNFVQDEKQPGILLNHGNEFLHYQDDWYILASRIEMPDDYVFIYYRGKNDAWDGYGGAVVYTKSSTLPTSIIPELGAAAKKVNLDFKKFTTTDNTCGPEPPLLARLEKKAEEGEKFLEKEVVEGEKFVEKEVEEGESFFVKEAQEVEQGGEKIIQKLGRLWAQLTKGAEEVRRDEEQLLKELGEFGKSAQMNEEEFMQSLGDEEKKLLEDLGMQPSDVGKLFGNSVPLRKLR4、/^'o7a扁t力//7cfe-印組't/維基因的Real-timeRT-PCR分析利用real-timeRT-PCR方法研究了尸/Kiaax3"Z^z'/7c/e-epo;a'okse基因在冷馴化過程中的表達變化。1)RNA提取和反轉錄利用RNA反轉錄試劑盒進行RNA反轉錄。試劑盒使用TaKaRa公司的RNAPCRkit，參照試劑盒的說明書，以試劑盒提供的反應體系進行反轉錄反應。2)預實驗反轉錄產物稀釋10倍用以做模板，用目的基因的引物，使用h'SExTaqDNApolymerase,進行PCR反應。PCR反應條件如下94°C2min94°C30s61。C30s72°C20s30個循環20°C5minPCR反應產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。選擇反應產物專一，沒有二聚體等雜帶的樣品進行下一步定量PCR反應。3)定量PCR反應利用TaKaRa公司的SYBRPremixExTaq(PerfectRealTime)kit進行熒光定量PCR反應，引物序列見表2.2。PCR儀使用CorbetResearch公司的RotorGene3000Real-TimeThermalCycler。實驗結果利用軟件Rotor-Gene6.O(Donaldetal.，2005)以及Excel7.0進行數據分析處理。采用Pp-actin3基因作對照，尸/7i^'o7aM/7^7y/7ofe-epow'ofese基因的上游引物序列為CTATTACCGAGGCAAGAATG;下游引物序列為CGTGTGTTGTCAGTTGTGGT。4)標準曲線的生成將預試驗的PCR產物按照10倍濃度梯度進行稀釋，選擇1/1,000，1/10，000，1/100,000，1/1,000，000濃度的稀釋產物作為標準品模版，進行熒光定量PCR反應。通過這四個標準品生成的反應數據，軟件Rotor-Gene5.0根據反應的熒光實時監控數據和標準品的濃度關系，生成標準曲線(參見圖2，轉錄本7)。實驗結果證明基因PpKioh;ra/^力//7印ouWase在冷馴化中下調表達，其是木質素循環中的關鍵酶，催化紫黃質轉變為玉米黃質。violaxanthinde-印oxidase的活性依賴于脂肪酸的不飽和程度，并且受細胞膜流動性的調節(Latowskietal.,2002;Bugosetal.，1998)，表明膜的穩定性機制可能是小立碗蘚冷馴化機制中的一項重要策略，低溫誘導表達特性說明了尸pw》7a;ra"t力眾A-e/^aVaw基因與小立碗蘚的低溫抗性密切相關。序列表，txt<110〉首都師范大學<120>小立碗蘚抗低溫脅迫基因Ppviolaxanthinde-印oxidase及其編碼的蛋白質、含有該基因的載體、和細胞系<160>3<210>1<211〉4464〈212〉瞧〈213〉小立碗蘚(PhyscomytrellaPateuts)<400>1ctaaacctgcgtgg3tg3Cggcg3卿agaggcattggcaggttctttgtcttgacttgatgttccgaat卿ggcggatctgctggtaatttttttmtgaagcgttgcttggttgttggcgtC3gcttaggtcttcaaaatatgcgagg犯3ttgcggtgg柳ctttttgattttgagcttcgaaaaaataggcattgCCELgCttCactttggttgcgtttctacttgcaagctgcctgctgaccctctgcagtaataggatggaacgatgcgtgagttgattggt犯tgtagcatcaattcaccatggttctgUtacctgtcgttgagaatgatagttttgaacgacggtgaaagaattcaacgcgcttcccggggg訓tggtcatgagttcatttactggcttctggtatttctgattgaagaattgtgctgtccagatggaaccaggaatcactgctgtcc3gtactggaggtcgtacacacttggagg肪atatcactccgagctgcatggsgtcttg幼g犯CELElgCCgatatggaggagctgggggcacacatgtggaaccagttgcaagctccagcagcggagg犯ga犯g肌gtggggcg鄉agagcacctcgtgactcaaaagcUggC3ttggtgctgaggcgtgctgctatactagtttgggttagttagtcatttattcaattttuuuatcctggeitgactggagctcagctgaatccctcaatgcggcgggctttcgccctctctagttttggagcgatggctgtggtcctggtgtggtagaggg犯gcagtgcctcagt3gagttttggggggggggcaggaaatcggacgcctgtaaaeict犯atttatcgaagttctacttcagcaaattcttcaggttttgaattggatgttcttttcttcattcaagtgattggcactcgagcctacttgatggcagctgtttctaaaaacaccttcagattaatatttgctatatgtgtcatgcgtagggtgtttacaaacgctttctcttctgtgaagtctagtaacagagCgCEltgttt犯agattacaatgtcttgcaaatgtgctgttgcccgctccacatcaccagcagcagagccctgaagctaageitcagttttttggggtcttaactagctttggcttcttcattattaaaccttgttttaccattgctttatctgattaaggatttcctttt2igtcaatg膽gat犯taccgtttgtacacagatgactatggcagtcgtttgcagcg卿acaaatg犯cggacttggggagtgctttcatttggctgcaggagagaaattttatccagaagtgacgaggaaggaggagtttgcaaccatcctttgcagctcgtctttatcggatttcgsiccgcagtgt幼Ct3tCgtggCctagaaacgtgg犯Wtattgcatcagtttaattcagcaggctaatgttctggatgcgcgatgtgacgtgcaacggggttgctcatgtcattggaaatacagcgccaattggaatcttggg犯ttagcgctgtaatggagttgttgctctgatcatttttg肪ccgttaagtctcaacttcttacacgtgattggttgtaac肪g犯肪atccagcttatggtttgaaccgca肪attagaacagttgtcga/ttc犯tgtaattgtgaacfitaatgtgtctcgttctacacgga^cgattt3ggcttatcctgagggatgaggtctttcacaatttcgagagttgtctgaggttgatctcgcaacctctgtttatctaacaccaagagcattgcttgctgtcactgaacagtgaattgcctgg卿aggagcttctttgctgggacgagcagctcctccatgcaatcttgacgttggactcttgtagaccaccacaceitttgtaattttacatgctttgtttttgagtttgtgtattgatctgtacagcagtaggcctt卿ggcggt卿gc犯ggaaagagaagcttgcgcaggtgggtggatagcgatagccagatccattgaaattgtcaatgtattttttgttacctacaatcttttgctatgttctt犯ggacttgcatctat￡lgtggg￡lUgttgaggtta3犯tgC3ttgcgacctgacgagtgttgcgctgttgtgtg3ttattttsgatgcgtaaggaaggcacacttggtgatttatggctgcgtccgtgcaagactaaaacttttgtC3ggtgtgt3cagt8cgag3cc肪gaggtctttgtccgatgC3gga犯ttgtgcagaacgttcctccacagatccctatgaaattgtaatgcattgaggtgatgtagttts犯tcagaaacctacct犯tttcaggtacttaccgaggcctcaacactgggatttcaagcagactggaagtgccaacatttgax;aagcttagctattgctggtttttgtatgaggaggattctcgattcUaggcttgcactgtctctgtttggattgttagtgccggg3gggtttttgagtaattc朋tgcttaggagtgcag犯gggcaaaccgagtagtagcgttcgta犯ggaggctgtgggctc卿gagcttgttgggagatg肌gctatttgtttatatttaggUUggttgccac犯cagcgatttgcgaUUgtgtttttgtacgcaggggtggatcaatgccggtacgaaattgtttttacgcaggctttttgcagccagacccg犯卿ccgagtgaaattgattatttaatgttgggagattttgtaaaagat幼ggctatatcttcgagaacaactcagaaggcttgacact3cacactttcgaggtg犯ttgaaactcagcatggtagttUtttccggttcactgagctggcttcgtacaagtatcaggatgttcttaccatcaggctcactttgtctgatggtggctccagtatcatctgatgcaaatggaattctcgcataag犯tgacgccaaccagtaaagttc3cc3aagaaggt犯cctagtgagatagctttggaaagggg卿acacaagaggtagctgaccaagagagUcgg犯gagaagaagaaactccgtggggggccttgtgagttagaagtgtggattggtattgcgtagaggaggagtctgttatctgttgagctgcccgcatcctgtgagttttttattttgagggaggatctagtgg幼tscgtcgcttggtatccttgtgtagtgtsgt犯tgg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