專利名稱：：截短的人乳頭瘤病毒6型l1蛋白的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種截短的人乳頭瘤病毒6型Ll蛋白，及由其組成的類病毒顆粒，含該類病毒顆粒的疫苗及其在預防尖銳濕疣或HPV(特別是HPV6)感染中的用途。
背景技術：
：人乳頭瘤病毒HPV(HumanPapi1lomavirus)屬乳頭多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳頭瘤病毒屬，為無包膜DNA病毒。病毒基因組為雙鏈閉環DNA，大小約為7.2~8kb，具有8個開放框。基因組按功能的不同可以分為三個區域①早期區(E)，約4.5kb，編碼El、E2、E4-E76個與病毒復制，轉錄及轉化有關的非結構蛋白；②晚期區(L)，約2.5kb，編碼主要衣殼蛋白Ll和次要衣殼蛋白L2;③長調控區(LCR)，位于L區末端與E區起始端之間，長約800900bp，不編碼任何蛋白，含DNA復制、表達調控元件。病毒顆粒直徑為45~55nm,核衣殼呈20面體對稱，有72個殼微粒，由L1及L2組成。目前已知的HPV約有90多種亞型，在人群中主要引起皮膚，粘膜的疣狀病變。根據其與腫瘤發生的關系又可分為3組①低或無致癌風險組，包括HPV6、11、39、41、42、43;②中度致癌風險組，包括HPV31、33、35、51、52;③高度癌風險組,包括HPV16、18、45、56。根據流行病學調查肛生殖器粘膜的HPV例如HPV6，11的感染僅次于衣原體和滴蟲病而居于第三位，是一種常見的性傳播疾病。而其中由HPV6，11引起的病變占了總數的90%左右。在美國，女性生殖道HPV感染的高峰在15-25歲，并與感染者的性行為關系密切。在我國，女性HPV的感染率的高峰期在20-29歲之間，感染率為1606.1/10萬。35歲以上的婦女HPV感染率逐漸降低。但是由于HPV感染大多是亞臨床感染，感染率難以準確估計，但美國CDC的估計一生中累計HPV感染風險大約10%。此外由于采集大樣本男性標本困難，且男性感染HPV造成后果沒有女性嚴重，所以關于男性感染的資料較少。不過據估計，男性的感染率應當接近女性。而在美國，可見的尖銳濕疣見于1%的性活動期成年男性。因此，開發安全有效的HPV6，11疫苗是預防性傳播疾病有效的有效手段。HPVLl蛋白為主要衣殼蛋白，分子量為55~60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多種表達系統中表達的HPVL1蛋白無需L2蛋白輔助即可形成在形態結構與天然病毒顆粒相似的類病毒顆粒(Virus-LikeParticle,VLP)。該種類病毒顆粒為二十面體立體對稱結構，由72個L1蛋白的五聚體組成。其保留了病毒顆粒的天然表位，具有較強的免疫原性，可誘導針對同型HPV病毒的中和抗體。(Kirnbauer，R.，F.Booy，a/.1992ProcNatlAcadSciUSA89(24):12180-4.)并且，類病毒顆粒并不帶有病毒核酸，無潛在致癌危險，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成為HPV疫苗發展的主要方向。HPVVLP疫苗研制的關鍵是能夠大量高效制備VLP樣品。目前較為常用的表達系統可以分為真核表達系統及原核表達系統。常用的真核表達系統有痘病毒表達系統、昆蟲桿狀病毒表達系統、酵母表達系統。在真核表達系統中所表達的HPVLl蛋白天然構象破壞少，能自發的形成VLP，往往只需進行簡單的密度梯度離心即可得到純化的VLP，為純化工作提供極大的便利。但是由于真核表達系統的表達量低，培養成本高，給大規模工業化生產帶來了極大困難。目前已上市HPV疫苗Gardasil采用了釀酒酵母表達系統，其表達量低，生產成本高，因此該產品價位偏高，影響其廣泛應用。原核表達系統中利用大腸桿菌表達系統表達HPVL1蛋白已有報道。例如有報道利用大腸桿菌表達HPV16Ll蛋白(Banks,L.，G.Matlashewski，efa/.(1987).JGenVirol68(Pt12):3081-9)。但是由于大腸桿菌所表達的HPVLl蛋白大多失去其天然構象，不能產生針對HPV的保護抗體。或者上述蛋白雖然通過包含體純化，復性等步驟也可得到HPVVLP(Kelsall，S.R.andJ.K.Kulski(1995).JVirolMethods53(1):75-90)，但是在復性過程中蛋白損失量大，得率低，難以在大規模生產上應用。HPVLl蛋白雖然也可以在大腸桿菌中以正確構象可溶性地表達，溶解于菌體的裂解上清中，但是表達量較低，而且上清中雜蛋白種類多且量大，要從中純化出目的蛋白難度相當大。雖然也有文獻報道通過GST融合表達的方式可以增加上清中Ll蛋白的表達量，而且有助目的蛋白的純化(Li，M.，T.P.Cripe，etal.(1997).JVirol71(4):2988-95.),但融和蛋白的切割往往需要價格昂貴的酶，依然無法應用于大規模生產。因此，本領域仍然需要具有低成本，能夠誘導產生針對HPV保護性抗體的HPVL1蛋白及由其組成的類病毒顆粒，從而使大規模工業化生產尖銳濕疣疫苗成為可能。
發明內容本發明的目的是提供一種新的HPV6Ll蛋白，及由其組成的類病毒顆粒及含該類病毒顆粒的疫苗。本發明人經研究出人意料地發現，在大腸桿菌表達系統能得到可以誘導針對HPV6的中和抗體的截短HPV6L1蛋白，該截短的HPV6L1蛋白經純化后得到高產率，純度至少50%的HPVL1蛋白。純化后的HPVL1蛋白經進一步處理得到可誘導針對HPV6保護性抗體的類病毒顆粒，本發明基于以上發明現已完成。因此，本發明第一方面涉及一種(與野生型HPV6LI蛋白相比)N端截短了2個、3個、4個、或5個氨基酸的HPV6L1蛋白。優選該截短蛋白具有序列1、2、3、或4，優選序列1。本發明再一方面涉及編碼本發明截短蛋白的多核苷酸以及含有該多核苷酸的栽體。本發明再一方面涉及包含上述載體的細胞。本發明還涉及包含上述截短蛋白或多核苷酸或載體或細胞的組合物o本發明再一方面涉及一種HPV6類病毒顆粒，其中該類病毒顆粒包舍N端截短了2個、3個、4個、或5個氨基酸的HPV6Ll蛋白例如具有序列1、2、3、或4的HPV6Ll蛋白，或者由N端截短了2個、3個、4個、或5個氨基酸的HPV6Ll蛋白例如具有序列1、2、3、或4的HPV6Ll蛋白組成或形成。本發明再一方面涉及一種獲得HPV6Ll蛋白的方法，其包括在大腸桿菌表達系統中表達截短的HPV6Ll基因片段，然后將含有該截短蛋白的裂解上清進行純化處理。在一個優選實施方案中，獲得HPV6Ll蛋白的方法包括a)在大腸桿菌表達系統中表達截短的HPV6Ll基因片段，b)將表達了截短HPV6Ll蛋白的大腸桿菌在鹽濃度100mM-600mM中破碎，分離得到上清液，c)用水或低鹽溶液將b)上清液中鹽濃度降至100mM或以下，最低至O，收集沉淀，d)將c)中沉淀在150mM-2500mM鹽溶液中重新溶解，同時加入還原劑，分離得到溶液，其中含純度至少50。/。的截短HPV6Ll蛋白。更一般性地，本發明還涉及一種獲得HPVL1蛋白例如本發明HPV6Ll蛋白的方法，其包括a)在大腸桿菌表達系統中表達編碼HPVL1蛋白的HPVLl基因，b)將表達了HPVLl蛋白的大腸桿菌在鹽濃度100mM-600mM中破碎，分離得到上清液，c)用水或低鹽溶液將b)上清液中鹽濃度降至100mM或以下，最低至Q，收集沉淀，d)將c)中沉淀在150mM-2500mM鹽溶液中重新溶解，同時加入還原劑，分離得到溶液，其中含純度至少50%的HPVLl蛋白。本發明還涉及一種預防尖銳濕疣或HPV感染的疫苗，其包含本發明的HPV6Ll蛋白類病毒顆粒。優選該疫苗還包含至少一種選自HPV18L1蛋白類病毒顆粒，HPV11L1蛋白類病毒顆粒，HPV16L1蛋白類病毒顆粒，HPV31L1蛋白類病毒顆粒，HPV33L1蛋白類病毒顆粒，HPV45L1蛋白類病毒顆粒，HPV52L1蛋白類病毒顆粒，HPV58L1蛋白類病毒顆粒的類病毒顆粒。該疫苗通常還包含疫苗用賦形劑或栽體。優選地，所述疫苗含有HPV6類病毒顆粒和HPV11類病毒顆粒，特別是，含有具有SEQIDN0:4所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV6類病毒顆粒，和含有具有SEQIDNO:7所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV11類病毒顆粒。更優選所述疫苗還含有HPV16類病毒顆粒和HPV18類病毒顆粒，特別是含有具有SEQIDNO:8所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV16類病毒顆粒，和含有具有SBQIDN0:9所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV18類病毒顆粒。在一個特別優選的實施方案中，所述疫苗包含含有具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV6類病毒顆粒，含有具有SEQIDN0:7所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV11類病毒顆粒，含有具有SEQIDN0:8所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV16類病毒顆粒，和含有具有SEQIDNO:9所示氨基酸序列的蛋白質或者由該蛋白質形成的HPV18類病毒顆粒。本發明進一步涉及本發明HPV6LI蛋白或其類病毒顆粒在制備用于預防尖銳濕疣或HPV感染疫苗中的用途。本發明還涉及一種預防尖銳濕疣或HPV感染的方法，其包括將含預防有效量的本發明HPV6Ll蛋白疫苗給予需預防尖銳濕疣或HPV感染的人或動物。本發明還涉及一種獲得HPV6LI蛋白類病毒顆粒的方法，其包括e)將純度至少50%的截短HPV6LI蛋白進一步通過色譜層析純化，f)將e)步驟中得到的HPV6Ll蛋白去除還原劑。本發明還涉及一種制備用于預防尖銳濕疣或HPV感染疫苗的方法，其包括將上述類病毒顆粒與任選的一種或多種選自HPVll，16，18，31，33，45，52，和58的HPV型別的類病毒顆粒及疫苗用載體或者賦形劑混合。本發明中相關術語的說明及解釋根據本發明，術語"大腸桿菌表達系統"是指由大腸桿菌(菌林)與載體組成，其中大腸桿菌(菌林)來源于市場上可得到的，在此舉例但不限于:GI698，ER2566，BL21(DE3),B834(DE3)，BLR(DE3)。根據本發明，術語"載體"一詞指的是，可將某編碼蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達的一種核酸運栽工具。栽體可以通過轉化，轉導或者轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞中獲得表達。舉例來說，載體包括質粒；噬菌體；柯斯質粒等等。根據本發明，術語"截短的HPV6Ll蛋白基因片段"是指在野生型HPV6L1蛋白基因(cDNA)的5，端或3'端去掉編碼一個或者多個氨基酸的核苷酸，其中野生型HPV6Ll蛋白基因全長序列舉例但不限于NCBI數據庫中如下序列AF067042.1，AF092932.1，L41216.1，X00203.1等。"截短的HPV6Ll蛋白"是指在野生型HPV6L1蛋白的N端和/或C端去掉一個或者多個氨基酸后的蛋白質，其中野生型HPV6Ll蛋白的例子有但不限于NCBI數據庫中AF067042.1,AF092932.1，L41216.1，X00203.1等所編碼的全長L1蛋白。根據本發明，術語"疫苗用賦形劑或載體"是指選自一種或多種，包括但不限于pH調節劑，表面活性劑，佐劑，離子強度增強劑。例如，pH調節劑舉例但不限于磷酸鹽緩沖液，表面活性劑包括陽離子，陰離子或者非離子型表面活性劑。舉例但不限于Tween-80。佐劑舉例但不限于氫氧化鋁，氟氏完全佐劑。離子強度增強劑舉例但不限于氯化鈉。根據本發明，術語"色譜層析"包括但不限于離子交換色譜(例如陽離子交換色譜)、疏水相互作用色譜、吸附層析法(例如羥基磷灰石色鐠)、凝膠過濾(凝膠排阻)層析、親和層析法。根據本發明，本發明的截短HPV6L1蛋白優選如下獲得將表達有截短HPV6L1蛋白的大腸桿菌在鹽濃度為100-6001^，優選200-500mM的緩沖液中進行破碎，分離破碎溶液，得到上清液，用水或低濃度鹽(通常低于破碎用的鹽濃度)降低所得上清液中鹽濃度至鹽濃度lOOmM-0M，分離鹽濃度低至lOOMm-0的上清液中的沉淀；將沉淀在含還原劑及鹽濃度150-2000mM優選200mM以上的溶液中重新溶解，分離，得到純度至少為50%,優選至少70%,更優選至少80%的截短HPV6L1蛋白溶液。根據本發明，在本發明獲得的截短HPV6L1蛋白的方法中，緩沖液是指可在一定范圍內維持pH值穩定的溶液，包括但不限于，Tris緩沖液，磷酸鹽緩沖液，HEPES緩沖液，MOPS緩沖液等等。根據本發明，所述原核宿主細胞破碎包括但不限于通過勻漿器破碎、均質機破碎、超聲波處理、研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理中的一項或者多項方法來實現；根據本發明，在本發明獲得的截短HPV6L1蛋白的方法中，所用的鹽包括但不限于是中性鹽，特別是堿金屬鹽、銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽，硫酸鹽，碳酸氫鹽，磷酸鹽或磷酸氫鹽，特別是NaCl、KC1、NH4C1、(NH4)2S04中的一種或幾種。優選NaCl。所用的還原劑包括但不限于DTT，2-巰基乙醇。所用量包括但不限于lOmM-lOOmM。根據本發明，本發明的截短HPV6L1蛋白類病毒顆粒如下獲得將上述純度至少50%的截短HPVL1蛋白溶液通過例如色譜層析進一步分離，得到純化的截短HPV6L1蛋白溶液。去除純化的截短HPV6L1蛋白溶液中的還原劑，得到截短HPV6L1的類病毒顆粒。去除還原劑的方式包括但不限于本領域已知技術，例如，透析，超濾或者層析等。根據本發明，本發明的截短HPVL1蛋白優選具有序列1。根據本發明，本發明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，優選注射。根據本發明，本發明疫苗優選單位劑型使用，其中單位劑型中截短HPV6L1蛋白類病毒顆粒的量為5Pg-80M<g，優選2(mg-4(mg。有益效果目前HPV類病毒顆粒的制備所采用的表達系統可以分為真核表達系統和原核表達系統。在真核表達系統中所表達的HPVL1蛋白天然構象破壞少，能自發的形成VLP,往往只需進行簡單的純化過程即可獲得具有正確構象的VLP。但目前真核表達系統所采用的桿狀病毒表達系統及酵母表達系統均有表達量低，培養成本高等缺陷，給大規模工業化生產帶來了極大困難。在原核表達系統中，大腸桿菌表達系統具有培養成本低，表達量大的優點。但在大腸桿菌表達系統中表達的HPVL1蛋白往往失去正確天然構象，以包含體形式表達于沉淀中。目前對表達于包含體中蛋白進行復性依然是一個世界性難題。復性困難，效率低下，使得從包含體中獲得有正確構象的VLP在大規模生產中難以實施，只能局限于小規模的實驗室研究中。雖然HPVLl也可以正確構象可溶性形式表達于大腸桿菌裂解上清中，但是表達量低下，而且要從大腸桿菌裂解上清中種類繁多的可溶性蛋白純化出HPVL1蛋白也相當困難，往往需要借助融合表達及親和層析等手段進行純化，以上手段往往需要昂貴的酶，難以進4亍工業化生產。本發明在大腸桿菌表達系統中表達N端截短HPV6Ll蛋白，并且采用溫和的手段選擇性沉淀表達在大腸桿菌裂解上清中的HPV6Ll蛋白，進一步采用含鹽緩沖液重溶HPV6Ll蛋白，使得在保持HPV6Ll蛋白正確構象前提下使其純度有了顯著提高且重溶后的目的蛋白可以直接進行離子交換層析及疏水交換層析純化獲得純蛋白。通過以上步驟獲得純化后的截短HPV6Ll截短蛋白可以組裝為類病毒顆粒，具有良好的免疫原性，可以誘導高滴度的針對HPV6的中和抗體，預防HPV6對人體的感染，是一種良好的疫苗形式。此外，本發明中采用的截短HPV6Ll蛋白在保留全長HPV6Ll蛋白的抗原性及顆粒組裝能力的同時，易于在大腸桿菌表達系統中表達，所采用的純化方法無需使用昂貴的酶，成本低廉。而且目的蛋白在純化過程中構象沒有經過劇烈的變性復性過程，損失小，可應用于大規模工業化生產。在參考下列詳述和附圖后，本發明的這些和其它方面將是顯然的。此處公開的所有參考文獻在此均完整引用作為參考。圖l顯示了在本發明方法步驟a)-d)中HPV6N3C-L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。l，裂解上清；2，經過切向流沉淀的HPV6N3C-L1;3，經重懸液重懸的HPV6N3C-Ll。結果顯示，HPV6N3C-L1蛋白在通過沉淀，復溶的步驟之后，純度達到了約70%左右。圖2顯示了步驟d)中所得的HPV6N3C-Ll進一步經本發明步驟e)純化后的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。1，經本發明步驟e)純化所得HPV6N3C-L1上樣10ul;2，經本發明步驟e)純化所得HPV6N3C-L1上樣20n1。結果顯示，經過步驟e)純化的HPV6N3C-L1蛋白純度達到了98%左右。圖3顯示了步驟f)中所得的HPV6N3C-L1類病毒顆粒透射電鏡觀察(50,000倍)結果。視野中可見大量半徑為"nm左右的類病毒顆粒，顆粒大小與理論大小相符，均勻一致。圖4顯示了步驟f)中所得的HPy6N3C-Ll類病毒顆粒的動態光散射觀測結果。結果顯示，HPV6N3C-Ll類病毒顆粒的水化分子動力學半徑為24.70nm，顆粒組裝百分比為100%。圖5顯示了HPV6N3C-L1類病毒顆粒接種羊后不同階段血清中和抗體滴度。圖中箭頭所示為免疫時間。在初免一周后，中和抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，中和抗體的滴度即能達到io7-108的較高水平。圖6顯示了HPV6N3C-L1類病毒顆粒接種兔后不同階段血清中和抗體滴度。圖中箭頭所示為免疫時間。在初免一周后，中和抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，中和抗體的滴度即能達到106的較高水平。圖7顯示了實施例5中HPV6/11二價疫苗接種小鼠后不同時間的血清中HPV6，HPV11中和抗體滴度變化情況。免疫程序為0，2W(周)。第一次免疫后，HPV6，HPV11中和抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，抗體的滴度即能達到1x104-1x105。圖8顯示了實施例5中HPV6/11/16/18四價疫苗接種小鼠后不同時間的血清中HPV6，HPV11，HPV16,HPV18中和抗體滴度變化情況。免疫程序為0，2W(周)。第一次免疫后，HPV6，HPV11,HPV16，HPV18中和抗體滴度即有明顯上升，在經過一次加強免疫后，抗體的滴度即能達到1x105-1x106。圖9顯示了在本發明方法步驟a)-e)中N端分別截短了2個、4個、或5個氨基酸的HPV6Ll蛋白HPV6N2C-L1、HPV6N4C-L1、HPV6N5C-L1(其氨基酸序列分別見SEQIDNO:2、3、4)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。1，分子量Marker;2，經本發明步驟a)-e)純化所得HPV6N2C-Ll上樣lOpl;3,經本發明步驟a)-e)純化所得HPV6N4C-L1上樣10in1;4,經本發明步驟a)-e)純化所得HPV6N5C-L1上樣lOjnl;結果顯示，N端截短了2個、4個、或5個氨基酸的HPV6Ll蛋白HPV6N2C-L1、HPV6N4C-L1、HPV6N5C-L1經過步驟a)-e)處理，蛋白純度均達到了98%左右。圖10顯示了經過步驟a)-f)所得的N端分別截短了2個、4個、或5個氨基酸的HPV6Ll蛋白HPV6N2C-L1、HPV6N4C-L1、HPV6N5C-L1類病毒顆粒透射電鏡觀察(50，000倍)結果。1，經過步驟a)-f)所得的HPV6N2C-Ll類病毒顆粒透射電鏡觀察(50，000倍)結果；2，經過步驟a)-f)所得的HPV6N4C-Ll類病毒顆粒透射電鏡觀察(50，000倍)結果；3經過步驟a)-f)所得的HPV6N5C-L1類病毒顆粒透射電鏡觀察(50，000倍)結果；結果顯示，視野中可見大量半徑為"nm左右的類病毒顆粒，顆粒大小與理論大小相符，均勻一致。圖ll顯示了經過步驟a)-f)所得的N端分別截短了2個、4個、或5個氨基酸的HPV6Ll蛋白HPV6N2C-L1、HPV6N4C-L1、HP雨5C-L1類病毒顆粒的動態光散射觀測結果。1，經過步驟a)-f)所得的HPV6N2C-L1類病毒顆粒動態光散射觀測結果；2，經過步驟a)-f)所得的HPVM4C-L1類病毒顆粒動態光散射觀測結果；3，經過步驟a)-f)所得的HPV6N5C-Ll類病毒顆粒動態光散射觀測結果；結果顯示，HPV6MC-Ll、HPVM化-Ll、HPV6N5C-Ll類病毒顆粒的水化分子動力學半徑25nm左右，顆粒組裝百分比為100%。序列序列1(SEQIDNO:1):1MPSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFYHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKV61SGYQYRVFKVVLPDPMFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNK121YDDVENSGSGGNPGQ腿VNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCP181PLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPIDICGTTCKYPDYL()MAADPYGDRL241FFFLRKEQMFARHFFNRAGEVGEPVPDTLIIKGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQL301FNKPYWLQKAQG鵬GICWGNQLFYTVVDTTRSTNMTLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHV361EEYDLQFIFQLCSITLSAEVVAYI,NPSVLE,FGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAIT421CQKPTPEKQKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSELDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRP481AVSKASAAPKRKRAKTKR序列2(SEQIDNO:2):1MRPSDSTVYVPPPNPVSKVV61VSGYQYRVFKVVLPDPNKFA121KYDDVENSGSGGNPGQDNRV181PPLELITSVIQDGDMVDTGF241LFFFLRKEQMFARHFFNRAG301LFNKPYWLQKAQGH腦ICT361VEEYDLQFIFQLCSITLSAE421TCQKPTPEKQKPDPYKNLSF481PAVSKASAAPKRKRAKTKRATDAYVTRTNIFYHASSSRLLPDSSLFDPTTQRLVWACTGNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGAMNFADLQTNKSDVPIDICEVGEPVPDTLIIKGSGNRTSGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCVVAYIHTMNPSVLED麗GLWEVNLKEKFSSELDQYPLGRLAVGHPYFSIKRANKTVVPKLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNGBH歸GKQCTNTPVQAGDCGTTCKYPDYLQMAADPYGDRVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQASVTTSSTYTNSDYKEYMRHSPPPNGTLEDTYRYVQSQAIKFLLQSGYRGRSSIRTGVKR序列3(SEQIDNO:3):l'MSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIF61GYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQ121DDVENSGSGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLC181LELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTM241FFLRKEQMFARHFFNRAGEVGEPVPDTLII301NKPYWLQKAQGHNNGICTCNQLFVTVVDTT361EYDLQFIFQLCSITLSAEVVAYIHTMNPSV421QKPTPEtCQKPDPYKNLSFWE跳KEICFSSE481VSKASAAPKRKRAKTKR序列4(SEQIDNO:4):1MDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFY61YQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQR121DVENSGSGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCM181ELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKS241FLRKEQMFARHFFNftAGEVGEPVPDTLIIK301KPYWLQKAQG■GICWGNQLFVTVVDTTR361YDLQFIFQLCSITLSAEVVAYIHTMNPSVL421KPTPEKQKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSEL481SKASAAPKRKRAKTKR序列5(SEQIDNO:5):YHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNKYMVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCPPSDVPIDICGTTCKYPDYLQMAADPYGDRLFKGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQLFRST服TLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHVELEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCLDQYPLGMFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSGLVffACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNKYDVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCPPLDVPIDICGTTCKYPDY1QMAADPYGDRLFFGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQLFNSTNMTLCASVTTSSTYTHSDYKEYMRHVEEBOTNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAV1ATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATG丁GCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTT61GTTGCCACGGATGCTTATGTTACTCGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGA121CTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAAACGGGCTAACAAAACTGTTGTGCCA181AAGGTGTCAGGATATCAATACAGGGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTT2"GCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCACA301GGCCTAGAGGTGGGCAGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTT丁CCTA361AATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGAGTGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGG421GTTAATGTTGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCT481TTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTAAACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGCTGGTGAC541TGCCCGCCCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGC601TTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTATTGACATA661TGTGGCACTACATGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCATATGGTGAT721AGATTATTTTTTTTTCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAACAGGGCT781GGCGAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGATACTCTTATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGAACG841TCTGTAGGGAGTAGTATATATGTTAACACCCCAAGCGGCT(TTTGGTGTCCTCTGAGGCA901CAATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGT961TGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTA1021TGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGT1081CATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCT1141GAAGTAATGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGG1201TTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCC1261ATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGCAAAAGCCAGATCCCTATAAGAACCTTAGT1321TTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTATCCTTTGGGA1381CGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGTCCTCTATTCGTACCGGTGTTAAG1441CGCCCTGCTGTTTCCAAAGCCTCTGCTGCCCCTAAACGTAAGCGCGCCAAAACTAAAAGG1501TAA序列6(SEQIDNO:'6):1ATGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAA51AGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTACTCGCACCAACATATTTTATCATG101CCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAAA151CGGGCTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATACAGGGT201ATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGT251CTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCACAGGCCTA301GAGGTGGGCAGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTT351CCTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTC'AGGGAGTGGTGGTAACCCTG401GACAGGATAACAGGGTTAATGTTGGTATGGATTATAAACAAACACAATTA451TGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTAA501ACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGCTGGTGACTGCCCGCCCTTAGAAC551TTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGT601GCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTATTGA651TATATGTGGCACTACATGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAG701ACCCTTATGGTGATAGATTATTTTTTTTTCTACGGAAGGAACAAATGTTT751GCCAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGCGAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGA801TACTCTTATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGAACGTCTGTAGGGAGTAGTA851TATATGTTAACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACAATTG901TTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTAT951TTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTA1001CCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAAT1051TCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATT1101TATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAGTGGCCTATA1151TTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCG1201CCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACA1251GGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGCAAAAGCCAGATCCCT1301ATAAGAACCTTAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGT151351GAATTGGATCAGTATCCTTTGGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATA1401TAGGGGACGGTCCTCTATTCGTACCGGTGTTAAGCGCCCTGCTGTTTCCA1451AAGCCTCTGCTGCCCCTAAACGTAAGCGCGCCAAAACTAAAAGGTAA下面結合實施例對本發明進一步舉例描述。這些實施例是非限制性的。實施例1:具有序列1的截短HPV6Ll蛋白的表達用做模板之HPV6Ll基因片段的制備HPV-6L1基因全長由上海博亞公司合成。所合成的基因片段全長為1503bp，其序列為序列5。在此人工合成的HPV-6L1基因全長片段的基礎上制備本發明截短HPV6Ll蛋白之模板。截短HPV6Ll基因的非融合表達載體的構建以前一步驟所合成的HPV6L1全長基因片段用做再次PCR反應的模板。以6N3F:5，-CATATgCCTAGCGACAGCACAGTATA-3，(SEQIDN0:10)為正向引物，其5，端引入限制性內切酶Ndel位點，Ndel位點序列為CATATG，ATG為大腸桿菌系統中的起始密碼子；6CR:5'-GTCGACTTACCTTTTAGTTTTGGCGC—3'(SEQIDN0:11)為反向引物，其5，端引入限制型內切酶Sail位點。在PCR熱循環儀(BiometraT3)按照如下條件進行PCR反應941C變性5min1個循環94"C變性50sec25個循環571C退火50sec721C延伸2min721C延伸10min1個循環擴增得到1.5kb左右大小特異的DNA片段。將該PCR產物與商售的pMD18-T載體(TAKARA公司生產)連接，經Ndel/Sa11酶切鑒定，得到插入截短HPV6L1基因的陽性克隆pMD18-T-HPV6N3C-L1。在上海博亞生物工程公司，利用M13(+)/(-)引物，測得pMD18-T-HPV6N3C-Ll質粒中插入的目的核苷酸序列為序列6，其編碼的氨基酸序列即為序列1:該序列對應的蛋白質為為N端被截短3個氨基酸、C端未被截短的HPV6Ll蛋白，命名為HPV6N3C-L1。將上述的pMD18-T-HPV6N3C-L1質粒，經Ndel/Sall酶切，獲得截短的HPV6N3C-L1基因片段。再將該片段與經Ndel/Sall酶切的pTrxFus原核表達載體(購自Invitrogen乂〉司)相連接，由于融合蛋白已被切除，在起始氨基酸Met之后緊接著目的蛋白，不帶其他融合多肽。Ndel/Sall酶切鑒定得到插入Ll蛋白基因片段的陽性表達克隆pTRX-HPV-6N3C-L1。取1jaL的pTRX-HPV-6N3C-L1質粒(0.15mg/ml)轉化40uL以氯化鈣法制備的感受態大腸桿菌GI698((購自Invitrogen乂^司)，涂布于氨千(終濃度IOOmg/ml，下同)抗性的固體CAA培養基(6gNa2HP04,3gKH2P04，0.5gNaCl，lgNH4C1，20g酪蛋白水解物，0.095gMgCl2,1.5g瓊脂粉溶解于900ml去離子水中，加入50%甘油20ml),301C靜置培養10-12小時至單菌落清晰可辨。挑取單菌落至含4mL氨節抗性的液體IMC培養基之試管，25X:220轉/分振蕩培養10小時，從中取lmL菌液于-701C凍干保存。HPV6N3C-L1的大量表達從-70"C中取出帶有重組質粒pTRX-HPV6N3C-L1的大腸桿菌凍干菌種，接入氨千抗性的50mlIMC液體培養基，200rpm，30X:，培養大約8小時，然后轉接入10瓶500ml培養基中，每瓶接入5ml菌液，200rpm，301C，搖瓶培養過夜。主要儀器，上海保興生物公司50升發酵罐校正發酵罐pH電極，配制30升培養基裝入發酵罐，1211C滅菌30分鐘，校正溶氧電極，以滅菌后未通氣前為零點，以發酵時通氣后未接種前初始攪拌速度100rpm時為100%。補料準備，酪蛋白水解物配制濃度為30%(30g溶至100ml)，葡萄糖504(50g溶至100ml)，121X:滅菌20分鐘。第二天將10瓶種子液5升接入發酵罐中，溫度301C，PH值7.0，手動調節攪拌速度及通氣量，維持溶氧在40%以上。流加補料，將50%葡萄糖和30%酪蛋白水解物按溶質質量比2:1的比例混合。流加速度如下100%為25ml/min第一小時5%;第二小時10%;第三小時20°/。；第四小時40%;第五小時以后60%培養至菌濃度達到OD600大約10左右時將培養溫度降至25匸加入4g色氨酸誘導培養4小時。終濃度大約為40左右(OD600)下罐,離心收集菌體大約2.5kgIMC培養基配方如下(1升)<table>complextableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例2:純度約70%的HPV6N3C-L1的獲得按lg菌體對應10mL裂解液,(20mMTris緩沖液pH7.2，300mMNaCl)的比例重懸菌體，采用APV均質機(AnInvensysGroup產品)以600bar壓力破碎菌體5次。JA-14轉頭13500rpm(30000g)，離心15min，留取上清，通過10。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，此時上清中HPV6N3C-L1的純度約為10%。釆用CENTRASETTE5切向流裝置(PALL產品)對上清進行透析，所用膜包截留分子量為30kDa，透析液為10mM磷酸緩沖液pH6.O緩沖液，透析體積為三倍上清體積，運行時壓力為0.5psi，流速為500mL/min，切向流速為200mL/min。透析充分后，JA-10轉頭(BeckmanJ25高速離心機)9500rpm(12000g),20min離心收獲沉淀，用1/10上清體積的10mM磷酸緩沖液pH7.0，10mMDTT，300mMNaCl重懸沉淀，攪拌30min。JA-14轉頭(BeckmanJ25高速離心機)，13500rpm(30000g),離心20min，離心得上清，使用0.22pm孔徑濾膜過濾樣品，以該樣品進行下一步的陽離子交換色鐠純化。取150jLiL過濾后樣品，加入6XLoadingBuffer30jiL。混勻，于80。C水浴10min后取10jiL于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中以120V電壓電泳120min。隨后以考馬斯亮蘭染色顯示電泳條帶，電泳結果見圖1。通過SDS-PAGE分析可知HPV6N3C-L1蛋白在通過沉淀、復溶的步驟之后，目的蛋白得到了純化和富集，純度達到了約70%左右。實施例3:HPV6N3C-L1的色語純化HPV6N3C-L1的陽離子交換色i瞽純化儀器系統GEHealthcare原AmershanPharmacia公司生產的AKTAexplorer100型制備型液相色i瞽系統。層析介質SPSepharose4FastFlow。柱體積5.5cmx20cm。緩沖液20mM磷酸緩沖液pH7.0,10mMDTT20mM磷酸緩沖液pH7.010mMDTT2MNaCl。流速25mL/min檢測器波長280nm樣品為3L純度約為70。/。HPV6N3C-L1溶液洗脫程序為200mMNaCl洗脫雜蛋白，500mMNaCl洗脫目的蛋白，收集500mMNaCl洗脫產物，共獲得HPV6N3C-L1純化樣品900mL。HPV6N3C-Ll的CHT-II(羥基磷灰石色諮)純化儀器系統GEHealthcare原AmershanPharmacia乂>司生產的AKTAexplorer100型制備型液相色鐠系統。層析介質CHT-II(購自Bio-RAD)柱體積5.5cmx20cm緩沖液lOmM磷酸緩沖液pH7.0，10mMDTT，0.5MNaCl。流速20ml7min。檢測器波長280nm。才羊品為SPSepharose4FastFlow500mMNaCl洗脫產物洗脫程序為直接收取含目的蛋白的穿透收集穿透產物，獲得純化的HPV6N3C-L1樣品lOOOmL。取經本實施例方法純化的HPV6N3C-L1樣品150juL，加入6XLoadingBuffer30混勾，于80C水浴10min后取于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中以120V電壓電泳120min。隨后以考馬斯亮蘭染色顯示電泳條帶，電泳結果見圖2。由電泳結果可知，目的蛋白濃度約為0.7mg/ml，SDS-PAGE考染純度大于98%。實施例4:HPV6N3C-L1類病毒顆粒的組裝儀器系統為PALL生產的CENTRASETTE5切向流系統；膜包截留分子量為30kDa;樣品為實施例3所得HPV6N3C-Ll1000ml。樣品的濃縮調節系統切向流速為50mL/min,濃縮樣品至總體積為800mL。樣品的復性以10L復性緩沖液(20mMPBpH6.0,2mMCaC12，2mMMgCl2，0.5MNaCl，0.003%Tween-80)充分交換樣品緩沖液。切向流裝置運行時壓力為0.5psi，切向流速度為10mL/min,待復性緩沖液交換完后，改為儲存緩沖液(20LPBS:20mMPBpH6.5,0.5MNaCl)進行交換，交換體積為20L。運行時壓力為0.5psi，切向流速為25mL/min。待所有液體交換完畢后，使用PALL0.20pim濾器無菌過濾樣品，即得HPV6N3C-L1類病毒顆粒，將其置于41C保存備用。實施例5:HPV6N3C-L1VLP的形態學檢測及其免疫原性測定HPV6N3C-Ll類病毒顆粒透射電鏡觀察儀器為日本電子公司生產的100kV透射電鏡，放大倍數為100，000倍。HPV6N3C-L1類病毒顆粒經2%磷鴒酸pH7.0負染，固定于噴炭的銅網上進行觀察。結果如圖3，可見實施例4所得樣品大量半徑為"nm左右的類病毒顆粒，大小均勻，呈現為空心形態。HPV6N3C-L1類病毒顆粒動態光散射觀察儀器為美國ProteinSolutions公司生產的DynaProMS/X型動態光散射儀(含溫度控制器)，使用算法為Regulation算法。樣品為實施例4所得樣品。樣品經0.22Mm濾膜過濾后進行測量。測量結果見圖4。結果顯示HPV6N3C-L1VLP的水化分子動力學半徑為25.46nm。HPV6假病毒中和細胞模型的建立由于HPV難以在體外進行培養，而且HPV宿主特異性強，難以在人以外的宿主上繁殖，缺乏合適的動物模型。因此，為了能對HPV疫苗的免疫保護性進行快速評估，需要建立有效體外中和實驗模型。假病毒(pseudovirions)體外感染模型利用了HPVVLP可非特異包裝核酸的特性，通過在細胞內表達HPV的L1和L2蛋白，通過包袞細胞內的游離體病毒DNA或外源導入的報告質粒組成HPV假病毒。(Yeager，M.D,Aste-Amezaga，M.etal(2000)Virology(278)570-7)具體方法有重組病毒表達系統法及多質粒共轉染方法。本發明采用的多質粒共轉染方法，并且針對HPV系統采取了如下的改進建立了對293FT細胞的優化的磷酸鈣轉染方法，可獲得高達90%以上的轉染效率，有利于進行較大規模的生產。獲得了密碼子優化的HPV結構蛋白的表達質粒，其可在哺乳動物細胞中高效表達HPVLl和L2基因，有利于高效組裝假病毒。HPV假病毒的構建用CsCl密度梯度離心方法分別純化帶有HPV6L1基因的質粒p6Llh、帶有HPV6L2基因的質粒p6L2h、及帶有綠色熒光蛋白基因的質粒pN31-EGFP(以上質粒由NIH的JohnT.Schiller教授饋贈)。CsCl密度梯度離心純化質粒的方法參照《分子克隆第三版》。簡言之將質粒轉化大腸桿菌DH5oc，挑取單菌落接種到500mLLB培養基中，37X:搖瓶培養16小時。9000g離心5min，收集菌體。每1000mL菌液收獲的菌體，依次加入40mL溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-Cl(pH8.0)，10mMEDTA(pH-8.0))和2mLRNaseA(1jug/mL)，40mL溶液II(0.2MNaOH，1°/。SDS)，48mL溶液III(5M乙酸鉀60.OmL，水乙酸11.5mL，去離子水28.5mL)。在冰上放置10min后，15000g，rC離心20min,取上清與0.6倍體積的異丙醇混合，15000g離心30min，棄去上清，用70%乙醇洗沉淀1次，用TE溶解沉淀，測定DNA含量。在DNA溶液中溶入CsCl(每克DNA對應1.OlgCsCl)，再溶入100uL10mg/mL的溴化乙錠溶液，用BeckmanNVT65轉子，62000rpm，WX:離心10hr。用注射器針頭收集閉環DNA區帶，用等體積的異戊醇重復抽提4次。加入3倍體積的水和8倍體積的無水乙醇，20000g，4匸離心30min，收集DNA沉淀。75%酒精洗滌1次，用lmLTE溶解DNA沉淀。測定DNA溶液的濃度，分裝成小份儲存于-20匸。純化后的p6Llh、p6L2h、pN31-EGFP用磷酸鈣方法共轉染培育于10cm細胞培養皿中的293FT細胞(Invitrogen)。砩酸鉀轉染方法將p6Llh、p6L2h、pN31-EGFP各40ug加入lmL的HEPES溶液(每50mL去離子水含有pH=7.3的1MHepes125uL，4tc儲存)和lmL的0,5mol/LCaCl2溶液的混合溶液，混合后逐滴加入2mL2xHeBS溶液(0.28MNaCl(16.36g)，0.05MHEPES(11.9g)，1.5mMNa2HP04(0.213g)，溶解于1000mL去離子水，pH-6.96，-70匸儲存)中，室溫下靜置lmin后將混合液加入培養有293FT細胞的10cm細胞培養亞中，6hr后棄去原培養液，加入10mL完全培養液(invitrogen公司產品)，轉染48hr后，棄去培養基，用PBS洗2次，將細胞刮下收集細胞，細胞計數，每108個細胞用lmL裂解液(0.25%Brij58，9.5mMMgCl2)重懸。裂解完成后，5000g離心10min，收集上清，加入5MNaCl(終濃度為850mM),即為假病毒液，分裝為小份后置于-2ox:保存。將293FT細胞(Invitrogen)鋪于96孔細胞培養板中(1.5x104/孔)。5hr后進行中和實驗，將待測的血清樣品分別用10。/。DMEM進行連續倍比稀釋，然后取50jiL分別與50nL稀釋于10。/。DMEM的上文制備的假病毒液(moi-0.1)混合。41c孵育lh后分別加入預鋪有293FT細胞的96孔細胞培養板中，371c培養72h后先用熒光觀察確定各樣品大概的中和滴度，再用流式細胞儀(EPICSXL，美國BeckmanCoulter公司)檢測各孔細胞的感染率，計算單抗或多抗血清的準確中和滴度。感染率為細胞樣品在陽性區中的細胞數量百分率減去未感染的對照細胞樣品在陽性區的數量百分率。感染抑制率=(1-阻斷孔的感染率/未阻斷孔的感染率)x100%。抗體中和滴度的定義為達到高于50%感染抑制率的最大稀釋倍數。經50倍稀釋后能達到50%以上感染抑制率的單抗或多抗被視為具有中和能力。HPV6VLP疫苗免疫動物的免疫保護性評價兔普通級，雌性，6~8周齡，購自廣西省疾病預防與控制中心，并在該中心飼養。實施例4所制備的HPV6N3C-L1類病毒顆粒初免與等量福氏完全佐劑混合，加強免疫則與等量福氏不完全佐劑混合進行制備，免疫方式為肌肉注射，初次免疫劑量為100ug/只，此后分別于4，IO周各加強一次，加強免疫劑量為50ug/只。自免疫后，每周抽取外周靜脈血，分離血清，保存待檢。羊普通級，雌性，6~8周齡，購自廣西省疾病預防與控制中心，并在該中心飼養。實施例4所制備的HPV6N3C-Ll類病毒顆粒初免與等量福氏完全佐劑混合，加強免疫則與等量福氏不完全佐劑混合進行制備，免疫方式為肌肉注射，初次免疫劑量為lmg/只，此后分別于4，10，18周各加強一次，加強免疫劑量為0.5mg/只。自免疫后，每周抽取外周靜脈血，分離血清，保存待檢。以上述假病毒中和細胞模型實驗評估上述抗血清的中和效價，如圖5和6所示。結果表明，本發明實施例4獲得的HPV6N3C-L1類病毒顆粒(除了實驗中用到的福氏佐劑外，也可以是商用或自制的氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑)混合醉制成為疫苗，具有良好的免疫原性，可在動物體內誘導高滴度的中和抗體，可作為預防HPV感染的疫苗。HPV6/11二價疫苗免疫小鼠的免疫保護性評價免疫用動物為4-5周齡SPF級BALB/c小鼠4只。按本發明實施例1-4所述類似方法制備HPV6N5C-L1和HPV11N4C-Ll類病毒顆粒。將上述2種類病毒顆粒HPV6N5C-L1和HPV11N4C-L1按1:2(重量比)的比例混合，使得混合后的上述兩種類病毒顆粒的濃度為40，80jug/ml。之后，對于初免，再加入等體積的福氏完全佐劑與之混合均勻。加強免疫則與等體積福氏不完全佐劑混合進行制備。免疫方式為肌肉注射，初次免疫劑量為HPV6N5C-Ll類病毒顆粒10pg/只，HPV11N4C-L1類病毒顆粒20pg/只。此后分別于2周加強一次，加強免疫劑量為HPV6N5C-L1類病毒顆粒20ug/只，HPV11N4C-L1類病毒顆粒40lug/只。自免疫后，每周抽取外周靜脈血，分離血清，按實施例5所述方法分別檢測免疫小鼠中針對HPV6，HPV11假病毒顆粒的中和抗體滴度。檢測結果如圖7所示，結果表明，由本發明實施例1-4所述方法獲得的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1兩種類病毒顆粒混合而制備的HPV6、HPV11二價疫苗具有良好的免疫原性，可在動物體內誘導高滴度的針對HPV6，HPV11的中和抗體，可作為預防HPV6/HPV11感染的有效疫苗(除了實施例中所采用的福氏佐劑外，該疫苗也可由本發明所制備的HPV16N5C-Ll，HPV11N4C-L1兩種類病毒顆粒與商用或自制的氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑混合而成)。上述的HPV11N4C-L1類病毒顆粒對應的氨基酸序列為(SEQIDNO:7):MetSerAspSerThrValTyrValProProProAsnProValSerLys151015ValValAlaThr20AspAlaTyrValLys.25ArgThrAsnliePhe30TyrHisAlaSerSer35SerArgLeuLeuAla40ValGlyHisProTyr45TyrSerlieLysLys50ValAsnLysThrVal55ValProLysValSer60GlyTyrGinTyrArgValPheLysValValLeuProAspProAsnLysPheAlaLeuPro65707580AspSerSerLeuPhe85AspProThrThrGin90ArgI>euValTrpAla95CysThrGlyLeuGlu100ValGlyArgGlyGin105ProLeuGlyValGly110ValSerGlyHisPro115LeuLeuAsnLysTyr120AspAspValGluAsn125SerGlyGlyTyrGlyGlyAsnProGlyGinAspAsnArgValAsnValGlyMetAsp130TyrLys145GluHisGlyAspAspMetThrAsn210TyrPro225PhePheArgAlaGlyGlyProSer290TyrTrp305AsnHisThrLeuTyrLysPheGin370HisThr385ProProGinAlaProTyrSerSer450SerGly465AlaValLysLysGinTrpCysVal195LysAspTyrGlyAsn275GlyLeuLeuCysGlu355LeuMetProlieLys435GluTyrSerThrGlyPro180AspSerTyrLeuThr260AsnSerGinPheAla340TyrCysAsnAsnThr420AspLeuArgLysGinLys165ProThrAspLeuArg245ValArgLeuLysVal325SerMetSerProGly405CysMetAspGlyPro485Leu150GlyLeuGlyValGin230LysGlySerValAla310ThrValArglieSer390ThrGinSerGinArg470Ser135CysThrGluPhePro215MetGluGluSerSer295GinValSerHisThr375ValLeuLysPhePhe455ThrThrMetGinLeuGly200LeuAlaGinProVal280SerGlyValLysVal360LeuLeuGluProTrp440ProSerAlaValCyslie185AlaAspAlaMetVal265AlaGluHisAspSer345GluSerGluAspThr425GluLeuAlaProGlySer170ThrMetlieAspPhe250ProSerAlaAsnThr330AlaGluAlaAspThr410ProValGlyArgLys490Cys155AsnSerAsnCysPro235AlaAspSerGinAsn315ThrThrPheGluTrp395TyrGluAsnArgThr475Arg140AlaThrValPheGly220TyrArgAsplieLeu300GlyArgTyrAspVal380AsnArgLysLeuLys460GlyLysProSerlieProLeuGly160ValGinAsn175GinAspGly190AspLeuGinAla205ThrValCysLysGlyHisLeuTyr285PhelieSerThrLeu365MetPheTyrGluLys445PhelieArgAspArgLeu240PhePheAsn255LeuValLys270ValHisThrAsnLysProCysTrpGly320ThrAsnMet335AsnSer350GinAlaGlyValLys430GluLeuLysThrPheTyrLeuGin415GinLysLeuArgLys495AsplielieSer柳SerAspPheGinPro480ThrHPV6/11/16/18四價疫苗免疫小鼠的免疫保護性評價免疫動物4-5周齡SPF級BALB/c小鼠4只。按本發明實施例l-4所述類似方法制備HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，和HPV18N65C-Ll的類病毒顆粒。將上述4種類病毒顆粒HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-Ll，HPV18N65C-L1按1:2:2:1(重量比)的比例混合，使得混合后的上迷四種類病毒顆粒的濃度為40，80，80，40jLig/ml。之后，對于初免，再加入等體積的福氏完全佐劑與之混合均勻。加強免疫則與等體積福氏不完全佐劑混合進行制備。免疫方式為肌肉注射，初次免疫劑量為HPV6N5C-L1，HPV18N65C-Ll類病毒顆粒各10jug/只，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-Ll類病毒顆粒各20jig/只。此后分別于2周加強一次，加強免疫劑量為HPV6N5C-L1，HPV18N65C-L1類病毒顆粒各20jag/只，HPV11N4C-Ll，HPV16N30C-L1類病毒顆粒各40jug/只。自免疫后，每周抽取外周靜脈血，分離血清，按實施例5所述方法分別檢測免疫小鼠中針對HPV6，HPV11，HPV16,HPV18假病毒顆粒的中和抗體滴度。檢測結果如圖8所示，結果表明，由本發明實施例1-4所述方法獲得的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1四種類病毒顆粒混合而制備的HPV6、HPVll、HPV16、HPV18四價疫苗具有良好的免疫原性，可在動物體內誘導高滴度的針對HPV6，HPVll，HPV16,HPV18的中和抗體，可作為預防HPV6/HPV11/HPV16/HPV18感染的有效疫苗(除了實施例中所采用的福氏佐劑外，該疫苗也可由本發明所制備的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1四種類病毒顆粒與商用或自制的氫氧化鋁或磷酸鋁佐劑混合而成)。上述的HPV6N5C-L1類病毒顆粒的Ll氨基酸序列見SEQIDNO:4。上述的HPV16N30C-L1類病毒顆粒的Ll氨基酸序列為(SEQIDNO:8):MetLeuProSerGluAlaThrValTyrLeuProProValProValSer151015LysValValSerThrAspGluTyrValAlaArgThrAsnlieTyrTyrHisAlaGly35LyslieLys50LeuGin65GlyPheTrpAlaGlylieAlaSer130SerMet145ProlieValAsnGinAspThrUu210lieCys225AspSerLeuPheTyrliePhePro290AsnLys305CysTrpThrAsnLysAsnLeuGin370MetThrTyrProCysSer115AlaAspGlyProGly195GinLysLeuAsnLys275ThrProGlyMetThr355PheTyr20ThrProArgAspVal100GlyTyrTyrGluGly180AspAlaTyrPheArg260GlyProTyrAsnSer340AsnlielieSerAsnValThr85GlyHisAlaLysHis165AspMetAsnProPhe245AlaSerSerTrpGin325LeuPhePheHisArgAsnPhe70SerValProAlaGin150TrpCysValLysAsp230TyrGlyGlyGlyLeu310LeuCysLysLeuAsn55ArgPheGluLeuAsn135ThrGlyProAspSer215TyrLeuAlaSerSer295GinPheAlaGluGinLeu375SerMetLeu40LyslieTyrValLeu120AlaGinLysProThr200GlulieArgValThr280MetArgValAlaTyr360CysAsn25AlalieHisAsnGly105AsnGlyLeuGlyLeu185GlyValLysArgGly265AlaValAlaThrlie345LeuLysSerValLeuLeuPro90Arg.LysValCysSer170GluPheProMetGlu250AspAsnThrGinVal330SerArglieThrGlyValPro75AspGlyLeuAspLeu155ProLeuGlyLeuVal235GinAsnLeuSerGly315ValThrHisThrlieHisPro60AspThrGinAspAsn140lieCyslieAlaAsp220SerMetValPro45LysProGinProAsp125ArgGlyThrAsnMet205lieGluPhePro30TyrPheProValSerGlyAsnLysPhe80ArgLeuVal95LeuGlyVal110ThrAlaSer285AspAla300HisAsriAspThrSerGluGlyGlu365LeuThr380LeuGluGluCysAsnThr190AspCysProValAsp270SerGinAsnThrThr350GluAlaAspGluAsnCyslieLysPro160ValAla175ValliePheThrThrSerTyrGly240ArgHis255AspLeuAsnTyrliePheGlylie320ArgSer335ThrTyrTyrAspAsplieTrpAsn385PheGlyPheValProLysLysGlu450PheLeu465LysArgArgLysLeuThrGlu435LysLeuLysLysGinSer420AspPheGinAlaArg390395ProProProGlyGlyThrLeuGlu405410GinAlalieAlaCysGinLysHis425ProLeuLysLysTyrThrPheTrp440SerAlaAspLeuAspGinPhePro455460AlaGlyLeuGluAlaLysProLys470475ThrProThrThrSerSerThrSer485490495LysLeu500400AspThrTyrArg415ThrProProAla430GluValAsnLeu445LeuGlyArgLysPheThrLeuGly480ThrThrAlaLys上述的HPV18N65C-LI類病毒顆粒的LI氨基酸序列為(SEQIDNO:9):MetArg1ArgValHisAlaValPro50TyrGin65GlyUuTrpAlaGlyLeuSerHis130SerVal145AlalieLeuSerGluAspProValGly35AlaTyrProCysSer115AlaAspGlyGinGlySerAsn20SerGlyArgAspAla100GlyAlaTyrGluGly180AspAsp5ThrSerGlyValThr85GlyHisThrLysAsnAspArgGlyPhe70SerValProSerGin150TrpHis165AspCysMetValThrValAspTyrLeuLeu40AsnLys55ArglieGluPheAsn135ThrAlaProAspValTyrlieTyr120ValGinLysProThrTyrLeu10ValThr25ThrValGinAspGinLeuAsnPro90GlyArg105AsnLysSerGluLeuCysGlyThr170LeuGlu185GlyTyrProProProSerArgThrSerlie30GlyAsnProTyr45lieProLys60ProAsp75GluGlyLeuAsplie155AlaLeuGlyThrGinAspVal140LeuCysLysProGinProAsp125ArgGlyLysAsnAlaMetValAsnArgLeu110ThrAspCysSerThr190AspVal15PhePheSerLysLeu95GlyGluAsnAlaArg175ValPheAlaTyrArgAlaPhe80ValValSerValPro160ProLeuSer195ThrLeuGin210CysLyslie225AspPheTyrSerAsn305CysThrTyrAspVal385AsnArgAlaLeuLys465ArgArgSerMetTrpAsnIleJ^ys275Pro290LysTrpAsnAspLeu370MetPhePheGluLys450PheLysValSerProHisLeuAla355GinSerGlyValAsn435GluLeuArgArgAspTyrPheArg260GlyProTyrAsnThr340ThrPheTyrValGin420LysLysValSerVal500ThrProPhe245AlaThrSerTrpGin325lieLyslieliePro405SerAspPheGinAla485ArgLysAsp230CysGlyGlyGlyLeu310LeuCysPhePheHis390ProValProSerAla470ProAlaCys215TyrLeuThrMetSer295HisPheAlaLysGin375SerProAlaTyrLeu455GlySerArg200GluValProLeuAsp220AlaLeuGinArgArgMetGly265ArgAla280lieValLysAlaValThrSerThr345GinTyr360LeuCysMetAsnProThrlieAla425AspLys440AspLeuLeuArgAlaThrLysMetGlu250AspSerThrGinVal330GinSerThrSerThr410CysLeuAspArgThr柳Ser235GinThrProSerGly315ValSerArglieSer395SerGinLysGinLys475AlaLeuValGlyAsp300HisAspProHisThr380lieLeuLysPheTyr460ProSer205lieAspPheProSer285SerAsnThrValVal365LeuLeuValAspTrp445ProThrLysCysProAlaGin270CysGinAsnThrPro350GluThrGluAspAla430AsnLeulieProGinTyrArg255SerValLeuGlyArg335GlyGluAlaAspThr415AlaValGlyGlyAla495SerGly240HisLeuTyrPheVal320SerGinTyrAspTrp400TyrProAspArgPro480Lys上述的HPV11N4C-L1類病毒顆粒對應的氨基酸序列顯示如上(SEQIDNO:7)。200810111390.4說明書第27/40頁實施例6:依據本發明實施例1-5所采用的技術，制備具有序列2,3，4的截短HPV6L1蛋白，以上截短蛋白均可純化得到純度達到98%以上的蛋白，組裝為半徑25nm左右的類病毒顆粒。結果見圖9、圖10和圖11。序列表<110>廈門大學等〈120〉截短的人乳頭瘤病毒6型L1蛋白<130>IDC080067<歸11<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>498<212>PRT<213>人工<400〉1MetProSerAspSerThrValTyrValProProProAsnProValSer151015LysValValAlaThrAspAlaTyrValThrArgThrAsnliePheTyr202530HisAlaSerSerSerArgLeuLeuAlaValGlyHisProTyrPheSer354045lieLysArgAlaAsnLysThrValValProLysValSerGlyTyrGin505560TyrArgVslPheLysValValLeuProAspProAsnLysPheAlaLeu65707580ProAspSerSerLeuPheAspProThrThrGinArgLeuValTrpAla859095CysThrGlyLeuGluValGlyArgGlyGinProLeuGlyValGlyVal100105110SerGlyHisProPheLeuAsnLysTyrAspAspValGluAsnSerGly115120125SerGlyGlyAsnProGlyGinAspAsnArgValAsnValGlyMetAsp130135140TyrLysGinThrGinLeuCysMetValGlyCysAlaProProLeuGly145150155160GluHisTrpGlyLysGlyLysGinCysThrAsnThrProValGinAla165170175GlyAspCysProProLeuGluLeulieThrSerVallieGinAspGly180185190AspMetValAspThrGlyPheGlyAlaMetAsnPheAlaAspLeuGin195200205ThrAsnLysSerAspValProlieAsplieCysGlyThrThrCysLys210215220TyrProAspTyrLeuGinMetAlaAlaAspProTyrGlyA印ArgLeu225230235240PhePhePheLeuArgLysGluGluMetPheAlaArgHisPhePheAsn245250255ArgAlaGlyGluValGlyGluProValProAspThrLeulielieLys260GlySerGlyAsn275GlySerProTyr305AsnThrTyrPheHis385ProGinProSerSer465AlaLysSer290TrpGinLeuLysGin370ThrProAlaTyrSer450GlyValArgLeuGinLeuPheCysAla340GluTyr355LeuCysMetAsnProAsnlieThr420LysAsn435GluLeuTyrArgSerLysArgThrLeuValLysAla310ValThr325SerValMetArgSerlieProSer390GlyThr405CysGinLeuSerAspGinGlyArg470AlaSer485SerSer295GinValThrHisThr375ValLeuLysPheTyr455SerVal280SerGlyValThrVal360LeuLeuGluProTrp440ProSer265GlySerSerlieGluAlaHisAsnAspThr330SerSer345GluGluSerAlaGluAspAspThr410ThrPro425GluValLeuGlylieArgAlaAlaProLys490GinAsn315ThrThrTyrGluTrp395TyrGluAsnArgThr475ArgLeu300GlyArgTyrAspVal380AsnArgLysLeuLys460GlyLysTyr285PhelieSerThrLeu365ValPheTyrGinLys445PheValArg270ValAsnThrAsnLysCysTrpThrAsn335AsnSer350GinPheAlaTyrGlyLeuValGin415LysPro430GluLysLeuLeuLysArgAlaLys495ProGly320MetAsplielieSer400SerAspPheGinPro480Thr<210>2<211>499<212>PRT<213>人工〈400〉2MetArgProSerAspSerThrValTyrValProProProAsnProVal151015SerLysValValAlaThrA印AlaTyrValThrArgThrAsnliePhe202530TyrHisAlaSerSerSerArgLeuLeuAlaValGlyHisProTyrPhe354045SerlieLysArgAlaAsnLysThrValValProLysValSerGlyTyr505560GinTyrArgValPheLysValValLeuProAspProAsnLysPheAla65LeuAlaValGlyAsp145GlyAlaGlyGinLys225LeuAsnLysThrPro305GlyMetAsplielie385SerSerAspProCysSerSer130TyrGluGlyAspThr210TyrPheArgGlyPro290TyrAsnThrTyrPhe370HisProGinProAspThrGly115GlyLysHisAspMet195AsnProPheAlaSer275SerTrpGinLeuLys355GinThrProAlaTyrSerGly100HisGlyGinTrpCys180ValLysAspPheGly260GlyGlyLeuLeuCys340GluLeuMetProlie420LysSer85LeuProAsnThrGly165ProAspSerTyrLeu245GluAsnSerGinPhe325AlaTyrCysAsnAsn405ThrAsn70LeuGluPheProGin150LysProThrAspLeu230ArgValArgLeuLys310ValSerMetSerPro390GlyCysLeuPheValLeuGly135LeuGlyLeuGlyVal215GinLysGlyThrVal295AlaThrValArglie375SerThrGinSerAspGlyAsn120GinCysLysGluPhe200ProMetGluGluSer280SerGinValThrHis360ThrValLeuLysPheProArg105LysAspMetGinLeu185GlylieAlaGinPro265ValSerGlyValThr345ValLeuLeuGluPro425TrpThr90GlyTyrAsnValCys170lieAlaAspAlaMet250ValGlyGluHisAsp330SerGluSerGluAsp410ThrGlu75ThrGinAspArgGly155ThrThrMetlieAsp235PheProSerAlaAsn315ThrSerGluAlaAsp395ThrProValGinProAspVal140CysAsnSerAsnCys220ProAlaAspSerGin300AsnThrThrTyrGlu380TrpTyrGluAsnArgLeuVal125AsnAlaThrValPhe205GlyTyrArgThrlie285LeuGlyArgTyrAsp365ValAsnArgLysLeuLeuGly110GluValProProlie190AlaThrGlyHisVal95ValAsnGlyProVal175GinAspThrAspPhe255Leulie270TyrValPheAsnlieCys80TrpGlySerMetLeu160GinAspLeuCysArg240PhelieAsnLysTrp320SerThrAsn335ThrAsnSer350UuGinPheValAlaTyrPheGlyLeu400TyrValGin415GinLysPro430LysGluLys435440445PheSerSerGluLeuAspGinTyrProLeuGlyArgLysPheLeuLeu450455460GinSerGlyTyrArgGlyArgSerSerlieArgThrGlyValLysArg465470475480ProAlaValSerLysAlaSerAlaAlaProLysArgLysArgAlaLys485490495ThrLysArg<210>3<211〉497<212>PRT<213〉人工<400>3MetSerAspSerThrValTyrValProProProAsnProValSerLys151015ValValAlaThrAspAlaTyrValThrArgThrAsnliePheTyrHis202530AlaSerSerSerArgLeuLeuAlaValGlyHisProTyrPheSerlie354045LysArgAlaAsnLysThrValValProLysValSerGlyTyrGinTyr505560ArgValPheLysValValLeuProAspProAsnLysPheAlaLeuPro65707580AspSerSerLeuPheAspProThrThrGinArgLeuValTrpAlaCys859095ThrGlyLeuGluValGlyArgGlyGinProLeuGlyValGlyValSer100105110GlyHisProPheLeuAsnLysTyrAspAspValGluAsnSerGlySer115120125GlyGlyAsnProGlyGinAspAsnArgValAsnValGlyMetAspTyr130135140LysGinThrGinLeuCysMetValGlyCysAlaProProLeuGlyGlu145150155160HisTrpGlyLysGlyLysGinCysThrAsnThrProValGinAlaGly165170175AspCysProProLeuGluLeulieThrSerVallieGinAspGlyAsp180185190MetValAspThrGlyPheGlyAlaMetAsnPheAlaAspLeuGinThr195200205AsnLysSerAspValProlieAsplieCysGlyThrThrCysLysTyr210215220ProAspTyrLeuGinMetAlaAlaAspProTyrGlyAspArgLeuPhe225230235240PhePheLeuArgLysGluGinMetPheAlaArgHisPhePheAsnArgAlaGlySerGlySerTrp305GinLeuLysGinThr385ProAlaTyrSerGly465ValArgGly290LeuLeuCysGluLeu370MetProlieLysGlu450TyrSerGluVal260AsnArg275SerLeuGinLysPheValAlaSer340TyrMet355CysSerAsnProAsnGlyThrCys420AsnLeu435LeuAspArgGlyLysAla245GlyThrValAlaThr325ValArglieSerThr405GinSerGinArgSer485GluSerSerGin310ValThrHisThrVal390LeuLysPheTyrSer470AlaProValSer295GlyValThrValLeu375LeuGluProTrpPro455SerAlaValGly280GluHisAspSerGlu360SerGluAspThrGlu440LeulieProPro265SerAlaAsnThrSer345GluAlaAspThrPro425ValGlyArgLys250AspThrSerlieGinLeuAsnGly315ThrArg330ThrTyrTyrAspGluValLeuTyrPhe300lieSerThrLeuVal380TrpAsnPhe395TyrArgTyr410GluLysGinAsnLeuLysArgLysPhe460ThrGlyVal475ArgLysArglieVal285AsnCysThrAsnGin365AlaGlyValLysGlu445LeuLys255lieLysGly270AsnThrProLysProTyrTrpGlyAsn320AsnMetThr335SerAspTyr350PheliePheTyrlieHisLeuSerPro400GinSerGin415ProAspPro430LysPheSerLeuGinSerArgProAla480AlaLysThrLys490495<210>4<211>496<212>PRT<213〉人工<400>4MetAspSerThrValTyrValProProProAsnProValSerLysVal151015ValAlaThrAspAlaTyrValThrArgThrAsnliePheTyrHisAla202530SerSerSerArgLeuLeuAlaValGlyHisProTyrPheSerlieLys354045ArgAlaAsnLysThrValValProLysValSerGlyTyrGinTyrArg5055ValPheLysValValLeuPro6570SerSerLeuPheAspProThr85GlyLeuGluValGlyArgGly100HisProPheLeuAsnLysTyr115GlyAsnProGlyGinAspAsn130135GinThrGinLeuCysMetVal145150TrpGlyLysGlyLysGinCys165CysProProLeuGluLeulie180ValA印ThrGlyPheGlyAla195LysSerAspValProlieAsp210215AspTyrLeuGinMetAlaAla225230PheLeuArgLysGluGinMet245GlyGluValGlyGluProVal260GlyAsnArgThrSerValGly275GlySerLeuValSerSerGlu290295LeuGinLysAlaGinGlyHis305310LeuPheValThrValValAsp325CysAlaSerValThrThrSer340GluTyrMetArgHisValGlu355LeuCysSerlieThrLeuSer370375MetAsnProSerValLeuGlu385390ProAsnGlyThrLeuGluAsp405lieThrCysGinLysProThr60AspProAsnLysPheAlaLeuProAsp7580ThrGinArgLeuValTrpAlaCysThr9095GinProLeuGlyValGlyValSerGly.105110AspAspValGluAsnSerGlySerGly120125ArgValAsnValGlyMetAspTyrLys140GlyCysAlaProProLeuGlyGluHis155160ThrAsnThrProValGinAlaGlyAsp170175ThrSerVallieGinAspGlyAspMet185190MetAsnPheAlaAspLeuGinThrAsn200205lieCysGlyThrThrCysLysTyrPro220AspProTyrGlyAspArgLeuPhePhe235240PheAlaArgHisPhePheAsnArgAla250255ProAspThrLeulielieLysGlySer265270SerSerlieTyrValAsnThrProSer280285AlaGinLeuPheAsnLysProTyrTrp300AsnAsnGlylieCysTrpGlyAsnGin315320ThrThrArgSerThrAsnMetThrLeu330335SerThrTyrThrAsnSerAspTyrLys345350GluTyrAspLeuGinPheliePheGin360365AlaGluValValAlaTyrlieHisThr380AspTrpAsnPheGlyLeuSerProPro395400ThrTyrArgTyrValGinSerGinAla410415ProGluLysGinLysProAspProTyr420425430LysAsnLeuSerPheTrpGluValAsnLeuLysGluLysPheSerSer435440445GluLeuAspGinTyrProLeuGlyArgLysPheLeuLeuGinSerGly450455460TyrArgGlyArgSerSerlieArgThrGlyValLysArgProAlaVal465470475■SerLysAlaSerAlaAlaProLysArgLysArgAlaLysThrLysArg485490495<210〉5〈211〉1503〈212〉DNA<213>人工<400〉5atgtggcggcctagcgacaggttgccacggatgcttatgtcttcttgcagtgggtcatcc卿gtgtcaggatatc犯tagcattgcctgactcgtctctggCCt3g鄉tgggcaggggaataaettatgatgatgttgagttaatgttggtstggsttattgggcgagcattggggt肌tgcccgcccttagaacttattttggtgctatgaattttgctgtggcactacatgtaaataagattattttorcmcroct。十crcrtttttctacgcrcrcrcjcm/"+dt十tctgtagggagtagtatatacaattgtttaataagccatatggggt肪tcaactgtttgttgtgcatccgtaactacatccatgtgg卿agteitgatttg卿t肪tggcctatattcattatcgcctcccccaaatggattacctgtcaaeiagcccacttttggg卿ttaatttaaacgcaagtttttgttacaaagcgccctgctgtttccaaagctaacacagtstattactcgcaccttatttttcccagggtatttttttgatcccacagccattaaaattcagggta^3>caaacaaggtaaacagtaccagtgtttgatttgcagtccagattatgaaggaac肪gcctgatacttgttaacaccttggctEic肪tactgtggtattccacatacacaatttattcac肪tgaattacattagaatcctgetaaagagaaaagtttgtgcctcctcaacatattttat幼肪cgggac肪cacaacctctgctgccagtggtggtacaattatgcatgtactaataatacaggatgaccaataaatttacaaatggatgtttgccapttataattaccaagcggcta卿cccagggataccacEicaccaattctgtttcaattatccctctgtttgat8cctat8caaaagccagtctagtgaatggacggtcctctaaccctgtatcatgccagctaacaaaactaccagatccgtttggtatgtaagtggacaaccctggacatggttggatgcacctgtacagcgatatggtcagatgttccctgceigacccgacattttttgacataacaagcagtaccaaattataaagagtagcattactgg卿actgggtatgtgcaatccctataatggatcagtactattcgtacagcgcgccaaatccaaagttcagttctagatgttgtgccat幼caaatttggcatgcacatcctttcctaggataacaggtgccccccctggctggtgactgacaceiggctattgacataatatggtgatt8BC8gggCta肌tcg肪cgctctgaggcatggtatttgtcatgacattstgtacatgcgtattgtctgctg咖tttggggtcacaggccgaaccttagttcctttgggacggtgtt卿aactaaaagg601201802403003604204805406006607207808409009601020108011401200126013201380144015001503<210>6<211>1497<212>■〈213〉人工〈400〉6atgcctagcgacagcacagtatatgtgcctcctcctaaccctgtatccaa8gttgttgCC60acggatgcttatgttactcgcacc犯catattttatcatgccagcagttctagacttctt120gcagtgggtcatccttatttttccataaaacgggctaacaaaactgttgtgcc犯aggtg180tcaggatatcaatacagggtatttaaggtggtgttaccagatcctaacaaatttgcattg240cctgactcgtctctttttgatcccacaac￡icaacgtttggtatgggcatgcacaggccta300g柳tgggcaggggacagccattaggtgtgggtgtaagtggacatcctttcctaaataaa360tatgatgEitgttgaaaattcagggagtggtggtaaccctggacaggataacagggttaat420gttggtatggattataaacaaacacaattatgcatggttggatgtgccccccctttgggc480gsgcattggggtaaaggtaaacagtgtactaatacacctgtacaggctggtgactgcccg540cccttagaacttattaccagtgttatBC3ggatggcgatatggttgacacaggctttggt600gctatgaattttgctgatttgcagaccaatttcctattgatatatgtggc660actacatgtaaatatccagattatttacaaatggctgcagacccttatggtgEttag3tt8720tttttttttctacgg肌ggaacaaatgtttgccagacatttttttaacagggctggcgag780gtggggg咖ctgtgcctgatactcttataattaagggtagtggaaatcgaacgtctgta840gggagtagtatatatgttaaCElCCCC肌gCggctctttggtgtcctctgaggcacaattg900tttaataagccatattggctacei幼aagcccagggacataacaatggtatttgttggggt960aatcaactgtttgttactgtggtagataccacacgcagtaccaacatgEicattatgtgca1020tccgtaactacatcttccacatacaccaattctgattataaagagtacatgcgtcatgtg1080gaagsgtatgatttacaatttatttttcaattatgtagcattacattgtctgctgaagta1140gtggcctatattceicacaBtgaatccctctgttttggaagactggaactttgggttatcg1200cctcccccaaatggtacattaggiagatacctataggtatgtgcagtcEicaggccattacc1260tgtcaaaagcccactcctgaaaagcaaaagccagatccctataagaaccttagtttttgg1320gaggtteiatttaaaagaaaagttttctagtgaattggatcagtatcctttgggacgcaag1380tttttgttac朋agtggatataggggacggtcctctattcgtaccggtgttaagcgccct1440gctgtttccaaagcctctgctgcccctaaacgt幼gcgcgccaaaactaeiaaggtaa1497<210>7<211>498<212>PRT<213>人工序列<400>7MetSerAspSerThrValTyrVal15ValValAlaThrAspAlaTyrVal20AlaSerSerSerArgLeuLeuAla3540LysLysValAsnLysThrValVal5055ArgValPheLysValValLeuPro6570AspSerSerLeuPheAspProThr85ThrGlyLeuGluValGlyArgGly100ProLys25ValProAspThrGin105Pro10ArgGlyLysProGin90ProProAsnThrAsnHisProValSer60AsnLys75ArgLeuProlieTyr45GlyPheValLeuGlyValValPhe30TyrTyrAlaTrpGly110Ser15TyrSerGinLeuAla95ValLysHislieTyrPro80CysSerGlyHisTyrGly130TyrLys145GluHisGlyAspAspMetThrAsn210TyrPro225PhePheArgAlaGlyGlyProSer290TyrTrp305AsnHisThr乙euTyrLysPheGin370HisThr385ProProGinAlaProTyrSerSer450SerGly465Pro115GlyGinTrpCysVal195LysAspTyrGlyAsn275GlyLeuLeuCysGlu355LeuMetProlieLys435GluTyrLeuAsnThrGlyPro180AspSerTyrLeuThr260AsnSerGinPheAla340TyrCysAsnAsnThr420AspLeuArgLeuProGinLys165ProThrAspLeuArg245ValArgLeuLysVal325SerMetSerProGly405CysMetAspGlyAsnGlyLeu150GlyLeuGlyValGin230LysGlySerValAla310ThrValArglieSer390ThrGinSerGinArg470LysGin135CysThrGluPhePro215MetGluGluSerSer295GinValSerHisThr375ValLeuLysPhePhe455ThrTyr120AspMetGinLeuGly200LeuAlaGinProVal280SerGlyValLysAspAsnValCyslie185AlaAspAlaMetVal265AlaGluHisAspSer345GluVal360LeuSerLeuGluGluAspAspArgGlySer170ThrMetlieAspPhe250ProSerAlaAsnThr330AlaGluAlaAspThr410ProValValCys155AsnSerAsnCysPro235AlaAspSerGinAsn315ThrThrPheGluTrp395TyrGluAsn140AlaThrValPheGly220TyrArgAsplieLeu300GlyArgTyrAspVal380AsnArgGluLysAsnLeuAsn125ValProSerlieSerGlyGlyGlyMetAspProLeuGly160ValGinAsn175GinAspGly190AspLeuGinAla205ThrValCysLysGlyHisLeuAspArgLeu240PhePheAsn255LeuValLys270ValHisThrTyr285PheAsnLysProProThr425TrpGluVal440ProLeuGlyArgLys460SerAlaArgThrGly475lieSerThrLeu365MetPheTyrGluLys445PhelieCysTrpGly320ThrAsnMet335AsnSerAsp350GinPhelieAlaTyrlieGlyLeuSer400ValGinSer415LysGinAsp430GluLysPheLeuLeuGinLysArgPro480AlaValSerLysProSerThrAlaProLysArgLysArg485490LysLysThrLysThr495<210>8〈211>502<212〉PRT<213〉人工序列<400>8MetLeuProSerGlu15LysValValSerThr20HisAlaGlyThrSer35lieLysLysProAsn50LeuGinTyrArgVal65GlyPheProAspThr85TrpAlaCysValGly100GlylieSerGlyHis115AlaSerAlaTyrAla130SerMetAspTyrLys145ProlieGlyGluHis165ValAsnProGlyAsp180GinAspGlyAspMet195ThrUuGinAlaAsn210lieCysLysTyrPro225AspSerLeuPhePhe245LeuPheAsnArgAla260TyrlieLysGlySer275AlaAspArgAsnPhe70SerValProAlaGin150TrpCysValLysAsp230TyrThrGluLeuAsn55ArgPheGluLeuAsn135ThrGlyProAspSer215TyrLeuGlyAlaGlySerValTyrLeu40LyslieTyrValLeu120AlaGinLysProThr200GlulieArgValThr280TyrVal25AlalieHisAsnGly105AsnGlyLeuGlyLeu185GlyValLysArgLeu10AlaValLeuLeuPro90ArgLysValCys■Ser170GluPheProMetGlu250AspGly265AlaAsnProProArgThrGlyHisValPro60ProAsp75AspThrGlyGinLeuAspAspAsn140Leulie155ProCysLeulieGlyAlaLeuAsp220ValSer235GinMetAsnValValAsnPro45LysProGinProAsp125ArgGlyThrAsriMet205lieGluPheProLeuAlaSer285ProValSer15lieTyrTyr30TyrPheProValSerGlyAsnLysPhe80ArgLeuVal95UuGlyVbI110ThrGluAsnGluCyslieCysLysPro160AsnValAla175ThrVallie190AspPheThrCysThrSerProTyrGly240ValArgHis255AspAspLeu270SerAsnTyrPheAsn305CysThrLysLeuMet385PhePheProLysPhe465LysArgPro290LysTrpAsnAsnGin370ThrGlyValLysGlu450LeuArgLysThrProGlyMetThr355PheTyrLeuThrGlu435LysLeuLysLysProTyrAsnSer340AsnlielieGinSer420AspPheGinAlaArg500SerTrpGin325LeuPhePheHisPro405GinProSerAlaThr485GlyLeu310LeuCysLysGinSer390ProAlaLeuAlaGly470ProLeuSer295GinPheAlaGluLeu375MetProlieLysAsp455LeuThrMetArgValAlaTyr360CysAsnGlyAlaLys440LeuGluThrValAlaThrlie345LeuLysSerGlyCys425TyrAspAlaSerThrGinVal330SerArglieThrThr410GinThrGinLysSer490SerAspAlaGinliePhe300GlyHis315ValAspThrSerHisGlyThrLeu380lieLeu395LeuGluLysHisPheTrpPhePro460ProLys475ThrSerAsnAsnGlylie320ThrThrArgSer335GluThrThrTyr350GluGluTyrAsp365ThrAlaAsplieGluAspTrpAsn400AspThrTyrArg415ThrProProAla430GluValAsnLeu445LeuGlyArgLysPheThrLeuGly480ThrThrAlaLys495<210>9<211>504<212>PRT<213>人工序列<400>9MetArgProSerAspAsnThrValTyrLeuProProProSerValAla151015ArgValValAsnThrAspAspTyrValThrArgThrSerliePheTyr202530HisAlaGlySerSerArgLeuLeuThrValGlyAsnProTyrPheArg354045ValProAlaGlyGlyGlyAsnLysGinAsplieProLysValSerAla505560TyrGinTyrArgValPheArgValGinLeuProAspProAsnLysPhe65707580GlyLeuProAspThrSerlieTyrAsnProGluThrGinArgLeuVal859095TrpGlySerSer145AlaLeuGluThrlie225AspPheTyrSerAsn305CysThrTyrAspVal385AsnArgAlaLeuAlaLeuHis130VallieSerAspLeu210CysSerTrpliePro290LysTrpAsnAspLeu370MetPhePheGluLys450CysSer115AlaAspGlyGinGly195GinLysMetAsnLys275SerProHisLeuAla355GinSerGlyValAsn435GluAla100GlyAlaTyrGluGly180AspAspTyrPheArg260GlyProTyrAsnThr340ThrPheTyrValGin420LysLysGlyHisThrLysHis165AspMetThrProPhe245AlaThrSerTrpGin325lieLyslieliePro405SerAspPheValProSerGin150TrpCysValLysAsp230CysGlyGlyGlyLeu310LeuCysPhePheHis390ProValProSerGluPheAsn135ThrAlaProAspCys215TyrLeuThrMetSer295HisPheAlaLysGin375SerlieTyr120ValGinLysProThr200GluLeuArgMetArg280lieLysValSerGin360LeuMetProProAlalieTyrAsp440LeuAsp455Gly105AsnSerLeuGlyLeu185GlyValGinArgGly265AlaValAlaThrThr345TyrCysAsnThrAla425LysLeuArgLysGluCysThr170GluTyrProMetGlu250AspSerThrGinVal330GinSerThrSerThr410CysGlyGinLeuAspAspVal140lieLeu155AlaCysLeuLysGlyAlaLeuAsp220SerAla235GinLeuThrValProGlySerAsp300GlyHis315ValAspSerProArgHislieThr380Serlie395SerLeuProLeuGlyVal110ThrGluSerAsp125ArgAspAsnValGinLysLeuLysPheAspGinTyr460GlyLysAsnMet205lieAspPheProSer285SerAsnThrValVal365LeuLeuValAspTrp445ProCysAlaPro160SerArgPro175ThrValLeu190AspPheSerCysGinSerProTyrGly240AlaArgHis255GinSerLeu270CysValTyrGinLeuPheAsnGlyVal320ThrArgSer335ProGlyGin350GluGluTyrThrAlaAspGluAspTrp400AspThrTyr415AlaAlaPro430AsnValAspLeuGlyArgLysPheUuValGinAlaGlyLeuArgArgLysProThrlieGlyPro465470475480ArgLysArgSerAlaProSerAlaThrThrAlaSerLysProAlaLys485490495ArgValArgValArgAlaArgLys500<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>10catatgcctagcgacagcacagtata26<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>11gtcgacttaccttttagttttggcgc2權利要求1.N端截短了2個、3個、4個、或5個氨基酸的HPV6L1蛋白。2.權利要求l的蛋白，其具有序列1、2、3、或4，優選序列1。3.編碼權利要求l-2任一項的蛋白的多核苷酸。4.包含權利要求3的多核苷酸的載體。5.包含權利要求4的載體的細胞。6.包含權利要求1或2的蛋白的組合物。7.—種HPV6類病毒顆粒，其中該類病毒顆粒含有權利要求1或2的蛋白或者由權利要求1或2的蛋白形成。8.—種制備HPVLl蛋白例如權利要求l或2的蛋白的方法，其包括a)在大腸桿菌表達系統中表達編碼HPVL1的HPVLl基因，b)將表達了HPVLl蛋白的大腸桿菌在鹽濃度100mM-600fflM中破碎，分離得到上清液，c)用水或低鹽溶液將b)上清液中鹽濃度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀，d)將c)中沉淀在150mM-2500mM鹽溶液中重新溶解，同時加入還原劑，分離得到溶液，其中含純度至少50%的HPVLl蛋白。9.一種用于預防尖銳濕疣或HPV感染的疫苗，其包含(l)權利要求7的HPV6類病毒顆粒，(2)可有可無的至少一種(例如2、3、4種)選自11，16，18，31,33，45，52，和58型別的HPV類病毒顆粒(例如HPVLl類病毒顆粒)，及(3)疫苗用賦形劑或載體，優選地，所述疫苗含有HPV6類病毒顆粒和HPV11類病毒顆粒，特別是，含有具有SEQIDNO:4所示氨基酸序列的蛋白質的HPV6類病毒顆粒和含有具有SEQIDNO:7所示氨基酸序列的蛋白質的HPVll類病毒顆粒，更優選還含有HPV16類病毒顆粒和HPV18類病毒顆粒，特別是含有具有SEQIDN0:8所示氨基酸序列的蛋白質的HPV16類病毒顆粒和含有具有SEQIDNO:9所示氨基酸序列的蛋白質的HPV18類病毒顆粒.10.權利要求1-2任一項的蛋白或權利要求7的類病毒顆粒在制備用于預防尖銳濕疣或HPV感染的疫苗中的用途。11.一種預防尖銳濕疣或HPV感染的方法，其包括將含預防有效量的權利要求1-2任一項的HPV6LI蛋白或權利要求7的類病毒顆粒的疫苗或預防有效量的權利要求9的疫苗給予需要預防尖銳濕疣或HPV感染的人。12.獲得HPV6Ll蛋白類病毒顆粒的方法，其包括e)將純度至少50%的權利要求1或2的HPV6L1蛋白進一步通過色譜層析純化，f)將e)步驟中得到的HPV6Ll蛋白去除還原劑。13.制備用于預防尖銳濕疣或HPV感染疫苗的方法，其包括將權利要求7的類病毒顆粒與任選的一種或多種選自HPni，16，18，31，33，45，52，和58的HPV型別的類病毒顆粒及疫苗用栽體或者賦形劑混合。全文摘要本發明涉及一種截短的人乳頭瘤病毒6型L1蛋白，及由其組成的類病毒顆粒，含該類病毒顆粒的疫苗及其在預防尖銳濕疣或HPV感染中的用途。文檔編號C12N7/02GK101343315SQ200810111390公開日2009年1月14日申請日期2008年5月29日優先權日2007年5月29日發明者波劉,夏寧邵,軍張,李少偉,潘暉榕,季苗申請人:廈門大學;北京萬泰生物藥業股份有限公司