一種工業用大麻籽抗氧化肽的制備方法及應用的制作方法

文檔序號：565198閱讀：382來源：國知局

專利名稱：一種工業用大麻籽抗氧化肽的制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物活性肽的制備工藝，更具體地說，涉及的是一種工業用大麻籽抗氧化肽的制備方法及應用。
背景技術：
由于氧自由基可引起細胞損傷和死亡，皮膚衰老、色斑、皺紋及某些皮膚疾病的發生及食品的氧化酸敗有密切關系。隨著生活水平的提高，人們對營養攝入的要求越來越高。經植物蛋白制取的抗氧化肽因其安全性高、功能性好、價格低廉等優點，日益受到人們的關注，在食品和醫藥領域具有巨大的應用前景。
大麻具有悠久的種植歷史，是人們最早的作物之一。考古資料顯示，我國是最早馴化種植和加工大麻的地區，距今約5000-6000年。主要包括纖維型、藥用型和野生型三大類。大麻曾經是人類所必需的纖維和食品的重要來源，廣泛應用于制造繩索、帆布、服裝、紙張、食品和油料等用途，對航海、軍事、經濟的發展產生了巨大的影響。
大麻在我國不同地區有不同的稱謂，如線麻、火麻、寒麻、魁麻等。國際上將四氫大麻酚(THC)含量低于0.3%的品種稱為工業用大麻(Industrial Hemp)或漢麻，高于0.3%的稱為藥用或毒品大麻。工業用大麻，
工業用大麻籽是工業用大麻植物的果實，含有約25 35%的油脂，20 25%的蛋白質，20 30%的碳水化合物。其中工業用太麻籽蛋白質是一種完全蛋白質，含有人體所需的8種必需氨基酸，蛋白中約有65%是麻仁球蛋白，容易被人體消化吸收，營養價值較高，可以作為功能性蛋白質應用于保健食品、食品中。目前，工業用大麻籽蛋白類產品只限于粗制的蛋白粉(蛋白質含量50 60%)，含有雜質較多，利用價值不高。利用豐富的籽粕資源，制備具有生理活性的多肽，并開發生產出風味和功能性好的高附加值產品，這對于滿足人們對功能食品的需求、改善生活質量、預防疾病，具有顯著的經濟效益和社會效益。
目前，蛋白肽的生產大多采用水解蛋白的方法，如堿水解法，但這種方法收率低，成本高，無法實現工業化生產。國際上肽含量在95%以上的大豆蛋白肽，售價為12000元/噸(人民幣)，而到目前為止，尚未見有工業用大麻籽蛋白肽產品。
專利號為ZL200410006119.6,名稱為"大米蛋白肽的制備方法及其用途"的專利中公開了一種大米蛋白肽的制備方法，該蛋白肽利用工業大米渣為原料，通過雙酶法一步水解制得大米蛋白肽的方法。所述的大米蛋白肽，它具有大米蛋白的優點，即易被人體吸收、能提高人體的免疫功能、抗疲勞、有利于兒童的生長發育，尤其是能促進兒童的智力發育，與其他的蛋白相比，營養價值高、不含膽固醇、有利于人體的心腦血管健康，安全性好。
申請號為200610000996.1，名稱為"一種源自膠原蛋白的抗氧化肽混合物及其制備方法和用途，其通過將膠原蛋白水解而獲得的水解產物，該混合物的制備包括使用蛋白酶對膠原蛋白進行一次或連續幾次的水解，得到含有多種抗氧化肽形成的肽的混合物的前制品；然后進行沉淀或過濾，得到除去脂肪和大分子蛋白、多肽和雜質等的水解液；最后對此水解液進行分離純化和濃縮，得到該申請的源自膠原蛋
白的抗氧化肽混合物。
申請號為200610066895.4，名稱為"源自膠原蛋白的抗氧化肽及其用途"，所述的抗氧化肽其具有如下之一的氨基酸序列(l)Hyl-Cys; (2) Gln-Gly-Ala-Arg; (3) Leu-Gln-Gly-Met; (4) Leu-Gln-Gly-Met-Hyp。該抗氧化肽可以通過多肽儀化學方法合成，也可以通過將膠原蛋白水解，然后將獲得的水解產物分離純化而得。所述的抗氧化肽的抗氧化作用很強，不僅可以替代BHT等用作食品的添加劑，而且可以作為活性功能性成分。
綜上所述，上述兩篇專利申請公開的抗氧化肽都是從膠原蛋白中提取獲得的，而這些膠原蛋白從豬、牛、雞、魚、火雞等動物中提取，因此原料有限，所述的提取方法很復雜。而現有技術并沒有公開以植物蛋白粉為原料提取抗氧化肽的方法，因此，研究人員以此為出發點，進行研究，得到本發明。

發明內容
本發明的目的在于提供一種工業用大麻籽蛋白抗氧化肽的制備方法，該方法以一種來源豐富、價格低廉的工業大麻籽粕為原料，提供一種條件溫和、操作簡單的
工藝流程，且所制備的蛋白肽抗氧化活性較強、純度較高。
為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種工業用大麻籽蛋白抗氧化肽的制備方法，所述的方法包括 (1)以工業用大麻籽為原料，制備工業用大麻籽蛋白；(2) 在工業用大麻籽蛋白中加入蛋白酶進行酶解，得到工業用大麻籽抗氧化多肽酶解液；
(3) 將步驟(2)所得的抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附樹脂進行脫鹽，將洗脫液濃縮和冷凍干燥后得到所述的工業用大麻籽抗氧化多肽。
本發明所述的步驟(3)包括
將步驟(2)所得的工業用大麻籽抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附樹脂進行靜態脫鹽，在150 300r/min轉速下，加入工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，攪拌后，加去離子水，洗至電導率小于15ps/crn，再加體積百分比為70%~85%乙醇溶液洗脫，洗脫液旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥；優選攪拌的時間為3-8小時。
本發明所述的步驟(2)包括
稱取工業用大麻籽蛋白，加入去離子水攪拌均勻，在80 卯'C的條件下進行預處理，然后降溫，用NaOH溶液調pH至8.0 9.5，按酶和底物重量比為0.5~3%加入蛋白酶，控制反應體系的pH值8.0~9.5，反應l-3h后，在85 100'C滅酶，再用HC1 溶液調節pH至6.8~7.2，最后經冷凍離心，取上清液進行濃縮，得到的溶液即為工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液。
本發明所述的步驟(2)包括
按底物濃度50mg/mL，稱取工業用大麻籽蛋白于酶反應器中，加入去離子水攪拌均勻，80 卯。C預處理10~20 min，再降溫至50°C,用0.5-1.5mol/L NaOH調pH至 8.0~9.5，按酶和底物重量比為0.5~3%加入蛋白酶，控制反應體系的pH值8.0-9.5，反應結束后，85 100。C滅酶5 10 min，用0.5-1.5 mol/L HC1調節pH至6.8~7.2， 7000~10000r/min冷凍離心10-20min，上清液濃縮，得到的溶液即為工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液。
本發明所述步驟(1)中的蛋白酶包括Alcalase2.4L堿性蛋白酶、2709堿性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。
本發明所述的步驟(3)包括將步驟(2)所得的工業用大麻籽抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附樹脂進行動態脫鹽，采用的柱子條件2.6X30 cm;上樣流速 l~2ml/min;水洗流速l~2ml/min;乙醇洗脫流速0.5~1 ml/min;上樣量200-300 mg， 70%~85%乙醇洗脫，洗脫液旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥。
本發明所述步驟(3)中的大孔吸附樹脂為DA201-C型樹脂。
本發明所述工業用大麻籽蛋白的制備方法包括
1)將工業用大麻籽篩選除去雜質后進行分級，然后機械礱碾脫殼；脫殼后的得到的麻仁在43°C， 34Mpa的條件下萃取2小時，將油脂分離后的萃取產物進行粉碎，然后相同條件下再萃取2小時，C02超臨界萃取后得到低溫蛋白粕；
2) 將低溫蛋白粕進行粉碎，用60-100目篩過篩之后，在蛋白粕中加入8-ll倍的40 5(TC水，攪拌混合均勻，再用堿液調節pH值至8 10，保溫攪拌20min，過濾去除不溶性雜質，獲得蛋白溶液粗品；
3) 用稀鹽酸溶液調節蛋白溶液粗品的pH值至4.5 5，沉淀之后，進行離心分離；離心分離后取沉淀，再用pH值為4. 5 5的水洗滌3 4次，繼續進行離心分離，取沉淀；在沉淀經均質后，用pH值為8 10的氫氧化鈉溶液調節沉淀pH值至6 7，得到所述的濃縮蛋白溶液；
4) 將上述濃縮蛋白溶液經過115-130'C高溫瞬時滅菌，滅菌的時間為2-4s，之
后進行噴霧干燥，得到工業用大麻籽分離蛋白。
本發明所述工業用大麻籽分離蛋白中蛋白純度>92%，總氨基酸含量》85%。
本發明所述工業用大麻籽蛋白抗氧化肽在制備營養強化劑、保健品、動物食品、飲料和食品中的抗氧化劑或添加劑、化妝品或護膚品的應用。
本發明的技術方案本發明涉及一種工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解物的制備及其色譜分離純化的方法，具體涉及以工業用大麻籽為原料，先制備工業用大麻籽蛋白，然后采用蛋白酶水解工業用大麻籽蛋白，采用DA201-C大孔吸附樹脂進行脫鹽，以DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除率為指標，檢測抗氧化肽的活性，其具體的制備方法包括
(1) :按底物濃度50mg/mL，稱取工業用大麻籽蛋白粉于酶反應器中，加入去離子水攪拌均勻，80 9(TC預處理10 20min，迅速降溫至50。C，用1.0 mol/LNaOH調 pH至8.0~9.5，按酶和底物重量比([E]/[S])為0.5~3.0%加入蛋白酶，采用pH-stat 法控制反應體系的pH為8.0-9.5值，反應l-3h后，85 100'C滅酶5 10 min，添加 1.0 mol/L HC1溶液調節pH至6.8~7.2， 7000-10000 r/min冷凍離心10~20 min，上清液濃縮，得到的溶液即為工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷凍干燥制備工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解物粉劑。
本發明所述的工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解物粉劑中粗蛋白含量>88%，粗灰分含量>6.5%，水分>7%。
(2) 將步驟(1)所得的工業用大麻籽抗氧化酶解物進行脫鹽。
目前生物活性物質的脫鹽方法主要有透析、超濾和納濾等，但是這些方法對小分子物質脫鹽效果不佳或無法實現，盡管電滲析可以用于小分子物質的脫鹽，但是回收率不高、能源消耗大。吸附色譜法是最有可能對小分子有機物質進行脫鹽的方法，它是根據溶質在吸附劑表面上的吸附強度不同而對溶質進行分離。其中大孔吸附樹脂對多肽具有選擇性吸附，用乙醇等有機溶劑洗脫也較為方便。
大孔吸附樹脂是非離子型高分子多孔性吸附劑，是由苯乙烯、二乙烯苯或甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子網狀孔穴結構，在干燥狀態下其內部具有較高的孔隙率，在整個顆粒內部及外部都具有表面活性，它對化合物的吸附作用主要是基于化合物的疏水基團與非極性吸附劑之間的范德華引力，這樣就可以對不同極性的化合物進行分離，同時也可通過本身的多孔網狀孔穴結構對分子大小不同的化合物加以篩選。由于樹脂與被分離成分之間的吸附為物理吸附，被吸附的物質較易洗脫，并具有成本低、效率高、穩定性好和容易再生等特點，因此大孔吸附樹脂分離技術現己大量用于環保、化工、醫藥和食品行業。本發明通過多種大孔吸附樹脂的性能比較，采用DA201-C大孔吸附樹脂對進行工業用大麻籽抗氧化多肽酶解物進行脫鹽。
靜態脫鹽方法將步驟(l)所得的工業用大麻籽蛋白抗氧化酶解液，采用DA201-C 大孔樹脂靜態脫鹽。在150 300r/min轉速下，加入工業用大麻籽蛋白抗氧化肽，攪拌3 8小時后，加去離子水，洗至電導率小于15網/cm，加70%~85%乙醇洗脫。靜態脫鹽，樹脂吸附量250 360mg/g干樹脂，脫鹽率為85%~90%。
或采用大孔吸附樹脂進行動態脫鹽
本發明上樣200 300mg，用去離子水，洗至電導率小于15^is/cm,加70%~85%乙醇洗脫。采用的柱尺寸2.6X30 cm;上樣流速1~2 ml/min;去離子水洗流速1~2 ml/min; 70%~85%乙醇洗脫流速0.5-1 ml/min。動態吸附樹脂吸附量20 35 mg/g干樹脂，脫鹽率為90%~97%。
動態吸附具有脫鹽徹底，洗脫液用量少和回收率高的優點，適于工業化生產使用。對同一濃度的上樣溶液，若吸附流速過大，被吸附物質來不及擴散到樹脂的內表面就提早泄露而造成樣品流失，樹脂的吸附量就會下降；但吸附流速過小，吸附時間就會延長。確定最佳的吸附流速通常應綜合考慮樹脂的吸附效果和工作效率。解吸流速一般都比吸附流速慢一倍以上。
(3)將步驟(2)所得體積百分比為70%~85%乙醇洗脫液，在45 60。C的條件下進行旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥所述的冷凍干燥利用LABCONco.6L Freeze Dry System進行，其真空度〈0.12mPa;冷阱溫度-45°C;凍干溫度第一階段，-30°C lh;第二階段，-8°C 24h;第三階段，-4°C 8h;第四階段，25°C 3h。旋轉蒸發所得乙醇可回收利用。(4)測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH (1， l一二苯基苦
基苯肼)自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，這些都是常規的檢測方法。具體步驟如下
①DPPH自由基清除能力的測定將酶解產物配成一定濃度的溶液，另配制濃度為lxl0—4 mol/LDPPH無水乙醇溶液，避光保存。取2mL試樣與2mLDPPH無水乙醇溶液混合，并劇烈振蕩，在室溫下反應30min，然后在517nm處測定吸光值Ai。空白組以等體積無水乙醇溶液代替DPPH溶液，對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液。DPPH自由基的清除率用下式計算
DPPH自由基清除率(％)
l一-
x100
爿o .
式中AO —對照組吸光度；Ai —樣品組吸光度；Aj —空白組吸光度。 ②超氧陰離子自由基清除能力的測定
恒溫25 。C下，取50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液3 mL(其中含1 mmol/L 的EDTA) ， 50mmol/L鄰苯三酚10pL，迅速混勻，置于lcm石英比色皿中，在 325 nm處每隔30s測定吸光度一次，反應4.5min結束，以吸光度對時間作圖，求得斜率即為鄰苯三酚自氧化速率為A0。在3 mL pH 8.2 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液中加適量酶解產物，用上述方法測樣品325 nm處的鄰苯三酚自氧化速率As。清除率按下式計算
l氣IOO
超氧陰離子自由基清除率(％) =
③羥基自由基清除能力的測定取0.1mL的FeS04-EDTA混合液(10mmol/mL)于試管中，加入0.3mL2-脫氧核糖(10mmol/mL)，然后加入0.2mL—定濃度的酶解產物，用pH 7.4的0.1mol/L 磷酸緩沖液定容至1.9mL，再加入0.1mLH202 (10mmol/mL)，混勻后置于37 °C 恒溫水浴中反應1 h。之后加入1 mL2.8% (w/w)三氯乙酸(TCA)溶液和lmL 1.0% (w/w)硫代巴比妥酸(TBA)溶液，混勻，沸水浴中反應15min，冷卻后在532nm 處測定吸光度值。
不加入清除劑時的吸光度為Ac，加入樣品后若有清除。H作用，則能抑制氧化產物的生成，其吸光度減少，測得吸光度為As，實際空白吸光以Ao表示，則清除能力下式計算羥基自由基清除率(％)=
1-
xlOO
Uo」
ICso表示自由基清除率為50%時的樣品濃度。 (5)測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸組成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。
脫鹽酶解產物的氨基酸組成
氨基酸簡稱脫鹽后氨基酸含量 (g細g)氨基酸簡稱脫鹽后氨基酸含量 (g/腦g)
天冬氨酸Asp10.05蛋氨酸Met2.14
谷氨酸Glu17.65苯丙氨酸Phe4.12
絲氨酸Ser4.36異亮氨酸He3.69
組氨酸His2.79亮氨酸Leu7.05
甘氨酸Gly3.1賴氨酸Lys2.37
蘇氨酸Thr2.29脯氨酸Pro4.56
精氨酸Arg10,08色氨酸Trp
丙氨酸Ala3.19疏水性氨基酸34.47
酪氨酸Tyr4.08必需氨基酸23.17
半胱氨酸Cys-s2.31總氨基酸87.83
纈氨酸Val5.64
氨基酸組成測定方法HPLC法，具體步驟為將60mg至100mg工業用大麻籽抗氧化多肽置于水解管中，加入6 mol/L的HCl溶液，真空封口，在ll(TC下水解 24 h，冷卻后定容、過濾、蒸干，再加入0.02 mol/L的HCl溶液，在空氣中放置30 min, 采用AgilentllOO液相色譜儀測定氨基酸的含量。
(6)測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在350~2000Da。
相對分子質量分布的測定方法采用高效液相排阻色譜(high performance size exclusion chromatography, HPSEC)法。
儀器Waters 600高效液相色譜儀(配2487紫外檢測器(波長220 nm)和M 32 工作站)；
色譜柱TSKgel 2000 SWXL 300 nmX7. 8 mm
流動相體積比乙醇水氯乙酸=45: 54: 1;
10檢測波長220 nm; 流量0. 5 mL/min;
柱溫30 °C;
樣品制備吸取樣品2 mL于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋到刻度，用微孔過濾膜過濾后進樣。
(7)測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的水解度為15%~20%。蛋白質水解度(DH)是指在蛋白質水解反應過程中被裂解的肽鍵占蛋白質總肽鍵的百分數。
在堿性或中性條件下水解時，DH的測定采用pH-Stat法
蛋白質在水解時總是伴隨著質子的釋放與吸收，這個反應發生在中性和微堿性介質中，如果反應時pH在氨基和羧基的pK值范圍之外，而反應體系要維持pH恒定，則必須隨時加入一定量的酸或堿。pH—定時，加堿物質的量與水解肽鏈物質的量成正比關系，比例常數即為NH4+的解離常數d 。記錄不同時刻為維持反應體系pH恒定而消耗的堿液的毫升數，消耗的堿的量即為表征蛋白質水解的程度。這種方法的優點
是不變性。由于它的簡單、快速和可重復性，通常被用于水解度的在線測定。
1
nt7 "八水解肽鍵數碰D a,1 1
式中B_
IV
總肽鍵數 fl a &
堿液體積/L; -堿液的濃度/mo1 L—'; -氨基的解離度，可査表得；
.xlOO
-底物中蛋白質總量/g;
-底物中蛋白質肽鍵總數/mol g—'蛋白質(ht^8. 0)。
Mp-
ht。t
本發明所述的工業用大麻籽蛋白的制備方法包括
1、將工業用大麻籽篩選除去雜質后進行分級，然后機械礱碾脫殼；脫殼后的得到的麻仁在43°C， 34Mpa的條件下萃取2小時，將油脂分離后的萃取產物進行粉碎，然后相同條件下再萃取2小時，C02超臨界萃取后得到低溫蛋白粕。
以上步驟涉及的是工業用大麻籽C02超臨界萃取提取油脂的方法。經過篩選分級之后，選出質量優良的工業用大麻籽，然后進行機械礱碾脫殼，為之后的提取油脂作好充分的準備。工業用大麻籽中蛋白質含量為25 35%，油脂含量為25 35%。由于蛋白質在高溫條件下容易變性，因此本發明采用C02超臨界萃取方法提取油脂，工藝過程溫度低，效率高，得到的蛋白粕中油脂含量<2%。2、將低溫蛋白粕進行粉碎，用60-100目篩過篩之后，在蛋白粕中加入8-ll倍的40 50。C水，攪拌混合均勻，再用堿液調節pH值至8 10，保溫攪拌20min，過濾去除不溶性雜質，獲得蛋白溶液粗品；
經過上述步驟(1)處理過的低溫蛋白粕中殘油率很低，將所述低溫蛋白粕用粉碎機進行粉碎，目的是為了使液料(包括水和堿液)與物料充分混合，增大接觸面積，使蛋白粕中的蛋白質提取比較完全。過篩是為了讓物料顆粒保持一致，同時將蛋白粕中粗大的部分篩選出來，避免對后續濃縮蛋白溶液的制備造成影響。
該步驟中所述的堿液為氫氧化鈉溶液、亞硫酸鈉溶液和亞硫酸氫鈉溶液中的一種，所述堿液的質量百分比濃度為20-30°/。，選擇上述濃度的堿液既可以避免加入堿液時局部堿性強pH值過高而導致蛋白變性，同時也能兼顧具體的調節pH值的時間，
提高蛋白粉的生產效率。
3、用稀鹽酸溶液調節蛋白溶液粗品的pH值至4.5 5，沉淀之后，進行離心分離；離心分離后取沉淀，再用PH值為4. 5 5的水洗滌3 4次，繼續進行離心分離，取沉淀；在沉淀經均質后，用pH值為8 10的氫氧化鈉溶液調節沉淀pH值至6 7，得到所述的濃縮蛋白溶液。
該步驟中所述的稀鹽酸溶液為濃度為2mol/L的鹽酸溶液，離心分離轉速為 3000 4000r/min，離心時間為10 20min。經過這一步驟處理之后，濃縮蛋白液中的蛋白的質量百分比濃度為70-75%。該步驟能最大程度的將蛋白質沉淀下來，從而提高產品的蛋白濃度。
本發明所述的均質是指經管道解碎器(用于解碎大顆粒不易分散的物料)粉碎后加7-10倍水進行溶解，然后在20-25MPa的壓力下均質。在用稀鹽酸溶液調節蛋白溶液的pH值至4.5 5，沉淀之后，進行離心分離；離心分離后取沉淀，再用pH值為4.5 5的水洗滌3 4次，繼續進行離心分離，這樣更能去除蛋白溶液中雜質，進而提高蛋白溶液的濃度。本發明中用pH值為4.5 5的水洗滌沉淀，脫除鹽分，洗滌次數為3 4次，而現有技術中一般提取蛋白質的方法中一般選用清水進行洗滌，本發明這樣處理的目的在于保持酸性環境，令已經沉淀的蛋白不重新溶解，用一般清水因為清水的pH在6.5左右，容易導致蛋白重新溶解，降低得率。
4、將上述濃縮蛋白溶液經過115-13(TC高溫瞬時滅菌，滅菌的時間為2-4s，之
后進行噴霧千燥，得到工業用大麻籽分離蛋白粉。所述工業用大麻籽分離蛋白粉中
蛋白純度>92%，總氨基酸含量》85%。
本發明所述的高溫瞬時滅菌，既不會使蛋白質變性，同時能對蛋白溶液進行殺菌，由于上述工業用大麻籽分離蛋白粉中含有人體所需的八種氨基酸，所述蛋白粉應用于食品、保健品行業中，所以這一步的進行顯得非常重要。最后，將高溫瞬時滅菌后的濃縮蛋白溶液采用噴霧干燥法進行干燥，得到工業用大麻籽分離蛋白粉。
本發明通過上述制備方法制備得到的工業用大麻籽分離蛋白粉中蛋白質純度^ 92%;水分《8%;灰分《6%;脂肪《0.5%，細度(過80 120目篩)》98%;菌落總數《30000cfu/g;大腸桿菌《30MPN/100g， NSI (氮溶解指數)》30%。上述分離蛋白粉，按照制作保健功能食品的技術工藝需要適量添加，制成系列保健食品，也可以作為蛋白添加劑，應用于制作冰淇淋、飲料、糕點、麥片等食品領域中。
本發明的有益效果本發明提供的工業用大麻籽蛋白抗氧化肽產品，是一種來自天然蛋白的酶解物，清除自由基能力很強，適用于運動飲料、營養強化劑、嬰幼兒食品、味精等調味品添加劑、面包蛋糕等抗氧化劑；可作為抗氧化劑添加至化妝品、護膚品、日常護理用品；可直接食用或作為動物詞料；可應用于醫藥領域等。
本發明所提供的工業用大麻籽蛋白抗氧化肽的制備方法，其制備流程簡單，實用性強，采用有效的分離純化途徑得到純度較高的工業用大麻籽抗氧化活性多肽，具有較好的應用前景。本發明對于促進工業用大麻產品的深加工及綜合利用，研究和開發功能性食品配料，解決三農問題都具有重要的意義。

圖l工業用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布
具體實施例方式
實施例1-5涉及工業用大麻籽蛋白粉的制備
實施例1
將工業用大麻籽篩選除去雜質后進行分級，然后機械礱碾脫殼；脫殼后得到的麻仁進行二氧化碳超臨界萃取，在43'C， 34MPa條件下萃取2小時，提取油脂后將萃取產物粉碎，在上述條件下再萃取2小時，提取油脂之后得到工業用大麻籽低溫蛋白粕。所述工業用大麻籽低溫蛋白粕中，殘油率1.5%。將得到的低溫蛋白粕利用粉碎機進行粉碎，過60目篩，取過篩之后的蛋白粕10kg，加入100kg5(TC的溫水，攪拌均勻，用質量百分比濃度為30%的NaOH溶液調節pH值至9.5，保溫攪拌15 分鐘，真空抽濾除去不溶性雜質，獲得蛋白溶液粗品。將上述蛋白溶液粗品用2mol/L 的稀鹽酸調節pH值至4.5，待沉淀之后，離心分離取沉淀，再用pH值為4.5的水洗滌4次，離心分離取沉淀，所述離心分離時轉速為4000r/min，離心時間為15分鐘。將沉淀采用管道破碎機進行破碎后在52'C下，25MPa的壓力下均質，再用pH值為8 的NaOH溶液調節沉淀pH值至6.5，得到濃縮蛋白液，將濃縮蛋白液經過115'C高溫瞬時滅菌，滅菌時間為2s，再進行噴霧干燥法進行干燥后得到工業用大麻籽分離蛋白粉。
樣品經檢測，蛋白質含量為94.0%，總氨基酸含量為93.2%，水分2.8%，脂肪 0.25%，灰分2.95%;細度(過80 120目篩)98%;菌落總數15000cfu/g;大腸桿菌20MPN/100g， NSI (氮溶解指數)32.91%。
實施例2
將工業用大麻籽篩選除去雜質后進行分級，然后機械礱碾脫殼；脫殼后得到的麻仁進行二氧化碳超臨界萃取，在43。C， 34MPa條件下萃取2小時，提取油脂后將萃取產物粉碎，在上述條件下再萃取2小時，提取油脂之后得到工業用大麻籽低溫蛋白粕。所述工業用大麻籽低溫蛋白粕中，殘油率1.2%。將得到的低溫蛋白粕利用粉碎機進行粉碎，過80目篩，取過篩之后的蛋白粕10kg，加入80kg45'C的溫水，攪拌均勻，用質量百分比濃度為25%的亞硫酸鈉溶液調節pH值至8，保溫攪拌25 分鐘，真空抽濾除去不溶性雜質，獲得蛋白溶液粗品。將上述蛋白溶液粗品用2mol/L 的稀鹽酸調節pH值至4.8，待沉淀之后，離心分離取沉淀，再用pH值為4.8的水洗滌3次，離心分離取沉淀，所述離心分離時轉速為3000r/min，離心時間為20分鐘。將沉淀采用管道破碎機進行破碎后在55"C下，22MPa的壓力下均質，再用pH值為9 的NaOH溶液調節沉淀pH值至6.5，得到濃縮蛋白液，將濃縮蛋白液經過115'C高溫瞬時滅菌，滅菌時間為2S，再進行噴霧干燥后得到工業用大麻籽分離蛋白粉。
樣品經檢測，蛋白質含量為90.8%，總氨基酸含量為90.1%， 7夂分5.8%，脂肪 0.35%,灰分3.05%;細度(過80 120目篩)98%;菌落總數15000cfu/g;大腸桿菌20MPN/100g， NSI (氮溶解指數)34.28%。
實施例3
將工業用大麻籽篩選除去雜質后進行分級，然后機械礱碾脫殼；脫殼后得到的麻仁進行二氧化碳超臨界萃取，在43'C， 34MPa條件下萃取2小時，提取油脂后將萃取產物粉碎，在上述條件下再萃取2小時，提取油脂之后得到工業用大麻籽低溫蛋白粕。所述工業用大麻籽低溫蛋白粕中，殘油率1.8%。將得到的低溫蛋白粕利用粉碎機進行粉碎，過100目篩，取過篩之后的蛋白粕10kg，加入110kg48。C的溫水，攪拌均勻，用質量百分比濃度為28。/。的NaOH溶液調節pH值至10，保溫攪拌，真空抽濾除去不溶性雜質，獲得蛋白溶液粗品。將上述蛋白溶液粗品用2mol/L的稀鹽酸調節pH值至4.9，待沉淀之后，離心分離取沉淀，再用pH值為4.9的水洗滌4次，離心分離取沉淀，所述離心分離時轉速為3500r/min，離心時間為20分鐘。將沉淀采用管道破碎機進行破碎后在55'C下，22MPa的壓力下均質，用pH值為10的NaOH 溶液調節沉淀pH值至7，得到濃縮蛋白液，將濃縮蛋白液經過125'C高溫瞬時滅菌，滅菌時間為4s，再進行噴霧干燥后得到工業用大麻籽分離蛋白粉。
樣品經檢測，蛋白質含量為92.5%，總氨基酸含量為93.2%， ZK分4.6X，脂肪 0.5%,灰分2.4%;細度(過80 120目篩)98%;菌落總數15000cfu/g;大腸桿菌 20MPN/100g， NSI (氮溶解指數)35.04%。
實施例4
將工業用大麻籽篩選除去雜質后進行分級，然后機械礱碾脫殼；脫殼后得到的麻仁進行二氧化碳超臨界萃取，在43。C， 34MPa條件下萃取2小時，提取油脂后將萃取產物粉碎，在上述條件下再萃取2小時，提取油脂之后得到工業用大麻籽低溫蛋白粕。所述工業用大麻籽低溫蛋白粕中，殘油率1.2%。將得到的低溫蛋白粕利用粉碎機進行粉碎，過100目篩，取過篩之后的蛋白粕10kg，加入90kg50。C的溫水，攪拌均勻，用質量百分比濃度為30。/。的亞硫酸氫鈉溶液調節pH值至9.5，保溫攪拌，真空抽濾除去不溶性雜質，獲得蛋白溶液粗品。將上述蛋白溶液粗品用2mol/L的稀鹽酸調節pH值至5.0，待沉淀之后，離心分離取沉淀，再用pH值為5.0的水洗滌4 次，離心分離取沉淀。將沉淀采用管道破碎機進行破碎后在55'C下，22MPa的壓力下均質，用pH值為8的NaOH溶液調節沉淀pH值至6.5，得到濃縮蛋白液，將濃縮蛋白液經過115。C高溫瞬時滅菌，滅菌時間為2S，再進行噴霧干燥后得到工業用大麻籽分離蛋白粉。
樣品經檢測，蛋白質含量為93.0%，總氨基酸含量為92.4%， 7夂分3.5%，脂肪 0.4%，灰分3.1%;細度(過80 120目篩)98%;菌落總數15000cfu/g;大腸桿菌 8MPN/100g， NSI (氮溶解指數)34.67%。
實施例5
將工業用大麻籽篩選除去雜質后進行分級，然后機械礱碾脫殼；脫殼后得到的麻仁進行二氧化碳超臨界萃取，在43'C， 34MPa條件下萃取2小時，提取油脂后將萃取產物粉碎，在上述條件下再萃取2小時，提取油脂之后得到工業用大麻籽低溫蛋白粕。所述工業用大麻籽低溫蛋白粕中，殘油率1.6%。將得到的低溫蛋白粕利用粉碎機進行粉碎，過60目篩，取過篩之后的蛋白粕10kg，加入100kg5(TC的溫水，攪拌均勻，用質量百分比濃度為30。/。的NaOH溶液調節pH值至9.5，保溫攪拌，真空抽濾除去不溶性雜質，獲得蛋白溶液粗品。將上述蛋白溶液粗品用2mol/L的稀鹽酸調節pH值至4.5，待沉淀之后，離心分離取沉淀，再用pH值為4.5的水洗滌4次，離心分離取沉淀。將沉淀采用管道破碎機進行破碎后在55'C下，22MPa的壓力下均質，用pH值為8的NaOH溶液調節沉淀pH值至6.5，得到濃縮蛋白液，將濃縮蛋白液經過12(TC高溫瞬時滅菌，滅菌時間為3s，再進行噴霧干燥后得到工業用大麻籽分離蛋白粉。
樣品經檢測，蛋白質含量為93.5%，總氨基酸含量為92%,水分2.3%，脂肪0.3 %，灰分3.9%;細度(過80 120目篩)99%;菌落總數10000cfWg;大腸桿菌 15MPN/100g， NSI (氮溶解指數)31.85%。
實施例6-10涉及工業用大麻籽抗氧化多肽的制備
實施例6
(1) :按底物濃度50 mg/mL，稱取工業用大麻籽蛋白粉100g于酶反應器中，加入2L去離子水進行攪拌均勻，80。C預處理20min，迅速降溫至50。C，用1.0mol/L NaOH調pH至9.5，按酶和底物重量比([E]/[S])為3.0%加入蛋白酶，釆用pH-stat 法控制反應體系的pH為8.0值，反應結束后，在100'C滅酶5min，添加1.0 mol/L HC1 調pH至7.2，在7000r/min冷凍離心20min，上清液濃縮，得到的溶液即為工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷凍干燥制備酶解物粉劑。
(2) :將步驟(l)所得的工業用大麻籽抗氧化多肽酶解物靜態脫鹽方法將步驟(l)
所得的工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，采用DA201-C大孔樹脂靜態脫鹽。在 150r/min轉速下，加入工業用大麻籽蛋白抗氧化肽，攪拌3小時后，加去離子水，洗至電導率小于15ps/cm，加70%乙醇洗脫。靜態脫鹽，樹脂吸附量260mg/g干樹脂，脫鹽率為85.75%。
(別每步驟(2)所得70%乙醇洗脫液，在45'C的條件下將所述乙醇洗脫液進行旋轉蒸發濃縮，再進行冷凍干燥，冷凍干燥LABCONco.6L Freeze Dry System真空度<
160.12mPa;冷阱溫度-45°C;凍干溫度第一階段，-30°C lh;第二階段，-8°C 24h; 第三階段，-4°C 8h;第四階段，25°C 3h，得到所述的抗氧化肽36克。旋轉蒸發所得乙醇可回收再利用。
(4)測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH (1， l一二苯基苦基苯肼)自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，其ICso分別為2.75 mg/ml， 3.05 mg/ml， 7.70 mg/ml;測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸組成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在350 2000Da。測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的水解度為17%。
實施例7
(1) :按底物濃度45mg/mL，稱取工業用大麻籽蛋白粉90克于酶反應器中，加入 2 L去離子水進行攪拌均勻90。C預處理10 min，迅速降溫至50°C ，用1.0 mol/L NaOH 調pH至9.5，按酶和底物重量比([E]/[S])為0.5%加入蛋白酶，采用pH-stat法控制反應體系的pH為9.0值，反應結束后，在85'C滅酶10 min，添加1.5mol/L HC1調 pH至6.8，在10000 r/min冷凍離心10 min，將得到的上清液濃縮，得到的溶液即為工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷凍干燥制備酶解物粉劑。
(2) :將步驟(l)所得的工業用大麻籽抗氧化多肽酶解液進行動態脫鹽所得的工
業用大麻籽蛋白抗氧化酶解物，采用DA201-C大孔樹脂動態脫鹽，上樣300mg，用去離子水，洗至電導率小于15tis/cm，加85%乙醇洗脫。采用的柱尺寸2.6X30 cm; 上樣流速lml/min;去離子水洗流速lml/min; 75%乙醇洗脫流速0.5 ml/min。動態吸附樹脂吸附量35 mg/g干樹脂，脫鹽率為97%。
(3) 將步驟(2)所得75%乙醇洗脫液，在60'C的條件下將所述乙醇洗脫液進行旋轉蒸發濃縮，再進行冷凍干燥，冷凍干燥LABCONco.6L Freeze Dry System真空度< 0.12mPa;冷阱溫度-45°C;凍干溫度第一階段，-30°C lh;第二階段，-8°C 24h; 第三階段，-4°C 8h;第四階段，25°C 3h，得到所述的抗氧化肽55克。旋轉蒸發所得乙醇可回收利用。
(4) 測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH (1， l一二苯基苦基苯肼)自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，其ICso分別為2.95 mg/ml， 3.25 mg/ml， 7.82 mg/ml;測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸組成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸，其含量分別為10.05g/100g、 17.65g/100g和10.08g/100g。測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在 350~2000Da。測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的水解度為18%。
實施例8
(1) :按底物濃度55mg/mL，稱取工業用大麻籽蛋白粉110克于酶反應器中，加入2 L去離子水進行攪拌均勻90。C預處理10 min，迅速降溫至50'C，用1.0 mol/L NaOH調pH至9.5，按酶和底物重量比([E]/[S])為1.5%加入蛋白酶，采用pH-stat 法控制反應體系的pH為9.5值，反應結束后，在95'C滅酶8 min，添加l.Omol/L HC1 溶液調節pH至7.0，在9000r/min冷凍離心12min，將得到的上清液濃縮，得到的溶液即為工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷凍干燥制備酶解物粉劑。
(2) :將步驟(l)所得的工業用大麻籽抗氧化多肽酶解液進行動態脫鹽所得的工業用大麻籽蛋白抗氧化酶解液，采用DA201-C大孔樹脂動態脫鹽，上樣200mg，用去離子水，洗至電導率與水接近，加70%~85%乙醇洗脫。采用的柱尺寸2.6X30 cm; 上樣流速L5ml/min;去離子水洗流速L5ml/min; 80%乙醇洗脫流速:1 ml/min。動態吸附樹脂吸附量20 mg/g干樹脂，脫鹽率為90%。
(3) :將步驟(2)所得80%乙醇洗脫液，在55'C的條件下將所述乙醇洗脫液進行旋轉蒸發濃縮，再進行冷凍干燥，冷凍干燥LABCONco.6L Freeze Dry System真空度 <0.12mPa;冷阱溫度-45°C;凍干溫度第一階段，-30°C lh;第二階段，-8°C 24h; 第三階段，-4°C 8h;第四階段，25°C 3h,得到所述的抗氧化肽55 65克。旋轉蒸發所得乙醇可回收利用。
(4) 測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH (1， l一二苯基苦基苯肼)自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，其ICso分別為2.85 mg/ml， 3.36 mg/ml， 7.33 mg/ml;測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸組成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸，其含量分別為10.34g/100g、 17.88g/100g和 10.36g/100g。測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在 350 2000Da。測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的水解度為15%。
實施例9
(1):按底物濃度48mg/mL，稱取工業用大麻籽蛋白粉96克于酶反應器中，加入 2 L去離子水進行攪拌均勻90'C預處理10 min，迅速降溫至50°C ，用1.2 mol/L NaOH 調pH至9.5，按酶和底物重量比([E]/[S])為2.5%加入蛋白酶，采用pH-stat法控制反應體系的pH為8.5值，反應結束后，在95。C滅酶10 min，添加L2mol/L HC1調 pH至7.1，在8500 r/min冷凍離心15min，將得到的上清液濃縮，得到的溶液即為工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷凍干燥制備酶解物粉劑。
(2) :將步驟(l)所得的工業用大麻籽抗氧化多肽酶解液進行動態脫鹽所得的工
業用大麻籽蛋白抗氧化酶解物，采用DA201-C大孔樹脂動態脫鹽，上樣250mg,用去離子水，洗至電導率與水接近，加70%~85%乙醇洗脫。采用的柱尺寸2.6X30 cm; 上樣流速l~2ml/min;去離子水洗流速l~2ml/min; 70%~85%乙醇洗脫流速0.5~1 ml/min。動態吸附樹脂吸附量20-35 mg/g干樹脂，脫鹽率為90%~97%。
(3) 將步驟(2)所得70%~85%乙醇洗脫液，在50。C的條件下將所述乙醇洗脫液進行旋轉蒸發濃縮，再進行冷凍干燥，，冷凍干燥LABCONco.6L Freeze Dry System真空度〈0.12mPa;冷阱溫度-45°C;凍干溫度第一階段，-30°C lh;第二階段，-8 °C 24h;第三階段，-4°C 8h;第四階段，25°C 3h。旋轉蒸發所得乙醇可回收利用。
(4) 測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH (1， l一二苯基苦基苯肼)自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，其lC5o約為2.75mg/ml， 3.05mg/ml， 7.70 mg/ml;測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸組成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸，其含量分別為10.05g/100g、 17.65g/100g和 10.08g/100g。測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在 350~2000Da。測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的水解度為20%。
實施例10
(1) :按底物濃度50mg/mL，稱取工業用大麻籽蛋白粉100克于酶反應器中，加入2L去離子水進行攪拌均勻，88。C預處理12 min，迅速降溫至50'C，用1.2 mol/L NaOH調pH至8.5，按酶和底物重量比([E]/[S])為2.0%加入蛋白酶，采用pH-stat 法控制反應體系的pH為8.3值，反應結束后，在10(TC滅酶5min，添加L2mol/LHCl 調pH至7.2，在8500r/min冷凍離心18min，上清液濃縮，得到的溶液即為工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，也可冷凍干燥制備酶解物粉劑。
(2) :將步驟(l)所得的工業用大麻籽抗氧化多肽酶解物靜態脫鹽方法將步驟(l) 所得的工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，采用DA201-C大孔樹脂靜態脫鹽。在 300r/min轉速下，加入工業用大麻籽蛋白抗氧化肽，攪拌8小時后，加去離子水，洗至電導率小于15ns/cm，加85%乙醇洗脫。靜態脫鹽，樹脂吸附量60mg/g干樹脂，脫鹽率為卯％。(3) 將步驟(2)所得85%乙醇洗脫液，在45'C的條件下將所述乙醇洗脫液進行旋轉蒸發濃縮，再進行冷凍干燥，冷凍干燥LABCONco.6L Freeze Dry System真空度< 0.12mPa;冷阱溫度-45°C;凍干溫度第一階段，-30°C lh;第二階段，-8°C 24h; 第三階段，-4°C 8h;第四階段，25°C 3h,得到所述的抗氧化肽60克。旋轉蒸發所得乙醇可回收利用。
(4) 測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化肽混合物清除DPPH (1， l一二苯基苦基苯肼)自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力，其IC50分別為2.80 mg/ml， 3.43mg/ml， 7.50 mg/ml;測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的氨基酸組成，表明其富含天冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的分子量分布，主要在350 2000Da。測定步驟(3)所得工業用大麻籽抗氧化多肽的水解度為17%。
權利要求
1、一種工業用大麻籽抗氧化肽的制備方法，其特征在于，所述的方法包括(1)以工業用大麻籽為原料，制備工業用大麻籽蛋白；(2)在工業用大麻籽蛋白中加入蛋白酶進行酶解，得到工業用大麻籽抗氧化多肽酶解液；(3)將步驟(2)所得的抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附樹脂進行脫鹽，將洗脫液濃縮和冷凍干燥后得到所述的工業用大麻籽抗氧化多肽。
2、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟(3)包括將步驟 (2)所得的工業用大麻籽抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附樹脂進行靜態脫鹽，在150 300r/min轉速下，加入工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液，攪拌后，加去離子水，洗至電導率小于15ps/cm，再加體積百分比為70%~85%乙醇溶液洗脫，洗脫液旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥；優選攪拌的時間為3-8小時。
3、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟(2)包括稱取工業用大麻籽蛋白，加入去離子水攪拌均勻，在80 9(TC的條件下進行預處理，然后降溫，用NaOH溶液調pH至8.0 9.5，按酶和底物重量比為0.5~3%加入蛋白酶，控制反應體系的pH值8.0-9.5，反應l-3h后，在85 100。C滅酶，再用HC1 溶液調節pH至6.8~7.2，最后經冷凍離心，取上清液進行濃縮，得到的溶液即為工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液。
4、根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟(2)包括按底物濃度45-55 mg/mL ，優選所述濃度為50 mg/mL，稱取工業用大麻籽蛋白于酶反應器中，加入去離子水攪拌均勻，80 9(TC預處理10-20 min，再降溫至50。C，用0.5-1.5mol/L NaOH溶液調pH至8.0~9.5，按酶和底物重量比為0.5~3%加入蛋白酶，控制反應體系的pH值8.0 9.5，反應結束后，85 10(TC滅酶5 10min，用0.5-1.5 mol/LHCl調節pH至6.8 7.2， 7000~10000 r/min冷凍離心10 20min，上清液濃縮，得到的溶液即為工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解液。
5、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中的蛋白酶包括 Alcalase2.4L堿性蛋白酶、2709堿性蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。
6、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟(3)包括將步驟 (2)所得的工業用大麻籽抗氧化多肽酶解液，采用大孔吸附樹脂進行動態脫鹽，采用的柱子條件2.6X30 cm;上樣流速l~2ml/min;水洗流速l~2ml/min;乙醇洗脫流速0.5~lml/min;上樣量200~300mg， 70%~85%乙醇洗脫，洗脫液旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥后即得所述的工業用大麻籽抗氧化多肽；所述的樹脂優選為 DA201-C型樹脂。
7、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的步驟(3)包括將步驟 (l)所得的工業用大麻籽蛋白抗氧化酶解物，采用大孔樹脂靜態脫鹽，在150~300r/min 轉速下，加入工業用大麻籽蛋白抗氧化肽，攪拌3~8小時后，加去離子水，洗至電導率小于15ps/cm，力B 70%~85%乙醇洗脫，洗脫液旋轉蒸發濃縮，冷凍干燥后即得所述的工業用大麻籽抗氧化肽；所述的樹脂優選為DA201-C型樹脂。
8、根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述工業用大麻籽蛋白的制備方法包括1) 將工業用大麻籽篩選除去雜質后進行分級，然后機械礱碾脫殼；脫殼后的得到的麻仁在43°C， 34Mpa的條件下萃取2小時，將油脂分離后的萃取產物進行粉碎，然后相同條件下再萃取2小時，C02超臨界萃取后得到低溫蛋白粕；2) 將低溫蛋白粕進行粉碎，用60-100目篩過篩之后，在蛋白粕中加入8-ll倍的40 5(TC水，攪拌混合均勻，再用堿液調節pH值至8 10，保溫攪拌20min，過濾去除不溶性雜質，獲得蛋白溶液粗品；3) 用稀鹽酸溶液調節蛋白溶液粗品的pH值至4.5 5，沉淀之后，進行離心分離；離心分離后取沉淀，再用pH值為4. 5 5的水洗滌3 4次，繼續進行離心分離，取沉淀；在沉淀經均質后，用pH值為8 10的氫氧化鈉溶液調節沉淀pH值至6 7，得到所述的濃縮蛋白溶液；4) 將上述濃縮蛋白溶液經過115-130'C高溫瞬時滅菌，滅菌的時間為2-4s，之后進行噴霧干燥，得到工業用大麻籽分離蛋白。
9、根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述工業用大麻籽分離蛋白中蛋白純度》92%，總氨基酸含量》85%。
10、根據權利要求1所述工業用大麻籽抗氧化肽在制備營養強化劑、保健品、動物食品、飲料和食品中的抗氧化劑或添加劑、化妝品或護膚品的應用。
全文摘要
本發明涉及一種工業用大麻籽抗氧化肽的制備方法和用途。本發明利用低溫榨油后所得的工業用大麻籽粕和廉價易得的酶制劑，通過酶法水解，制備得到工業用大麻籽蛋白抗氧化肽酶解物，水解度為15％～20％，分子量分布為350-2000Da。將上述酶解物經大孔吸附靜態或動態脫鹽，真空濃縮，冷凍干燥，得到工業用大麻籽蛋白抗氧化肽。所得產品具有廣泛的清除自由基能力。本發明的優點是原料來源簡單，工藝流程簡便；營養價值高，極易為人體吸收；清除自由基能力強，能抗疲勞，提高人體免疫力。因此，本發明產品具有很廣闊的應用前景，可用作營養強化劑、保健品、飲料和化妝品的添加劑、食品中的抗氧化劑及醫藥領域。
文檔編號A23J3/14GK101589761SQ20081011076
公開日2009年12月2日申請日期2008年5月29日優先權日2008年5月29日
發明者何錦風, 盧蓉蓉, 周徐慧, 華張, 張建春, 平錢, 陳天鵬申請人:中國人民解放軍總后勤部軍需裝備研究所;江南大學

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