專利名稱：：一種生產腸二醇和腸內酯的方法
技術領域：
：本發明涉及一種生產腸二醇和腸內酯的方法。
背景技術：
：腸二醇(Enterodiol，END)和腸內酉旨(Enterolactone，ENL)具有雌激素和抗雌激素樣生物活性，可防治乳腺癌和前列腺癌，為國際公認的植物雌激素，已被美國國立癌癥研究所確定為潛在的抗癌物質。目前獲得腸二醇和腸內酯的主要途徑為化學合成方法，但化學合成法成本較高，且對環境造成污染。人體腸道菌群在嚴格厭氧條件下可將裂環異裂葉松脂酚二葡萄糖苷(Secoisolariciresinoldiglucoside，SDG)、裂環異裂葉松月旨酚(Secoisolariciresinol，SEC0)、羅漢松脂素(Matairesinol，MATA)、丁香脂素(Syringaresinol，SYRI)、松脂素(Pinoresinol，PIN0)或松脂酚二葡萄糖苷(Pinoresino1diglucoside，PDG)等底物轉化為腸二醇和腸內酯，由于受到苛刻厭氧條件和底物來源的限制，目前還無法利用此方法大規模生產腸二醇和腸內酯。
發明內容本發明的目的是提供一種生產腸二醇和/或腸內酯的方法。本發明提供的生產腸二醇和/或腸內酯的方法，是以下述十種原料中的至少一種為底物，用腸道細菌進行厭氧培養，得到腸二醇和/或腸內酯；所述十種原料為亞麻子粕(Flaxseed;Semenlini)、海藻(Seaweed)、芝麻子禾白(Sesameseed)、油菜桿禾白(Rapeseed)、黑麥麩(Ryebran)、小麥麩(Wheatbran)、大麥麩(Barleybran)、玉米麩(Cornbran)、燕麥麩(Oatbran)和牛蒡子粕(Fructusarctii)。所述厭氧培養的條件可為氧分壓3.03975-10.1325kPa，25-4(TC厭氧培養3-15天。所述腸道細菌可來自用哺乳動物糞便或腸液制備的菌液。所述哺乳動物具體可為人、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠或兔。所述菌液可將糞便或腸液用水、磷酸緩沖液或0.9%生理鹽水進行懸浮得到。在厭氧培養前先可將所述菌液進行增菌，增菌條件可為25-4(TC厭氧培養10-36小時。所述菌液可為傳代培養后的菌液，第l-50代菌液均可使用。所述方法中，所述底物加入厭氧培養基或按照如下方法配制的培養基中每升pH6.5-pH7.5的磷酸緩沖液中加入1.5-6gNaCl、0.5-6gNH4C1、0.1-2.0gL-半胱氨酸鹽酸鹽或硫代乙醇酸鈉；優選按照如下方法配制每升PH7.5的磷酸緩沖液中加入3gNaCl、1gNH4C1、0.3gL-半胱氨酸鹽酸鹽或硫代乙醇酸鈉。所述底物的加入量可為每升培養基中加入卜60g底物。厭氧培養3-8天后，用大孔樹脂色譜柱進行分離純化，采用乙醇水溶液進行梯度洗脫，從5%乙醇水溶液開始，遞增洗脫液中乙醇濃度，收集含有腸二醇的洗脫液，減壓濃縮干燥，得到腸二醇；所述大孔樹脂優選XAD-2大孔樹脂或D101大孔樹脂。厭氧培養4-15天后，用大孔樹脂色譜柱進行分離純化，采用乙醇水溶液進行梯度洗脫，從5%乙醇水溶液開始，遞增洗脫液中乙醇濃度，收集含有腸內酯的洗脫液，減壓濃縮干燥，得到腸內酯；所述大孔樹脂優選XAD-2大孔樹脂或D101大孔樹脂。本發明提供的生產腸二醇和/或腸內酯的方法，是以亞麻子粕、海藻、芝麻子粕、油菜籽粕、黑麥麩、小麥麩、大麥麩、玉米麩、燕麥麩和牛蒡子粕十種原料中的至少一種為底物，用腸道細菌進行厭氧培養，得到腸二醇和/或腸內酯。本發明利用價格低廉的植物資源和哺乳動物腸道菌群，采用生物技術直接轉化腸二醇和腸內酯，培養液經簡單的純化工藝即可使提取物中腸二醇和腸內酯的含量大于50%(70.15%-91.12%)。本發明提供的方法簡單、生產成本很低、無環境污染，非常適宜于工業化生產，具有重要的科學價值、社會及經濟效益。以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。圖1為亞麻子粕經人體樣本1的菌液厭氧培養第3天培養液的HPLC圖。圖2為亞麻子粕經人體樣本1的菌液厭氧培養第7天培養液的HPLC圖。圖3為亞麻子粕經人體樣本1-24的菌液厭氧培養第3天培養液中腸二醇的HPLC峰面積變化曲線。圖4為亞麻子粕經人體樣本1-24的菌液厭氧培養第7天培養液中腸內酯的HPLC峰面積變化曲線。圖5為亞麻子粕經人體樣本1的第50代菌厭氧培養6天的培養液再經XAD-2樹脂洗脫的洗脫物的HPLC圖。圖6為圖5中腸二醇色譜峰的UV光譜圖。圖7為亞麻子粕經人體樣本1的第50代菌厭氧培養10天的培養液再經D101樹脂洗脫的洗脫物的HPLC圖。圖8為圖7中腸內酯色譜峰的UV光譜圖。具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。以下實施例中所用的樣本來源情況見表1。表124份人體樣本的性別和年齡性別年齡編號性別年齡女23樣本13男23女23樣本14男26女27樣本15男25女25樣本16男25女24樣本17男30女30樣本18男32女37樣本19男35女50樣本20男55女35樣本21男60女45樣本22男40女55樣本23男45女40樣本24男29實施例1、不同人體個體來源的腸道菌對亞麻子粕的生物轉化1、厭氧培養基厭氧培養基(CM605，購自北京路橋技術有限責任公司)，其成分如下牛肉浸液(1000mL);蛋白胨(30g);酵母膏(5g);磷酸二氫鈉(5g);葡萄糖(3g);可溶性淀粉(2g)。按試劑說明配制，碎肉渣5-30g/升，121。C高壓滅菌15min。2、生物轉化1)取24個健康人(見表l)的新鮮糞便，分別加入到磷酸緩沖液(pH7.4)中，得到24種終濃度為4g糞便/20mL磷酸緩沖液的菌液。2)分別按1:10的比例將步驟1得到的24種菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.03975kPa)36小時，進行增菌。3)分別在上述24種增菌后的菌液中加入亞麻子粕(即脫脂后的亞麻子，加入量為4mg/4mL培養液)，37'C厭氧培養(氧分壓為3.03975kPa)8天，得到24種培養液。3、樣品分析培養過程中，每天都分別對24種培養液進行檢測，方法如下吸取0.2ml培養液，加入0.5ml水飽和正丁醇萃取，取正丁醇層，氮氣吹干后0.2ml甲醇溶解，微孔濾膜過濾，吸取20ial濾液進行HPLC分析。HPLC儀器為Agilent1200HPLC儀(AgilentTechnologies,USA),包括二元高壓梯度泵、二極管陣列檢測器、自動進樣器、柱溫箱和工作站軟件。色譜柱為AgilentZorbaxSB—C18(4.6mmX250mm，5pm);流動相為水/乙腈(100:0-50:50);線性梯度洗脫(0—30號123456789o2本本本本本本本本本本本本樣樣樣樣樣樣樣樣樣樣樣樣min);流速為l.OmL/min;檢測波長為280nm;柱溫為25。C。圖1為亞麻子粕經人體樣本1的菌液厭氧培養第3天培養液的HPLC圖。圖2為亞麻子粕經人體樣本1的菌液厭氧培養第7天培養液的HPLC圖。其它人體樣本培養液的HPLC圖與樣本l基本相同。圖3為亞麻子粕經人體樣本1-24的菌液厭氧培養第3天培養液中腸二醇的HPLC峰面積變化曲線。圖4為亞麻子粕經人體樣本1-24的菌液厭氧培養第7天培養液中腸內酯的HPLC峰面積變化曲線。由圖可見，24份培養液中均能先后檢測到腸二醇和腸內酯，不同性別和年齡的人體樣本來源的菌液轉化產生腸二醇和腸內酯的能力沒有明顯區別。實施例2、來自人體腸道菌液對亞麻子粕的轉化1、配制培養基1)厭氧培養基GAM肉湯培養基(NissuiCo.，Tokyo,Japan)，其成分如下大豆胨3克；口胨10克；消化血清粉13.5克；酵母浸膏5克；牛肉膏2.2克；牛肝膏(粉)1.2克；葡萄糖3克；KH2P042.5克；可溶性淀粉5克；L-半胱氨酸鹽0.3克；硫乙醇酸鈉0.3克；肉湯(牛心湯)1000毫升。按試劑說明配制。調PH7.2-7.4，10磅高壓滅菌15分。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH7.5)中加入3gNaCl、1.0gNH4C1、0.3gL-半胱氨酸鹽酸鹽；用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15tnin。2、生物轉化1)制備樣本9的菌液(終濃度為4g糞便/20ml磷酸緩沖液)，制備方法同實施例1的步驟2的1)，得到樣本9的菌液。2)按1:10的比例將樣本9的菌液接種至厭氧培養基，25'C厭氧培養(氧分壓為7.03975kPa)10小時，進行增菌。3)按1:10的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.24g/4mL)，25。C厭氧培養(氧分壓為7.03975kPa)7天，得到樣本9的培養液。3、樣品分析同實施例1的步驟3。不同時間培養液中腸二醇和腸內酯的HPLC峰面積見表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表2可見該培養體系對亞麻子粕的轉化效果較好。培養4天的培養液中腸二醇的HPLC峰面積最大，培養6天的培養液中腸內酯的HPLC峰面積最大。實施例3、人體腸道菌種的傳代次數對生物轉化效果的影響1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例l的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH7.0)中加入1.5gNaCl、0.5gNH4C1、0.1g硫代乙醇酸鈉；用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15min。2、菌種傳代1)制備人體樣本9的菌液(終濃度為4g糞便/20ml磷酸緩沖液)，制備方法同實施例1的步驟2的1)，得到樣本9的菌液。2)按l:10的比例將樣本9的菌液接種至厭氧培養基，4(TC厭氧培養(氧分壓為7.03975kPa)24小時，進行增菌。3)按l:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻籽粉(80mg/4mL)，40'C厭氧培養(氧分壓為9.03975kPa)6天，得到樣本9的培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本9的1代至50代培養液(傳代培養液)。3、樣品分析同實施例1的步驟3。監測1-50代傳代培養液在培養過程中腸二醇和腸內酯的HPLC峰面積動態變化。可以發現，在l-50代傳代培養液中均能先后檢測到腸二醇和腸內酯，不同代傳代培養液轉化產生腸二醇和腸內酯的能力沒有明顯區別(見表3)。表3不同時間點的第1代和第50代培養液中腸二醇和腸內酯的HPLC峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例4、來自人體腸道菌液對不同底物的轉化作用1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例1的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH7.5)中加入3gNaCl、1.0gNH4C1、0.3gL-半胱氨酸鹽酸鹽；用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15min。2、生物轉化1)制備樣本9的菌液(終濃度為4g糞便/20ml磷酸緩沖液)，制備方法同實施例1的步驟2的1)，得到樣本9的菌液。2)按1:10的比例將樣本9的菌液接種至厭氧培養基，25'C厭氧培養(氧分壓為7.03975kPa)IO小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，分別加入下列底物:海藻、芝麻子粕、油菜籽粕、黑麥麩、小麥麩、大麥麩、玉米麩、燕麥麩和牛蒡子(0.24g/4mL)，25。C厭氧培養(氧分壓為7.03975kPa)10天。3、樣品分析同實施例1的步驟3。第3天培養液和第10天培養液中腸二醇和腸內酯的HPLC峰面積見表4。表4不同時間點不同底物培養液中腸二醇和腸內酯的HPLC峰面積<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>底物腸二醇腸內酯腸二醇腸內酯海藻2005106—1975芝麻子粕199387一1863黑麥麩186483—1790油菜籽粕190095—1832小麥麩162179—1549大麥麩157971一1406玉米麩148770一1308燕麥麩150374—1421牛蒡子193591—1829由表4可見人體腸道菌對不同底物均有類似于亞麻子粕的轉化作用。培養3天的培養液中產物以腸二醇為主，培養io天的培養液中產物以腸內酯為主。實施例5、不同動物來源的腸道菌對亞麻子粕的生物轉化1、配制厭氧培養基同實施例2的步驟1。2、生物轉化1)取小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠和家兔的新鮮糞便及新鮮腸液。糞便分別加入到磷酸緩沖液(pH7.4)中，得到24種終濃度為4g糞便/20mL磷酸緩沖液的菌液。腸液分別用10倍量的磷酸緩沖液(pH7.4)稀釋得到菌液。共得到10種供試菌液。2)分別按1:10的比例將步驟1得到的IO種菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.03975kPa)36小時，進行增菌。3)分別在上述10種增菌后的菌液中加入亞麻子粕(4mg/4mL培養液)，37。C厭氧培養(氧分壓為3.03975kPa)15天。3、樣品分析同實施例1的步驟3。表5為亞麻子粕經上述10種菌液厭氧培養第4天和第15天培養液中腸二醇的HPLC峰面積變化。由表5可見，上述10份菌液中均能轉化亞麻子粕而產生腸二醇和腸內酯。表5不同時間點不同菌液的培養液中腸二醇和腸內酯的HPLC峰面積第4天第15天菌種腸二醇腸內酯腸二醇腸內酯小鼠的新鮮糞便1215__1186大鼠的新鮮糞便1341_—1245倉鼠的新鮮糞便1103一—982豚鼠的新鮮糞便1200_—1097家兔的新鮮糞便912_—816小鼠的新鮮腸液1342一一1153大鼠的新鮮腸液1561—一1300倉鼠的新鮮腸液1301_一1231豚鼠的新鮮腸液1430一—1299家兔的新鮮腸液943—一810實施例6、利用人體腸道菌制備腸二醇一、腸二醇標準曲線的建立精確稱取腸二醇標準品(購自Sigma公司)1.98mg定容于l.Oml容量瓶中。分別進樣O.1-30pL，HPLC測定其峰面積，以腸二醇進樣量(嗎)為橫坐標(X)，腸二醇峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，得腸二醇的標準曲線為Y=391.99X+298.16，R2=0.9984，線性范圍為0.20pg-59.40嗎。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例2的步驟1。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15rain。2、生物轉化1)制備樣本1-13的菌液(終濃度為4g糞便/20mL磷酸緩沖液)，制備方法同實施例1的步驟2的1)，得到13種菌液。2)按1:10的比例將13種菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:10的比例將增菌后的13種菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4raL)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天，得到13種培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本1-13的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸二醇的制備l)按l:10的比例分別將13種菌液的第50代培養液接種至厭氧培養基，37。C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:10的比例將增菌后的13種菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)8天。4、樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表6。5、腸二醇的提取與純化用95%乙醇調節培養液中乙醇的濃度至30%，過濾得濾液。濾液經XAD-2大孔樹脂柱分離，用5%-50%乙醇(乙醇濃度梯度按5%比例遞增)洗脫。將洗脫液進行HPLC分析，方法同實施例1的步驟3。腸二醇主要存在于30%-50%乙醇洗脫液中(見圖5和圖6)。將30%-50%乙醇洗脫液蒸干，得到的物質的量即為洗脫物的量，通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表6。表6人體腸道菌培養液中腸二醇產率、洗脫物量和洗脫物中腸二醇含量<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表6可見，培養液洗脫物中腸二醇的含量范圍為74.87%-91.12%。實施例7、利用人體腸道菌制備腸內酯一、腸內酯標準曲線的建立精確稱取腸內酯標準品(購自Sigma公司)2.01mg定容于1.0ml容量瓶中。分別進樣0.1-30^L,HPLC測定其峰面積，以腸內酯進樣量(|_ig)為橫坐標(X)，腸內酯峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，得腸內酯的標準曲線為Y=395.39X+156.15,R2=0.9976，線性范圍為0.20叫-60.30|_ig。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸內酯1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例l的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH7.0)中加入4gNaCl、0.5gNHX1、0.5g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15min。2、生物轉化2、生物轉化1)制備樣本1-13的菌液(終濃度為4g糞便/20mL磷酸緩沖液)，制備方法同實施例1的步驟2的1)，得到13種菌液。2)按1:10的比例將13種菌液接種至厭氧培養基，37。C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:10的比例將增菌后的13種菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.24g/4mL)，37"C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)8天，得到13種培養液(原代培養液)。4)每8天進行一次傳代(重復步驟2)和3)),共傳代50次，得到樣本1-13的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸內酯的制備1)按l:10的比例分別將13種菌液的第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。2)按1:10的比例將增菌后的13種菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(150g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)15天。4、樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物亞麻子粕的量，得到腸內酯的產率，見表7。5、腸內酯提取與純化用95%乙醇調節培養液中乙醇的濃度至30%，過濾得濾液。濾液經D101大孔樹脂柱分離，用5%-50%乙醇(乙醇濃度梯度按5%比例遞增)洗脫。將洗脫液進行HPLC分析，方法同實施例1的步驟3。腸內酯主要存在于20%-40%乙醇洗脫液中(見圖7和圖8)。將20%_40%乙醇洗脫液蒸干，得到的物質的量即為洗脫物的量，通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表7。表7人體腸道菌培養液中腸內酯產率、洗脫物量和洗脫物中腸內酯含量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表7可見，洗脫物中腸內酯的含量范圍為69.83%-85.37%。實施例8、利用小鼠糞便制備的菌液生產腸二醇和腸內酯一、標準曲線的建立1、腸二醇標準曲線的建立同實施例6的步驟一。2、腸內酯標準曲線的建立同實施例7的步驟一。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇和腸內酯1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例2的步驟1。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，121。C高壓滅菌15min。2、菌液傳代1)制備小鼠糞便的菌液(終濃度為4g糞便/20ml磷酸緩沖液)。2)按1:IO的比例將菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4mL)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天，得到培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸二醇的制備和分析1)腸二醇的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表8。3)腸二醇的提取與純化方法同實施例6的步驟5。通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表8。4、腸內酯的制備和分析1)腸內酯的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(150g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)15天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物的量，得到腸內酯的產率，見表9。3)腸內酯提取與純化方法同實施例7的步驟5。通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表9。實施例9、利用小鼠腸液制備的菌液生產腸二醇和腸內酯一、標準曲線的建立1、腸二醇標準曲線的建立同實施例6的步驟一。2、腸內酯標準曲線的建立同實施例7的步驟一。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例1的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15min。2、菌液制備及傳代1)在厭氧環境條件下處死小鼠，取出腸液，用IO倍量磷酸緩沖液稀釋得到菌液。2)按1:IO的比例將菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4mL)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天，得到培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸二醇的制備和分析1)腸二醇的制備①按h10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37X:厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)3天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表8。3)腸二醇的提取與純化方法同實施例6的步驟5。通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表8。4、腸內酯的制備和分析1)腸內酯的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37"C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(150g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)5天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物的量，得到腸內酯的產率，見表9。3)腸內酯提取與純化方法同實施例7的步驟5。通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表9。實施例10、利用大鼠糞便制備的菌液生產腸二醇和腸內酯一、標準曲線的建立1、腸二醇標準曲線的建立同實施例6的步驟一。2、腸內酯標準曲線的建立同實施例7的步驟一。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例l的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，121'C高壓滅菌15min。2、菌液傳代1)制備大鼠糞便的菌液(終濃度為4g糞便/20ml磷酸緩沖液)。2)按1:10的比例將菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4mL)，37'C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天，得到培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸二醇的制備和分析1)腸二醇的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)3天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表8。3)腸二醇的提取與純化方法同實施例6的步驟5。通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表8。4、腸內酯的制備和分析1)腸內酯的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按hIO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(150g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)15天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物的量，得到腸內酯的產率，見表9。3)腸內酯提取與純化方法同實施例7的步驟5。通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表9。實施例ll、利用大鼠腸液制備的菌液生產腸二醇和腸內酯一、標準曲線的建立1、腸二醇標準曲線的建立同實施例6的步驟一。2、腸內酯標準曲線的建立同實施例7的步驟一。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例l的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，121。C高壓滅菌15min。2、菌液制備及傳代1)在厭氧環境條件下處死大鼠，取出腸液，用9倍量磷酸緩沖液稀釋得到菌液。2)按1:10的比例將菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4mL)，37'C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天，得到培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸二醇的制備和分析1)腸二醇的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)8天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表8。3)腸二醇的提取與純化方法同實施例6的步驟5。通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表8。4、腸內酯的制備和分析1)腸內酯的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕C150g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)15天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物的量，得到腸內酯的產率，見表9。3)腸內酯提取與純化方法同實施例7的步驟5。通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表9。實施例12、利用倉鼠糞便制備的菌液生產腸二醇和腸內酯一、標準曲線的建立1、腸二醇標準曲線的建立同實施例6的步驟一。2、腸內酯標準曲線的建立同實施例7的步驟一。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例l的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15min。2、菌液傳代1)制備倉鼠糞便的菌液(終濃度為5g糞便/20ml磷酸緩沖液)。2)按1:IO的比例將菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4mL)，37'C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天，得到培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸二醇的制備和分析1)腸二醇的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37。C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表8。3)腸二醇的提取與純化方法同實施例6的步驟5。通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表8。4、腸內酯的制備和分析1)腸內酯的制備①按h10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(150g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)15天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物的量，得到腸內酯的產率，見表9。3)腸內酯提取與純化方法同實施例7的步驟5。通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表9。實施例13、利用倉鼠腸液制備的菌液生產腸二醇和腸內酯一、標準曲線的建立1、腸二醇標準曲線的建立同實施例6的步驟一。2、腸內酯標準曲線的建立同實施例7的步驟一。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例l的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，121。C高壓滅菌15min。2、菌液制備及傳代1)在厭氧環境條件下處死倉鼠，取出腸液，用2倍量磷酸緩沖液稀釋得到菌液。2)按1:IO的比例將菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4mL)，37'C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天，得到培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸二醇的制備和分析1)腸二醇的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37"C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表8。3)腸二醇的提取與純化方法同實施例6的步驟5。通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表8。4、腸內酯的制備和分析1)腸內酯的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(150g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)12天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物的量，得到腸內酯的產率，見表9。3)腸內酯提取與純化方法同實施例7的步驟5。通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表9。實施例14、利用豚鼠糞便制備的菌液生產腸二醇和腸內酯一、標準曲線的建立1、腸二醇標準曲線的建立同實施例6的步驟一。2、腸內酯標準曲線的建立同實施例7的步驟一。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例l的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15min。2、菌液傳代1)制備豚鼠糞便的菌液(終濃度為1.5g糞便/20ml磷酸緩沖液)。2)按1:IO的比例將菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4mL)，37'C厭氧培養(氧分壓為10,1325kPa)6天，得到培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸二醇的制備和分析1)腸二醇的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37"C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37t:厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)5天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表8。3)腸二醇的提取與純化方法同實施例6的步驟5。通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表8。4、腸內酯的制備和分析1)腸內酯的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(150g/2.5L)，37"C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)8天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物的量，得到腸內酯的產率，見表9。3)腸內酯提取與純化方法同實施例7的步驟5。通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表9。實施例15、利用豚鼠腸液制備的菌液生產腸二醇和腸內酯一、標準曲線的建立1、腸二醇標準曲線的建立同實施例6的步驟一。2、腸內酯標準曲線的建立同實施例7的步驟1。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例1的步驟一。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15min。2、菌液制備及傳代1)在厭氧環境條件下處死豚鼠，取出腸液，用8倍量磷酸緩沖液稀釋得到菌液。2)按1:IO的比例將菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4raL)，37'C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天，得到培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸二醇的制備和分析1)腸二醇的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表8。3)腸二醇的提取與純化方法同實施例6的步驟5。通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表8。4、腸內酯的制備和分析1)腸內酯的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(150g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)13天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物的量，得到腸內酯的產率，見表9。3)腸內酯提取與純化方法同實施例7的步驟5。通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表9。實施例16、利用家兔糞便制備的菌液生產腸二醇和腸內酯一、標準曲線的建立1、腸二醇標準曲線的建立同實施例6的步驟一。2、腸內酯標準曲線的建立同實施例7的步驟一。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例l的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15min。2、菌液傳代1)制備家兔糞便的菌液(終濃度為3g糞便/20ml磷酸緩沖液)。2)按1:IO的比例將菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4mL)，37'C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天，得到培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本的第50代培養液(傳代培養液)。i3、腸二醇的制備和分析1)腸二醇的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表8。3)腸二醇的提取與純化方法同實施例6的步驟5。通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表8。4、腸內酯的制備和分析1)腸內酯的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(150g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)15天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物的量，得到腸內酯的產率，見表9。3)腸內酯提取與純化方法同實施例7的步驟5。通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表9。實施例17、利用家兔腸液制備的菌液生產腸二醇和腸內酯一、標準曲線的建立1、腸二醇標準曲線的建立同實施例6的步驟一。2、腸內酯標準曲線的建立同實施例7的步驟一。二、以亞麻子粕為底物轉化生產腸二醇和腸內酯1、配制培養基1)配制厭氧培養基同實施例1的步驟l。2)配制無碳源培養基按照如下方法配制每升磷酸緩沖液(pH6.5)中加入6gNaCl、6gNH4C1、2.0g硫代乙醇酸鈉。用石蠟油覆蓋，12rC高壓滅菌15min。2、菌液制備及傳代1)在厭氧環境條件下處死家兔，取出腸液，用5倍量磷酸緩沖液稀釋得到菌液。2)按1:IO的比例將菌液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。3)按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(0.12g/4mL)，37'C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)6天，得到培養液(原代培養液)。4)每6天進行一次傳代(重復步驟2)和3))，共傳代50次，得到樣本的第50代培養液(傳代培養液)。3、腸二醇的制備和分析1)腸二醇的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(75g/2.5L)，37'C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)4天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線計算出培養液中腸二醇的含量，用腸二醇的產量除以底物的量，得到腸二醇的產率，見表8。3)腸二醇的提取與純化方法同實施例6的步驟5。通過HPLC分析對照標準曲線計算出洗脫物中腸二醇的量。洗脫物的量和洗脫物中腸二醇的含量見表8。4、腸內酯的制備和分析1)腸內酯的制備①按1:10的比例分別將第50代培養液接種至厭氧培養基，37'C厭氧培養(氧分壓為3.1325kPa)36小時，進行增菌。②按1:IO的比例將增菌后的菌液接種到上述無碳源培養基中，加入亞麻子粕(150g/2.5L)，37。C厭氧培養(氧分壓為10.1325kPa)8天。2)樣品分析分析方法同實施例1的步驟3。通過HPLC圖譜結果對照標準曲線可以計算出培養液中腸內酯的含量，用腸內酯的產量除以底物的量，得到腸內酯的產率，見表9。3)腸內酯提取與純化方法同實施例7的步驟5。通過HPLC分析結果對照標準曲線可以算出洗脫物中腸內酯的量。洗脫物的量和洗脫物中腸內酯的含量見表9。表8不同菌種培養液中腸二醇產率、洗脫物量和洗脫物中腸二醇含量<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>80.28表9不同菌種培養液flp腸內酯產率、洗脫物量和洗脫物中腸內酯含量<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>權利要求1、一種生產腸二醇和/或腸內酯的方法，是以下述十種原料中的至少一種為底物，用腸道細菌進行厭氧培養，得到腸二醇和/或腸內酯；所述十種原料為亞麻子粕、海藻、芝麻子粕、油菜籽粕、黑麥麩、小麥麩、大麥麩、玉米麩、燕麥麩和牛蒡子粕。2、如權利要求l所述的方法，其特征在于所述厭氧培養的條件為氧分壓3.03975-10.1325kPa，25-40。C厭氧培養3-15天。3、如權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述腸道細菌來自用哺乳動物糞便或腸液制備的菌液；所述哺乳動物優選為人、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠或兔。4、如權利要求3所述的方法，其特征在于所述菌液是將糞便或腸液用水、磷酸緩沖液或0.9%生理鹽水進行懸浮得到的。5、如權利要求3或4所述的方法，其特征在于在厭氧培養前先將所述菌液利用厭氧培養基進行增菌，增菌條件為25-4(TC厭氧培養10-36小時。6、如權利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述菌液包括傳代培養后的菌液。7、如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，底物加入厭氧培養基或按照如下方法配制的培養基中每升PH6.5-PH7.5的磷酸緩沖液中加入1.5-6gNaCl、0.5-6gNH4Cl、0.1-2.0gL-半胱氨酸鹽酸鹽或硫代乙醇酸鈉；優選按照如下方法配制每升pH7.5的磷酸緩沖液中加入3gNaCl、1gNH4C1、0.3gL-半胱氨酸鹽酸鹽或硫代乙醇酸鈉。8、如權利要求7所述的方法，其特征在于所述底物的加入量為每升培養基中加入卜60g底物。9、如權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于厭氧培養3-8天后，用大孔樹脂色譜柱進行分離純化，采用乙醇水溶液進行梯度洗脫，從5%乙醇水溶液開始，遞增洗脫液中乙醇濃度，收集含有腸二醇的洗脫液，減壓濃縮干燥，得到腸二醇；所述大孔樹脂優選XAD-2大孔樹脂或DIOI大孔樹脂。10、如權利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于厭氧培養4-15天后，用大孔樹脂色譜柱進行分離純化，采用乙醇水溶液進行梯度洗脫，從5%乙醇水溶液開始，遞增洗脫液中乙醇濃度，收集含有腸內酯的洗脫液，減壓濃縮干燥，得到腸內酯;所述大孔樹脂優選XAD-2大孔樹脂或DIOI大孔樹脂。全文摘要本發明的目的是提供一種生產腸二醇和/或腸內酯的方法。本發明提供的生產腸二醇和/或腸內酯的方法，是以亞麻子粕、海藻、芝麻子粕、油菜籽粕、黑麥麩、小麥麩、大麥麩、玉米麩、燕麥麩和牛蒡子粕十種原料中的至少一種為底物，用腸道細菌進行厭氧培養，得到腸二醇和/或腸內酯。本發明利用價格低廉的植物資源和哺乳動物腸道菌群，采用生物技術直接轉化腸二醇和腸內酯，培養液經簡單的純化工藝即可使提取物中腸二醇和腸內酯的含量大于50％(70.15％-91.12％)。本發明提供的方法簡單、生產成本很低、無環境污染，非常適宜于工業化生產，具有重要的科學價值、社會及經濟效益。文檔編號C12P33/00GK101560541SQ20081010421公開日2009年10月21日申請日期2008年4月16日優先權日2008年4月16日發明者劉樹林,庫寶善,楊東輝申請人:北京大學