植物aba信號傳導調控蛋白及其編碼基因與應用的制作方法

專利名稱：植物aba信號傳導調控蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物ABA信號傳導調控蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及 一個來源于擬南芥的ABA信號傳導調控蛋白及其編碼基因與應用。
技術背景脫落酸(abscisic acid， ABA)是一種非常重要的天然植物生長激素，是最早得到確 認的五大類植物激素之一。脫落酸參與了許多植物生長和發育過程，如種子萌發、 幼苗生長、葉片氣孔開閉等，此外還是一種重要的抗逆誘導因子，介導了植物對逆 境如干旱、鹽堿、低溫等的抵抗作用，因此脫落酸信號轉導的研究對植物生長發育 調控的理解、作物品質的提高具有十分重要的意義。目前，ABA信號傳導途徑中，已經有兩個不同的RING FINGER類泛素連接酶 的功能研究報道，它們是AIP2和KEG，是兩個負調控因子，分別降解ABA信號途 徑兩個基本點重要的組分ABI3和ABI5。目前，己有多個擬南芥ABA突變體得到鑒定，同時關于ABA的合成和信號傳 導基因在許多物種中已有分離，它們的分子機理及作用機制已經得到廣泛深入的研 究。發明內容本發明的目的是提供一種植物ABA信號傳導調控蛋白及其編碼基因。 本發明的目的是提供一種植物ABA信號傳導調控蛋白及其編碼基因。 本發明所提供的植物ABA信號傳導調控蛋白，名稱為RHA2a，來源于擬南芥 (Arabidopsisthaliana)，是如下(a)或(b)的蛋白質(a) 由序列表中序列3的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b) 將序列表中序列3的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基 的取代和/或缺失和/或添加且具有植物ABA信號傳導調控功能的由(a)衍生的 蛋白質。其中，序列表中的序列3由155個氨基酸殘基組成。上述植物ABA信號傳導調控蛋白的編碼基因(i /^2 )也屬于本發明的保 護范圍。上述植物ABA信號傳導調控蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一 1)序列表中序列2的DNA序列；2) 編碼序列表中序列3所示蛋白質序列的多核苷酸；3) 在高嚴謹條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。 其中，序列表中序列2是由468個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列2的5'端第1-468位核苷酸序列為編碼序列(ORF),編碼具有序列表中序列3的氨基酸殘基 序列的蛋白質。上述植物ABA信號傳導調控蛋白的基因組基因，可具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中序列1的DNA序列；2) 編碼序列表中序列3所示蛋白質序列的多核苷酸；3) 在高嚴謹條件下可與序列表中序列2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。 其中，序列表中序列1是由3110個脫氧核苷酸組成，自序列表中序列1的5'端第1766-2233位核苷酸序列為編碼序列(ORF)，編碼具有序列表中序列3的氨基 酸殘基序列的蛋白質。上述高嚴謹條件可為在0.1xSSPE (或O.lxSSC)， 0.1。/。SDS的溶液中，在65°C 下雜交并洗膜。含有上述植物ABA信號傳導調控蛋白的編碼基因的表達載體、轉基因細胞 系及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。利用植物表達載體，將本發明的調控ABA信號傳導的基因(i /W2fl)導入植物 細胞或組織，可得到對種子萌發和早期生長階段對ABA敏感性升高的植物。使用構建植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強 型啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可 對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的選擇性標記基因(GUS基 因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標 記物等)。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境 篩選轉化植株。攜帶有本發明7 /^2fl的植物表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒 載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細 胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是水稻、玉 米、小麥等單子葉植物，也可以是番茄、擬南芥、煙草、棉花等雙子葉植物。本發明的植物ABA信號傳導調控蛋白是具有泛素連接酶活性的蛋白，其編碼基 因是RINGFINGER家族中結構相對簡單的一個新基因。功能研究表明，本發明的植 物ABA信號傳導調控蛋白是ABA信號傳導途徑的一個正調控因子。本發明植物 ABA信號傳導調控蛋白可調節植物對ABA敏感性，對植物中基因的分離和功能研究提供了重要手段。


圖1為RHA2a的泛素連接酶活性檢測。圖中第1條至第5條泳道分別為第①組 至第⑤組反應后，電泳、轉膜、用HIS抗體的westernblot結果。圖2為轉i /i4^基因擬南芥的ABA敏感性實驗。
具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例l、植物ABA信號傳導調控蛋白及其編碼基因(i /^h)的獲得1、 植物ABA信號傳導調控蛋白的及其編碼基因(i /^&)的獲得弓l物l: 5'- ACTAAGCTT TCTCTCCCGGTAATGGATGC-3'(上游弓l物，戈機 部分堿基為///"dill識別位點)引物2: 5'- AGAGAATTC CTCGTCATTCGGAGCCAA-3'(下游引物，劃線部 分堿基為EcoRI識別位點)提取擬南芥(Col-0生態型)的總DNA，以其為模板，在引物1和引物2的引 導下，進行PCR擴增，反應結束后對PCR產物進行純化，表明，擴增得到3110bp 的片段，經測序表明該片段具有序列表中序列1的核苷酸序列，即植物ABA信號 傳導調控蛋白的編碼基因，將其命名為Z /i42";自序列表中序列1的5'端的第 1766-2333位核苷酸序列(即序列表中序列2所示的核苷酸序列)為編碼序列(cDNA 序列)，編碼具有序列表中序列3所述氨基酸殘基序列的蛋白質，即本發明的植物 ABA信號傳導調控蛋白，將其命名為RHA2a。2、 用PCR的方法獲得擬南芥i /"2a的cDNA序列根據擬南芥數據庫序列結果，利用PCR的方法得到及/i4^的核苷酸序列。 以擬南芥(Col-0生態型)的基因組DNA為模板，用下述引物進行PCR擴增 引物3: 5'-AAGATGGGGCTACAAGGTCAG-3'(上游引物)， 引物4: 5'-GTGGAGAGAGAAACACGAGA-3'(下游引物)。 擴增得到約465bp的片段，測序表明，該片段具有自序列表中序列1的5'端的 第1766-2333位核苷酸序列(即序列表中序列2所示的核苷酸序列)，為i /"h的 編碼序列(cDNA序列)，編碼具有序列表中序列3所述氨基酸殘基序列的蛋白質， 即本發明的植物ABA信號傳導調控蛋白RHA2a。實施例2、植物ABA信號傳導調控蛋白及其編碼基因(i /^&)的功能驗證 1、可表達植物ABA信號傳導調控蛋白RHA2a的重組載體的構建 根據實施例1的步驟1獲得的W/i4^的DNA序列及載體pCAMBIA1300適宜的酵切位點，構建可表達植物ABA信號傳導調控蛋白RHA2a的重組載體，具體方 法如下所述將實施例1的步驟1所述擴增得到的/ /i4h片段用限制性內切酶和 五coi I進行雙酶切，然后將經純化的酶切產物與經相同酶酶切(州>^///和￡￡^ 1雙 酶切)的載體pCAMBIA1300連接，將連接產物進行測序，將經測序表明正確的含 有/ /i42a的重組載體命名為pCAMBIA1300-RHA2a。將pCAMBIA1300-RHA2a在根癌農桿菌的介導下轉化i^K42a突變體N378380 (購自NASC， The Nottingham Arabidopsis Stock Centre)，然后用選擇性標記基因 潮霉素(在含50mg/L潮霉素MS培養基)進行抗性篩選，篩選得到在含50mg/L潮 霉素的培養基上能夠生長的轉pCAMBIA1300-RHA2a植株。抗性篩選得到的轉 pCAMBIA1300-RHA2a植株，用引物1和引物2對其進行PCR擴增鑒定，得到PCR 鑒定正確的轉pCAMBIA1300-RHA2a植株。對PCR鑒定正確的轉pCAMBIA1300-RHA2a植株進行ABA敏感性試驗，具 體方法如下所述將同時種植，同時收獲的RHA2a突變體N378380 (訂購自NASC， The Nottingham Arabidopsis Stock Centre )和上述得至lj PCR鑒定正確的轉 pCAMBIA1300-RHA2a植株的種子播種在含有0.5 ABA的MS培養基上，4。C暗 培養3天，然后轉移至22'C光照條件，每天統計萌發率、子葉變綠和根的伸長等指 標，以擬南芥(Col-0生態型)為對照。結果表明，在不含ABA的培養基上，RHA2a突變體N378380、 PCR鑒定正確 的轉pCAMBIA1300-RHA2a在萌發率、子葉變綠和根的伸長與擬南芥(Col-0生態 型)沒有差異；在0.5 nM ABA的MS培養基上，擬南芥(Col-0生態型)、PCR 鑒定正確的轉pCAMBIA1300-RHA2a植株在萌發率、子葉變綠，根系深長受ABA 明顯抑制，而i /"2fl突變體N378380可以在0.5 pM ABA的MS培養基萌發正常 生長。說明該轉pCAMBIA1300-RHA2a植株恢復了及/^2a突變體N378380對ABA 的不敏感性，從而斷定及/^42a基因就是造成i /^2a突變體N378380對ABA敏感 性降低的基因。實施例3、 / /"2"是具有活性的泛素連接酶的功能驗證 1、 MBP-RHA2a融合蛋白、MBP蛋白的純化根據實施例1獲得的/ /^h cDNA序列及載體pMal-c2適宜的酶切位點設計引 物擴增/ /^2a，引物序列如下引物5: 5'-ACTGAATTCAAGATGGGGCTACAAGGTCAG-3'(上游引物，劃線部分堿基為五CORI識別位點)引物6: 5'-ACTGGATCCGTGGAGAGAGAAACACGAGA隱3'(下游引物，劃線 部分堿基為5"mHI識別位點)提取擬南芥Col-O的總DNA，以其為模板，在引物5和引物6的引導下，進行 PCR擴增，反應結束后對PCR產物進行純化表明，擴增得到465bp左右的片段， 經測序表明該片段具有序列表中序列2的核苷酸序列。將上述擴增得到的片段用限制性內切酶&oRI和5"mHI對經純化的PCR產物 進行雙酶切，然后將經純化的酶切產物與經五coRI和5amHI雙酶切后的載體pMal-c2 (購自NEB公司)連接，將連接產物進行酶切和測序鑒定，將鑒定表明含有i2/"2" 的正確的重組載體命名為pMal-c2-i i^2a。將pMal-c2-_/ /"2fl轉化大腸桿菌BL21，篩選轉入了 pMal-c2-W/W2a的大腸桿 菌BL21，將含有pMal-c2-Z ft42a的大腸桿菌BL21命名為BL-pMal-c2-Z ft42a。將BL-pMal-c2-RHA2a接種于LB培養基，挑選單克隆在37"C搖培過夜，第二 天按照1/100轉接到LB培養基中，搖菌培養至OD600為0.5時候，加入終濃度為1 毫摩爾/升IPTG誘導，繼續培養3小時，收集菌體。按照pMal-c2載體說明書純化 RHA2a蛋白，同時按照上述方法表達pMal-c2空載體為對照，純化后上樣SDS-PAGE 膠電泳，考馬斯亮藍染色后分析。根據電泳遷移速率結果表明，誘導培養后的 pMal-c2-RHA2a菌體純化得到的是MBP-RHA2a融合蛋白，表達pMal-c2空載體純 化得到MBP蛋白。2、 RING FINGER區(自序列表中序列3的氨基端第86-127位氨基酸殘基)一 個氨基酸突變(自序列表中序列3的氨基端第89位氨基酸殘基)的MBP-RHA2aA 融合蛋白的獲得。人工合成了自序列表中序列2的核苷酸第265位核苷酸由T突變為A的RHA2a cDNA片段(命名為/ /M^A)，合成時并在其5'端加入EcoRI酶識別位點，并 在其3'端加入5amHI識別位點，該合成的序列編碼RING FINGER區(自序列表 中序列3的氨基端第86-127位氨基酸殘基) 一個氨基酸(自序列表中序列3的氨基 端第89位氨基酸殘基)由Cys突變為Ser的MBP-RHA2a融合蛋白，命名為 MBP-RHA2aA融合蛋白。然后利用上述獲得的突變的RHA2a cDNA用限制性內切酶五coRI和5"mHI對 經純化的PCR產物進行雙酶切，然后將經純化的酶切產物與經五coRI和SamHI雙 酶切后的載體pMal-c2 (購自NEB公司)連接，將連接產物進行酶切和測序鑒定，將鑒定表明含有及/Z^2"A的正確的重組載體命名為pMal-c2-i /^42aA。按照步驟1的方法，將pMal-c2-i i^2"A轉入到大腸桿菌BL21表達并純化得到MBP-RHA2aA融合蛋白。3、 RHA2a是具有活性的泛素連接酶的功能驗證實驗 進行如下5組反應實驗，驗證RHA2a的泛素連接酶活性① 將lug步驟1獲得的MBP蛋白、40ng小麥的泛素激活酶El (GI: 136632)、 40ng來源于人的泛素結合酶E2 (UbcH5b) 、 2ug融合HIS標簽的泛素蛋白Ubiquitin 一起加入40ul泛素反應液(50mM Tris (pH 7.4), 2mMATP, 5mMMgC12, 2mMDTT.) 中，30'C反應2小時;② 將lug步驟1獲得的MBP-RHA2a蛋白、40ng來源于人的泛素結合酶E2 (UbcH5b)、2ug融合HIS標簽的泛素蛋白Ubiquitin —起加入40ul泛素反應液(50mM Tris (pH 7.4), 2mMATP, 5mMMgC12， 2mMDTT.)中，30°C反應2小時；③ 將步驟1獲得的lugMBP-RHA2a蛋白、40ng小麥的泛素激活酶El (GI: 136632) 、 40ng) 、 2ug融合HIS標簽的泛素蛋白Ubiquitin—起加入40ul泛素反應 液(50mM Tris (pH 7.4)， 2mMATP, 5mMMgC12，2mMDTT.)中，30。C反應2小時； 將lug步驟1獲得的MBP-RHA2a蛋白、40ng小麥的泛素激活酶El (GI: 136632) 、 40ng來源于人的泛素結合酶E2 (UbcH5b) 、 2ug融合HIS標簽的泛素蛋 白Ubiquitin —起加入40ul泛素反應液(50mM Tris (pH 7.4), 2mMATP, 5mMMgC12, 2mMDTT.)中，30'C反應2小時；⑤將lug步驟2獲得的MBP-RHA2aA融合蛋白、40ng小麥的泛素激活酶E1(GI: 136632) 、 40ng來源于人的泛素結合酶E2 (UbcH5b) 、 2ug融合HIS標簽的泛素蛋 白Ubiquitin —起加入40ul泛素反應液(50mM Tris (pH 7.4), 2mMATP, 5mMMgC12, 2mMDTT.)中，3(TC反應2小時；取上述5組的反應液進行SDS-PAGE膠電泳，電泳后轉膜，分別用HIS抗體 westernblot。結果如圖l所示，結果表明第①組(MBP對照)、第②組(不加E1)、第③組 (不加E2)的反應液中均不能檢測到被泛素化修飾的MBP-RHA2a，只有第④組在 El、 E2和RHA2a都存在的情況下，可以明顯地檢測到RHA2a能被泛素化后得到的 蛋白條帶((Ub)n-MBP-RHA2a)。第⑤組也不能檢測到被泛素化修飾的MBP -膽八2&/^融合蛋白，說明用RING FINGER區一個氨基酸突變的RHA2a蛋白，也不 能泛素化。其中圖1中，第1條至第5條泳道分別為第①組至第⑤組反應液的HIS抗 體westernblot結果。上述結果表明，RHA2a具有泛素連接酶活性，并且完整的RING FINGER區對 RHA2a蛋白的功能是必須的。實施例4、 7 /i42a過量表達能明顯提高植物對ABA的敏感性。根據實施例1獲得的i i^2aDNA序列及載體pBI121適宜的酶切位點設計引物 擴增7 /W^，引物序列如下引物7: 5'-ACTGGATCCAAGATGGGGCTACAAGGTCAG隱3'(上游引物，劃 線部分堿基為BamHI識別位點)引物8: 5'- ACTGAGCTCTACTCAGTGGAGAGAGAAAC-3'(下游引物，劃 線部分堿基為識別位點)提取擬南芥(Col-0生態型)的總DNA，以其為模板，在引物7和引物8的引 導下，進行PCR擴增，反應結束后對PCR產物進行純化，表明，擴增得到465bp 左右的片段，經測序表明該片段具有序列表中序列2的核苷酸序列。將上述擴增得到的片段用限制性內切酶5"mHI和對經純化的PCR產物進 行雙酶切，然后將經純化的酶切產物與經相同酶酶切的載體pBI121連接，將連接產 物進行酶切和測序鑒定，將鑒定表明含有i /^h的正確的重組載體命名為 pBI12H廟。將pBI121-i ft42a在根癌農桿菌的介導下轉化擬南芥野生型(Col-0生態型)， 然后用選擇性標記基因卡那霉素(在含50mg/L卡那霉素的MS培養基)進行抗性 篩選，篩選得到在含50mg/L卡那霉素的MS培養基上能夠生長的轉pBI121-i /^h 植株。抗性篩選得到的轉pBI121^/i42fl植株，用引物7和引物8對其進行PCR擴 增鑒定，得到PCR鑒定正確的轉pBI121-i 7i42a植株。對PCR鑒定正確的轉pBI121-7 /^h植株進行ABA敏感性試驗，具體步驟如 下所述將同時種植，同時收獲的RHA2a突變體N378380 (訂購自NASC， The Nottingham Arabidopsis Stock Centre)(圖2中的RHA2a)、擬南芥(Col-0生態型) (圖2中的Col-0)或轉pBI121-i /i42a植株(圖2中的35&及/^h)的種子分別播 種在含有不同濃度(OWVI、 0.2 MM、 0.4 WV1、 0.5 MM、 0.8 MM禾tll.O WVT (如圖2所 示))的ABA的MS培養基上，4°C暗培養3天，然后轉移至22'C光照條件，每 天統計萌發率、子葉變綠和根的深長等指標。結果如圖2所示，相對于擬南芥Col-0野生型(圖2中的Col-0)來說，轉 pBI121-7 /^2a植株(圖2中3_5&7 /"2")對ABA的敏感性大大提高，在非常低濃 度的ABA培養基上，RHA2a過量表達的轉pBI121-7 7i42a植株就不能正常生長，子葉不能變綠，根系深長也受明顯抑制，而RHA2a突變體N378380(圖2中的rha2a) 對ABA的敏感性降低，能夠在在較高濃度的ABA條件下生長。這些說明，Z ft42a 過量表達能明顯提高植物對ABA的敏感性，也就是說RHA2a是ABA信號途徑中 的一個新的正調控因子。序列表<160>3<210>1<211>3110〈212>腿<213>擬南芥da力iab/ sis1 t/W/朋a)<400>1tctctcccggtaatggatgctctttgcttttactttgttttgtcaccacacaa"tgctcat60catctaattggagttgg她tcaccaattaat t gametettgetaattatga<t￡it3g3g120gacaacacatccttttcgtcaatcacttttacgccttccctttttggacatttatttctt180ctattttaaaaattccacggcaMttcatattatatcagtggtaatggttttggtctttg240cttaattaatgtgttaatcaactttcttaatcccaacttgttttgtttttttttatcagt300cggtggattctcatatcttttggscggcgatcttttctcccactttctct360atttaaatataagtataaaccca犯cttatcattatatattatgeaaaattaatacgttg420acagcgccgtttaccatttttataatactgactaaatgttacttatccttcactctttcg480tttatgtttccttcatgatggtcatgtttatcctttgttattcatcatgtactLtta^ag540t肌tgttcgattcaaattactgtagatgcgcacgtttcacttattttattgtgacctcta600aaaaaaac aagaatatataccaatatac C3ttttattagttggtaaaagatag肌atact660aattttgaaaat a&aaa111aaccatttccccaaataaatgettatata^g720gcttatgctttaaxxaatttacaaataatattcccgaaaattctgatgttgtttagtccg780ctgtttaagtsgttgcttgctatcttattttaaaattttggagtatattttaata^ggta840ga犯ccgtagatatgacatgattattggggggtccgaaacatataaaat 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Glu Val Arg Lys Leu Glu Cys Arg His Val Phe His Lys Lys Cys100 105 110Leu Glu Gly T卬Leu His Gin Phe Asn Phe Thr Cys Pro Leu Cys Arg115 120 125Ser Ala Leu Val Ser Asp Asp Cys Val Ser Lys Thr Gin Arg Ser Val130 135 140Gly Arg Asp Leu lie Ser Cys Phe Ser Leu His 145 150 15權利要求
1、一種植物ABA信號傳導調控蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID №.3氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物ABA信號傳導調控蛋白活性的蛋白質。
2、 權利要求1所述的植物ABA信號傳導調控蛋白的編碼基因。
3、 根據權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述植物ABA信號傳導調控 蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQIDJ^: 2的核苷酸序列；2) 編碼序列表中SEQIDW2: 3蛋白質序列的多核苷酸；3) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDW: 2限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。
4、 根據權利要求3所述的編碼基因，其特征在于所述植物ABA信號傳導調控 蛋白的基因組基因具有下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQIDW2: 1的核苷酸序列；2) 編碼序列表中SEQIDW: 3蛋白質序列的多核苷酸；3) 在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDW: 1限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。
5、 含有權利要求2-4中任意一項所述的植物ABA信號傳導調控蛋白編碼基因的 重組表達載體。
6、 含有權利要求2-4中任意一項所述的植物ABA信號傳導調控蛋白編碼基因的 轉基因細胞系。
7、 含有權利要求2-4中任意一項所述的植物ABA信號傳導調控蛋白編碼基因的 宿主菌。
8、 權利要求2-4中任意一項所述的植物ABA信號傳導調控蛋白編碼基因在提高 植物對脫落酸的敏感性中的應用。
9、 根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述植物為擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種植物ABA信號傳導調控蛋白及其編碼基因與應用。該蛋白，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №.3的氨基酸殘基序列；2)將序列表中的SEQ ID №.3氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有植物ABA信號傳導調控蛋白活性的蛋白質。該蛋白具有泛素連接酶活性的蛋白，是ABA信號傳導途徑的一個正調控因子，調控蛋白可調節植物對ABA敏感性，對植物中基因的分離和功能研究提供了重要手段。
文檔編號C12N15/63GK101250221SQ20081010407
公開日2008年8月27日 申請日期2008年4月15日 優先權日2008年4月15日
發明者卜慶云, 吳曉燕, 孫加強, 李傳友, 李常保, 蔣紅玲 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所