專利名稱：含有生物標志物樣本的高通量分析方法和樣本庫制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種對于包含生物
標志物的樣本進行高通量分析的方法；本發(fā)明還涉及一種用于高通量分析的
矩陣化排列樣本的樣本庫的方法；本發(fā)明同時涉及根據(jù)本發(fā)明所述方法所制 備的樣本庫。
背景技術(shù)：
對生物組織來源的具有一定生物學(xué)意義的生物標志物以適當形式進行 分析，是生物醫(yī)學(xué)研究中的一項重要命題。這種生物標志物分子是指包括但 不限于核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)或cDNA、蛋白、多肽、 脂質(zhì)、多糖，通常要求以其相應(yīng)生物醫(yī)學(xué)屬性，如分子量、所帶電荷來進行 分離組4分化，以進行更有價值和準確的分析。
生物標志物分子的分離或組份化是由相關(guān)生物標志物分子所具有的一種 或多種屬性而決定的、能夠使其與其他成分分子相分離的方法，包括瓊脂糖 電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、雙向PAGE、等離子聚焦、離子交換 色譜、過濾色譜、疏水色譜、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、 氣相色語、原子吸收、親合色譜、梯度離心。經(jīng)生物標志物分離組份化的方 法處理，生物標志物分子(群)以其本身屬性與其他分子相區(qū)分，這些屬性 包括分子量大小、電荷、有機相溶解性、親合性、質(zhì)量、形狀、密度或顏 色。
例如，傳統(tǒng)的RNA印跡技術(shù)(Northern blot)和蛋白免疫印跡技術(shù) (Western blot)是廣泛應(yīng)用于分析樣品中RNA和蛋白生物標志物分子大小 或含量的主要方法。Northern blot (對于RNA分子的分析)和Western blot (對于蛋白分子的分析)由Southern blot (對于DNA分子的分析)演化而 來(Southern， E. M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98:503-517,此處作為文獻引用)， 對一部分細胞或者組織而言這兩種方法是檢測分析生物標志物基因轉(zhuǎn)錄、 表達翻譯的分子量和表達水平的必備檢測方法。
盡管例如差異顯示、RT-PCR或RNA保護檢測(RPA)也適用于此種檢測，但Northern blot分析和Western blot分析是對于特定生物標志物基因和特 定生物標志物蛋白分子量及表達水平的最佳檢測方法。其它的檢測方法由于 步驟復(fù)雜或引入酶的操作等而變得使用不便或者不通用。與其他方法比較， Northern blot分析和Western blot分析是對生物標志物基因和蛋白的實際情 況的最好檢測方法，這兩種方法在確定備選的生物標志物的斷裂基因的大 小、生物標志物蛋白翻i奪后修飾、以及生物標志物基因和蛋白表達水平等方 面都是必不可少的重要手段。
Northern blot和Western blot方法使用多年，其具體操作仍同多年前一 致。在進行Northern blot時，對RNA生物標志物的瓊脂糖電泳使用變性劑 諸如曱醛和甲醛胺，因為RNA分子群每分子攜帶一單位負電子，RNA生物 標志物在瓊脂糖中的遷移速度取決于其核酸長度和分子大小。
凝膠上組份化的RNA核酸生物標志物可以一皮點樣于尼龍或者硝酸纖維 膜上制成Northern blot。在Northern blot分析中，可以加入帶有標記核苦酸 和靶核苷酸互補片段的探針對特定RNA生物標志物片段進行雜交探測。 Northern blot可以同時進行RNA生物標志物定量并測定其分子大小。
Western blot與Northern blot方法的不同是由于蛋白質(zhì)生物標志物與 RNA生物標志物的根本性質(zhì)不同。蛋白質(zhì)依照其不同的氨基酸構(gòu)成可以攜 帶負電荷或者正電荷。
為了得到基于分子量的整齊一致的梯度或系列排列的組份化蛋白分子 標志物，在蛋白上樣緩沖液和其電泳凝膠中加入了十二烷基硫酸鈉(SDS)， 二 疏蘇糖醇(DTT)和|3-巰基乙醇。SDS是陰離子去垢劑，以特定的1.4: 1 質(zhì)量比同蛋白質(zhì)結(jié)合，其所攜帶的負離子電荷數(shù)同蛋白片段的長度成正比。 所有的蛋白分子同SDS結(jié)合后，整齊一致地攜帶負電荷，另外還原劑如二 疏蘇糖醇(DTT)和p-mecarptoethanol ((3-巰基乙醇)可以打斷蛋白質(zhì)二硫鍵， 以避免蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)影響凝膠電泳。
經(jīng)過凝膠電泳后，凝膠可以進行染色分析或者進一步將蛋白轉(zhuǎn)移到支持 膜上來進行Western blot分析。為檢測Western blot的特定蛋白生物標志物， 針對特定靶生物標志物(抗原)的抗體與雜交膜一起孵育。結(jié)合的生物標志 物-抗體復(fù)合物進一步進行化學(xué)發(fā)光、熒光、或》文射測定。如同Northern blot 一樣，Western blot可以同時進行蛋白生物標志物分子量大小和表達水平定 量測定。
傳統(tǒng)Northern blot和Western blot分析是對于上述目的最主要的實驗方法，然而，它們在一張膜上所能提供的樣品容量是很有限的， 一般一張膜上
不會超過10個樣品，此種缺陷使Northern或Western blot在大規(guī)模和高通 量生物標志物分析中具有纟艮大的局限性。
隨著人類基因組計劃完成而出現(xiàn)的多達30,000個以上的新基因，使得對 于生物標志物的高通量分析變得緊迫，美國專利6,582,969和6,576,478 (Wagner等人)顯示一種方法及其微型裝置可以對于生物分子進行高通量篩 選。
這類微型裝置包含特別的微型機械或者微型操作通路，帶有多個內(nèi)置非 連續(xù)反應(yīng)位點，由固化在單層結(jié)構(gòu)上的生物分子部分通過親合標記特別分子 從而發(fā)生底物反應(yīng)。這些微型裝置可以篩選通道中流過的在功能或結(jié)構(gòu)上相 關(guān)的分子成分。美國專利6,537，749(Kuimelis等人)顯示可溯源的陣列蛋白， 其中核酸同蛋白融合物由一個接頭層偶連在一固體層上，這個接頭層一頭是 一個空間部分、另一頭是另一寡核苷酸序列，同帶有陣列分子群的偶連寡核 苷酸序列相互補。
這些陣列技術(shù)可以提供對于生物標志物的高通量的篩選方法，但它們都 必須同不可移動的介質(zhì)和親合集團相構(gòu)建，進一步而言，這些技術(shù)沒有同上 述傳統(tǒng)Northern blot和Western blot檢測方法相結(jié)合的主觀意圖，因而不能 檢測如mRNA或蛋白分子的片段大小等指標。因此，改進這些裝置的相關(guān)缺 陷，建立一種高通量的篩選系統(tǒng)就變得十分必要，這個系統(tǒng)具備更高的檢測 靈敏度并能實現(xiàn)高通量的篩選分析，而在同時卻只消耗最少的寶貴樣品。
由于以上原因，很明顯地，需要特別設(shè)計一種方法和相關(guān)儀器來高通量 篩選生物標志物，這種儀器和方法可以將分子組份化技術(shù)和微陣列技術(shù)方法 有效結(jié)合，從而創(chuàng)建一種更靈敏、消耗更少寶貴樣品的方法來進行高通量篩 選相關(guān)生物標志物。
發(fā)明內(nèi)容
除非另外說明，本文中使用的術(shù)語"生物標志物"是指對生物組織來源 的具有一定生物學(xué)意義的物質(zhì)，其包括但不限于核糖核酸(RNA)、脫氧 核糖核酸(DNA)或cDNA、蛋白、多肽、脂質(zhì)和/或多糖。
除非另外說明，本文中使用的表述"組份化"是指由相關(guān)生物標志物分 子所具有的一種或多種屬性而決定的、能夠使其于其他成分分子相分離的方 法，其包括但不限于瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、雙向PAGE、等離子聚焦、離子交換色譜、過濾色譜、疏水色鐠、高效液相色譜(HPLC)、 薄層色譜(TLC)、氣相色譜、原子吸收、親合色譜和/或梯度離心。
除非另外說明，本文中使用的術(shù)語"一級設(shè)定序列"是指在組份化媒 介中依照參數(shù)如時間、距離或者相應(yīng)排列設(shè)定的序列；本文中使用的術(shù)語 "次級設(shè)定序列，，是指按照組份化樣本的來源而設(shè)定的序列。
除非另外說明，本文中使用的表述"HT Northern blot，，和"HT Western blot"分別表示"高通量核酸印記法"和"高通量蛋白印記法"，是指來源于 眾多不同樣本的經(jīng)過組份化分離的mRNA或蛋白以矩陣形式進行印跡分析 以檢測相關(guān)mRNA或蛋白生物標志物的表達模式，其原理和應(yīng)用方式同處 理車交少才羊品的傳統(tǒng)Northern blot或Western blot相類近。
本發(fā)明的目的在于，提供一種適應(yīng)于生物標志物的高通量篩選系統(tǒng)的解 決方法，如將上述的Northern blot分析或Western blot分析結(jié)合，根據(jù)生物 標志物的不同屬性及由此而產(chǎn)生的不同組份化方法和途徑相結(jié)合。具體地， 本發(fā)明的一個目的在于，提供一種對包含生物標志物的樣本進行高通量分析 的方法。本發(fā)明的另一個目的在于，提供一種用于高通量分析的矩陣化排列 樣本的樣本庫的制備方法。本發(fā)明的又一個目的在于，提供一種根據(jù)本發(fā)明 所述的方法所制備的樣本庫。
針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案
一方面，本發(fā)明提供一種對于包含生物標志物的樣本進行高通量分析的 方法，所述方法包括如下步驟
(1) 、將所述包含生物標志物的原始樣本以能夠分離所述包含生物標志物 的方法進行組份化，并依照其進行組份化方法所產(chǎn)生的參數(shù)所設(shè)定的一級設(shè) 定序列和根據(jù)所述樣本來源所設(shè)定的次級設(shè)定順序，使得到的包含生物標志 物的組份化樣本在組份化媒介上進行排列或表達，優(yōu)選地，所述樣本來源為 生物組織來源；
(2) 、從所述組份化介質(zhì)上回收所述組份化樣本，使回收得到的每一個組 份化的樣本，都確保依照步驟(l)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序 列進行分序和排列；
(3) 、按照步驟(1)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列，將所回 收到的包含生物標志物的組份化樣本在支持材料上進行矩陣排列即矩陣化 上樣，所述支持材料優(yōu)選為硝酸纖維素、尼龍、塑料、玻璃、多孔板和磁珠等；
(4)、進行高通量分析所述矩陣化上樣的樣本，從而對所述生物標志物進 行檢測、分析和/或預(yù)測；優(yōu)選地，所述高通量分析為對矩陣化上樣的核酸樣 本進行Northern blot分析或?qū)仃嚮蠘拥牡鞍讟颖具M行Western blot分析。
優(yōu)選地，所述方法為^f全測來源于眾多不同組織的生物標志物的表達模式 的高通量4企測方法，所述方法包括對每個不同組織來源的樣本重復(fù)步驟(l) 和(2),使所有不同組織來源的包含生物標志物的樣本都完成組份化過程和回 收過程。
優(yōu)選地，所述生物標志物的類型包括核酸如核糖核酸(RNA)、脫氧 核糖核酸(DNA)和/或cDNA,蛋白，多肽，脂質(zhì)和/或多糖。
優(yōu)選地，所述步驟(1)的組份化處理，是以生物標志物分子的自身屬 性優(yōu)選為生物醫(yī)學(xué)屬性來分離為所述一級i殳定序列排列的樣本，優(yōu)選地，所 述屬性選自分子量大小、電荷、有機相溶解性、親合性、質(zhì)量、形狀、密 度和顏色；更優(yōu)選地，所述分離方法選自以下的一種或幾種瓊脂糖凝膠電 泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、 二維PAGE、等電聚焦、離子交換色譜、 過濾色i普、疏水色譜、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、氣相色譜、 原子吸收、親合色譜和梯度離心。
優(yōu)選地，步驟(l)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列所依據(jù)的參數(shù)包括距離、 時間和/或順序，所述距離、時間和/或順序是所述包含生物標志物的組份化 樣本在該組份化媒介中的遷移距離、時間和/或順序，或是所述包含生物標志 物的組份化樣本在該組份化:! 某介之外的遷移距離、時間和/或順序。
優(yōu)選地，步驟(l)中所i殳定的一級設(shè)定序列可以^4居樣本的切分點如 由相伴隨的分子量標準所指示的組份的分子量的大小作為切分點進行排列； 更優(yōu)選地，所述系列樣本的分界點可與伴隨的分子量標準呈線性、對數(shù)或指 數(shù)關(guān)系；和/或所述一級設(shè)定序列為自然形成序列或由任一方式重新安排的序 列。
優(yōu)選地，所述樣本的組織來源選自以下的一種或幾種血液、胎盤、 膀胱、大腦、腦額葉、腦海馬、腦枕葉、腦頂頁、腦顳葉、乳房、小腦、結(jié) 腸、食道、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、肌肉、卵巢、胰腺、直腸、皮膚、小 腸、十二指腸、小腸回腸、小腸空腸、脾臟、胃、睪丸、扁桃腺、子宮宮頸
和子宮宮體。
優(yōu)選地，步驟(2)中所述回收方法以自動化方式進行，或是使用相關(guān)試劑盒或商品化儀器來進行。
優(yōu)選地，步驟(l)中所述的一級設(shè)定序列排列的包含生物標志物的組 份化樣本在步驟(3)所述的每個支持材料上進行上樣的組份化樣本的數(shù)目
為2到500,000。
優(yōu)選地，步驟(3)中對所述的包含生物標志物的組份化樣本矩陣化上 樣的步驟可以按照任意主觀設(shè)定的序列或任意次序來進行。
優(yōu)選地，步驟(3)中的所述矩陣化上樣的方法為通過微陣列點樣儀器 自動或不借助儀器手工進行。
優(yōu)選地，對步驟(3)中所述的支持材料進行電荷或化學(xué)修飾操作以增 強其分子結(jié)合能力，所述才喿作包括聚賴氨酸化、甲硅烷基化、硅烷化。
優(yōu)選地，所述方法的步驟(4)包括如下操:作
(4.1)選擇并設(shè)計可以與步驟(3)所述的矩陣排列在支持材料上的生 物標志物相結(jié)合并相互作用的探針分子；優(yōu)選地，所述探針分子選自核糖 核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、蛋白質(zhì)、抗體和經(jīng)化學(xué)修飾的蛋白；進 一步優(yōu)選地，所述經(jīng)化學(xué)修飾的蛋白是指經(jīng)化學(xué)標記、螢光標記、放射同位 素標記或質(zhì)諉分析激光標記的蛋白質(zhì)探針。
(4.2 )分析步驟(3)中所述的按照步驟(1)所述的相應(yīng)的一級序列和次級 序列排列的包含生物標志物的組份化樣本所呈現(xiàn)的表達狀況；和
(4.3 )檢測并分析預(yù)測步驟(l)中所述生物標志物的屬性。 進一步優(yōu)選地，所述方法包括將步驟(4.1)中所述纟笨針分子與所述支
所述探針分子的孵育或雜交過程可以手動操作或自動化進行。
進一步優(yōu)選地，步驟(4.2)的分析和/或(4.3)檢測包括分析和/或檢
其方法選自化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法、放射法和質(zhì)譜分析法。
用的探針分子數(shù)量的操作是以手動進行的，例如使用膠片手工曝光；或是使 用儀器進行的，例如使用微點陣掃描儀來進行。
優(yōu)選地，所述步驟(4)包含生物標志物的組份化樣本的表達模式的分析； 優(yōu)選地，所述分析包括通過數(shù)學(xué)計算和計算機圖像處理和數(shù)據(jù)分析等高通量 方式處理并生成相應(yīng)數(shù)據(jù)庫。
優(yōu)選地，所述數(shù)學(xué)計算是用于確定步驟(l)中所述的在組份化媒介之中或r厶'
離或
時間,
優(yōu)選地，所述計算機圖像處理及其數(shù)據(jù)分析是用于確定步驟(l)中所述的 以 一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列排列生物標志物分子的數(shù)量。
優(yōu)選地，所述的計算機圖像處理及其數(shù)據(jù)分析是用于放大處理包含生物 標志物的組份化樣本的微點陣圖像。
另 一方面，本發(fā)明提供一種用于高通量分析的矩陣化排列樣本的樣本庫 的制備方法，所述方法包括如下步驟
(1) 、將所述包含生物標志物的原始樣本以能夠分離所述包含生物標志物 的方法進行組份化，并依照其進行組份化方法所產(chǎn)生的參數(shù)所設(shè)定的 一級設(shè) 定序列和根據(jù)所述樣本來源所設(shè)定的次級設(shè)定順序，使得到的包含生物標志 物的組份化樣本在組<分化4某介上進行排列或表達，優(yōu)選地，所述樣本來源為 組織來源；
(2) 、從所述組份化介質(zhì)上回收所述組份化樣本，使回收得到的每一個組 份化的樣本，都確保依照步驟(1)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序 列進行分序和排列；
(3) 、按照步驟(1)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列，將所回
持材料優(yōu)選為硝酸纖維素、尼龍、塑料、玻璃、多孔板和》茲珠。
優(yōu)選地，所述方法中的原始樣本為來源于不同個體的不同組織的含生物 標志物的樣本，所述方法包括對每一個體的不同組織來源的樣本重復(fù)步驟(l) 和(2),使所有不同組織來源的包含生物標志物的樣本都完成組份化過程和回 收過程。
優(yōu)選地，所述生物標志物的類型包括核酸如核糖核酸(RNA)、脫氧 核糖核酸(DNA)和/或cDNA,蛋白，多肽，脂質(zhì)和/或多糖。
優(yōu)選地，所述步驟(1)的組份化處理，是以生物標志物分子的自身屬 性優(yōu)選為生物醫(yī)學(xué)屬性來分離為所述一級設(shè)定序列排列的樣本，優(yōu)選地，所 述屬性選自分子量大小、電荷、有機相溶解性、親合性、質(zhì)量、形狀、密 度和顏色；優(yōu)選地，所述分離方法選自以下的一種或幾種瓊脂糖凝膠電泳、 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、 二維PAGE、等電聚焦、離子交換色譜、過濾 色譜、疏水色譜、高效液相色語(HPLC)、薄層色譜(TLC)、氣相色譜、原 子吸收、親合色譜和梯度離心。優(yōu)選地，步驟(1)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列所依據(jù)的參數(shù)包括距離、 時間和/或順序，所述距離、時間和/或順序是所述包含生物標志物的組份化 樣本在該組份化々某介中的遷移距離、時間和/或順序，或是所述包含生物標志 物的組份化樣本在該組份化々某介之外的遷移距離、時間和/或順序。
優(yōu)選地，步驟(1)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列可以根據(jù)樣本的切分點如
由相伴隨的分子量標準所指示的組份的分子量的大小作為切分點進行排列； 優(yōu)選地，所述系列樣本的分界點可與伴隨的分子量標準呈線性、對數(shù)或指數(shù) 關(guān)系；和/或所述一級設(shè)定序列為自然形成序列或由任一方式重新安排的序 列。
優(yōu)選地，所述樣本的組織來源選自以下的一種或幾種血液、胎盤、膀 胱、大腦、腦額葉、腦海馬、腦枕葉、腦頂頁、腦顳葉、乳房、小腦、結(jié)腸、 食道、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、肌肉、卵巢、胰腺、直腸、皮膚、小腸、 十二指腸、小腸回腸、小腸空腸、脾臟、胃、睪丸、扁桃腺、子宮宮頸和子 宮宮體。
優(yōu)選地，步驟(2)中所述回收方法以自動化方式進行，或是使用相關(guān) 試劑盒或商品化儀器來進行。
優(yōu)選地，步驟(1)中所述的一級設(shè)定序列排列的包含生物標志物的組 份化樣本在步驟(3)所述的每個支持材料上進行上樣的組份化樣本的數(shù)目 為2到500,000。
優(yōu)選地，步驟(3)中對所述的包含生物標志物的組份化樣本矩陣化排 列的步驟可以按照任意主觀設(shè)定的序列或任意次序來進行。
優(yōu)選地，步驟(3)中的所述矩陣化排列的方法為通過微陣列點樣儀器 自動或不借助儀器手工進行。
優(yōu)選地，對步驟(3)中所述的支持材料進行電荷或化學(xué)修飾操作以增 強其分子結(jié)合能力，所述操作包括聚賴氨酸化、甲硅烷基化、硅烷化。
另一方面，本發(fā)明提供一種根據(jù)本發(fā)明所述的方法所制備的樣本庫，所 述樣本庫包含生物標志物的矩陣化排列的樣本和所述樣本在其上進行矩陣 化排列的支持材料。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明纟是供一種對于相同組織(群) 或不同組織(群)的包含生物標志物的眾多分子(群)而來的多種分子組分 (群)進行高通量分析的方法，包括以下步驟
(l)對于所述的眾多分子組份(群)依照其生物標志物的屬性以至少一種組份化方法或兩種及以上的方法組合對其進行組^除化， <吏之成為 一種譜系排 列或包含生物標志物的組份化分子(群)亞群的一系列分子組份(群)。其 中，所述的包含生物標志物的分子組份譜系或一系列組^分(群)依照其進行 組份化方法所產(chǎn)生的參數(shù)，如距離、時間、順序，所i殳定的一級設(shè)定序列，
或表達；
(2) 從該組份化介質(zhì)上回收經(jīng)組份化的包含生物標志物的系列分子使所 述的回收得到的每一個組份化的包含生物標志物的分子組份，都確保依照步 驟(1)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列進行分序和排列；
(3) 按步驟(1)所述指定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列，將所回收到 的包含生物標志物的組份化系列分子群以矩陣排列在支持材料；
(4) 選擇并設(shè)計可以同步驟(3)所述的矩陣排列在支持材料上的生物標 志物相結(jié)合并相互作用的探針分子；
(5) 分析步驟(3)中所述的按照步驟(l)所述的相應(yīng)的 一級和次級序列排列 的包含生物標志物的組份化分子(群)所呈現(xiàn)的表達狀況；
(6) 檢測并分析預(yù)測步驟(l)中所述的生物標志物的屬性。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(4)所述探針分子同支 持材料上矩陣排列的生物標志物分子(群)之間的酵育和雜交步驟。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(4)所述的檢測矩陣排
法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法、放射法或質(zhì)譜分析法。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(1)所述的含有生物標 志物的組份化分子(群)是來源于相同或不同組織(群)的具有相同或不同 屬性的，可以依照其屬性而經(jīng)相應(yīng)組份化方法進行組份化成為一個鐠系排列 或者一系列組份(群)的相同或不同的包含生物標志物的組份化分子混合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的組4分化方法中，包含 生物標志物的組份化分子包含但并不限于核酸(DNA， cDNA或RNA)、 蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)或多糖。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(l)中所述的經(jīng)組份化 處理的包含生物標志物的分子保持其初始或者進一步處理后的狀態(tài)。.
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(1)所述的包含生物標 志物的組份化分子(群)的屬性，是指包含^f旦不限于分子量大小、所帶電荷、溶解性、質(zhì)量、密度、親合力、體積或顏色。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(1)中所述的組份化方
法，是指由以下分離方法所選取的，包含但不限于瓊脂糖凝膠電泳，聚丙 烯酰胺凝膠電泳(PAGE)， 二維PAGE，等電聚焦，離子交換色譜，過濾色譜， 疏水色譜，高效液相色譜(HPLC),薄層色鐠(TLC)，氣相色譜，原子吸收， 親合色譜和梯度離心。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步更加優(yōu)選的實施方案，所述組份化方法可以是 其中兩個方法的組合或兩個以上分離方法的組合。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(l)中所述的距離、時 間，可以是包含生物標志物的組份化分子(群)在該組份化媒介中的遷移距 離、時間，也可以是包含生物標志物的組份化分子(群)在該組份化媒介之 外的遷移距離、時間。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(l)中所述的組份化方 法，可以根據(jù)系列的切分點進行.例如由相伴隨的分子量標準所指示的組份 的分子量的大小作為切分點進行。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，所述的主觀確定的系列組份分 界點可與伴隨的分子量標準呈線性,對數(shù)，或指數(shù)關(guān)系。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(l)中所述的一級設(shè)定 序列可以是所述的包含生物標志物的組份化分子(群)的自然形成序列，或 由任一方式重新安排的序列。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(2)中所述的回收方法
進行分離的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(2)中所述的回收方法 可以自動化方式進4亍。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(2)中所述的回收方法 可以使用相關(guān)試劑盒或者市場提供的商品化儀器來進行。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(3)中所述的包含生物
點樣儀器自動或不借助儀器手工進行。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(l)中所述的一級設(shè)定 序列排列的包含生物標志物的組份化分子上樣于步驟(3)所述的每個支持材料上的組份數(shù)量可以在2到500,000之間變化。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(3)中所述的包含生物 標志物的組份化分子(群)矩陣化上樣的步驟可以按照任意主觀序列或任意 次序進行。
根據(jù)本發(fā)明的一個更加優(yōu)選的實施方案，步驟(3)中的支持材料可以 從以下材料中挑選，包括但不限于硝酸纖維素、尼龍、塑料、玻璃、多孔 板及珠。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的支持材料可以進行電 荷或化學(xué)修飾操作以增強分子結(jié)合能力，這些操作包含但不限于聚賴氨酸 化、甲硅烷基化、硅烷化。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，步驟(4)中所述的探針分 子包括RNA(核糖核酸)，DNA(脫氧核糖核酸)，蛋白質(zhì)，抗體，或經(jīng)化學(xué) 修飾的蛋白，這種化學(xué)修飾的蛋白是指經(jīng)化學(xué)標記、螢光標記、放射同位素 標記或者質(zhì)譜分析的激光標記的蛋白質(zhì)探針。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的探針分子的孵育或雜 交過程可以手動操作或自動化進行。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的支持材料上與生物標 志物相互作用的探針分子數(shù)量的檢測步驟可以手動執(zhí)行，例如在組份化分 子(群)數(shù)量較少時在實驗室條件下使用膠片手工曝光，或者也可以使用儀 器進行，例如在支持材料上有較多組份化分子(群)可使用儀器如微點陣掃 描儀進行。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的包含生物標志物的組 份化分子(群)表達模式分析可以通過數(shù)學(xué)計算、計算機圖像處理和數(shù)據(jù)分 析等高通量方式處理并生成相應(yīng)數(shù)據(jù)庫。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的數(shù)學(xué)計算可以準確確
;列的包:生物標志物的組份化分子(群)的遷移-巨離或時:司t
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的計算機圖像處理及其
數(shù)據(jù)分析確定權(quán)利要求1步驟(l)中所述的以一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列
排列生物標志物分子的數(shù)量。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的計算機圖像處理及其
數(shù)據(jù)分析可以放大處理包含生物標志物的組份化分子(群)的微點陣圖像。根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的計算機圖像處理及其
數(shù)據(jù)分析所需的組份化分子的樣品數(shù)量比傳統(tǒng)的Western blot (免疫印跡)分 析或Northern Blot(RNA印跡)分析所需的樣品數(shù)量要少幾十甚至幾百倍以 上。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的包含生物標志物的組 份化分子(群)直接矩陣化上樣于支持材料將比傳統(tǒng)的Western blot (免疫印 跡)分析或Northern Blot(RNA印跡)分析會產(chǎn)生更強的信號和更高的檢測靈 敏度。
根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述的計算機圖^f象處理及其 數(shù)據(jù)分析的方法，可直接包含生物標志物的從組份化分子(群)中采集、分 析和轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的婆史據(jù)庫，而Western blot (免疫印跡)分析或Northern Blot(RNA印跡)分析無法做到。
根據(jù)本發(fā)明的另 一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供一種從相同組織(群) 或不同組織(群)的眾多分子(群)生成的包含生物標志物的分子組份的高 通量處理方法，其步驟包括
(1) 以可組份化的方式提供所述組織來源的包含生物標志物的眾多分子 組份(群)；
(2) 對于所述的包含生物標志物的眾多分子組份(群)依照其屬性以至 少 一種組份化方法對其進行組份化，使之成為 一個譜系排列或包含組份化分 子亞群的一系列包含生物標志物的分子組份，在其中，所述的分子組份譜系 或所述的一系列組份群依照其組份化方法的參數(shù)，如距離、時間、順序，以 特定的一級設(shè)定序列同時以相關(guān)來源組織(群)的次級設(shè)定序列在可以進行 組份化的媒介上進行組份化排列或表達；
(3) 從該組份化媒介中回收得到的經(jīng)組份化的包含生物標志物的系列 組份化分子(群)使所述回收到的每一個組份化的包含生物標志物的分子 組份(群)，都確保依照步驟(2)指定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列進行 分序和排列；
(4) 按步驟(2)所述特定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列，將相應(yīng)的 回收得到的包含生物標志物的系列組份化分子(群)以矩陣方式上樣于支持 材料上，使其可以以一種高通量方式被進一步操作。
根據(jù)本發(fā)明的另 一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供從眾多不同組織(群) 或相同組織(群)而來的生物標志物的一種高通量的表達模式檢測方法，所述方法包含以下步驟
(1) 以可被組份化的方式提供從上述大量不同組織(群)或相同組織(群)
而來的眾多包含生物標志物的分子組份；
(2) 對于所述的包含生物標志物的眾多分子群依照其屬性以至少一種組 份化方法或組合對其進行組份化，4吏之成為 一種譜系排列或包含組份化分子
(群)亞群的一系列包含生物標志物的分子組份，在其中，所述的分子組份 譜系或包含生物標志物的一系列組份(群)依照其進行組份化方法的參數(shù)， 如距離、時間、順序，以特定的一級設(shè)定序列同時以相關(guān)來源組織樣品的次
(3) 從該組份化介質(zhì)上回收經(jīng)組份化的包含生物標志物的系列分(群) 使所述回收到的每一個包含生物標志物的組份化的分子組份，都確保依照步 驟(2)指定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列進行分序和排列；
(4) 對每個所述的不同組織或相同組織重復(fù)步驟(2)和(3),使所有不同組 織或相同組織來源的包含生物標志物的分子組份都完成組份化過程和回收 過程；
(5) 根據(jù)步驟(2)所述特定的一級設(shè)定序列和次級序列將所述的從眾多
材料上，以進行步驟(6)的操作或進行后續(xù)操作；
(6) 選擇并設(shè)計適當?shù)奶结樂肿?，這種探針分子可以同矩陣化排列于步 驟(5)所述的支持材料上的生物標志物相互作用，以使前述眾多不同組織或相 同組織而來的生物標志物產(chǎn)生理想的表達模式；
(7) 分析并且對比從所述的眾多不同組織或相同組織而來的依照步驟(2) 所述的特定一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列排列的包含生物標志物的矩陣組 份化分子(群)的表達特點；
(8) 檢測和分析步驟(2)所述的生物標志物的屬性。 根據(jù)本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案，所述眾多不同組織樣品，包
括但不限于由人體或動物組織而來的血液、胎盤、膀胱、大腦、腦額葉、 腦海馬、腦枕葉、腦頂頁、腦顳葉、乳房、小腦、結(jié)腸、食道、心臟、腎臟、 肝臟、肺臟、肌肉、卯巢、胰腺、直腸、皮膚、小腸、十二指腸、小腸回腸、 小腸空腸、脾臟、胃、睪丸、扁桃腺、子宮宮頸和子宮宮體。
本發(fā)明是關(guān)于釆用微點陣矩陣化方式的高通量(HT)生物標志物分析 技術(shù)。包含生物標志物的分子依據(jù)其屬性被組份化處理并生成相應(yīng)的一級設(shè)定序列，并以相應(yīng)分子(群)的組織來源生成其次級設(shè)定序列，使每個組份 化的包含生物標志物的分子(群)可以實現(xiàn)尋址和溯源。依照一級設(shè)定序列 和次級設(shè)定序列以高通量方式對所述的包含生物標志物的組份化分子(群) 進行回收、矩陣點樣、分析檢測。生物標志物屬性可以被4全測和分析。本發(fā) 明同現(xiàn)有生物標志物分析方法相比，提供以下創(chuàng)新點高敏感性、包含生物 標志物的材料的低消耗、高通量的處理平臺、可以直接生成相應(yīng)數(shù)據(jù)庫進行 分析。
本發(fā)明涉及生物標志物高通量矩陣分析技術(shù)。本發(fā)明的高通量分析技術(shù)
在傳統(tǒng)生物標志物分析4支術(shù)例如Northern blot、 Western blot、 Southern blot 和protein 2-D blot的基礎(chǔ)上引入采用矩陣模式從而建立起一種高通量分析 技術(shù)。
生物標志物，無論是DNA、 RNA、蛋白、脂類或多糖分子，都是以其 分子量大小和電荷而分離組份化。從多種樣品而來的被分離組份化的分子 (群)，同時標記以一級設(shè)計序列和次級設(shè)計序列，也依照同樣的一級設(shè)計 序列和次級設(shè)計序列排列進行組份的回收，然后再點樣到支持材料上，依舊 以相同的一級設(shè)計序列和次級設(shè)計序列進行相關(guān)組份的排列。
為對本發(fā)明進行說明的方便，分子量或分子大小在此例中作為mRNA 和蛋白生物標志物的主要參數(shù)，據(jù)此特性分離相應(yīng)分子。對于不同的靶生物 標志物可以使用多種不同方法以使分子量或分子大小不易區(qū)分的mRNA和 蛋白生物標志物得到相對應(yīng)的區(qū)別和分析。生物標志物的分子量或者分子大 小在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯表達過程中是很關(guān)鍵的參數(shù)，在本發(fā)明中，眾多組織樣 品中以特別設(shè)定的 一級設(shè)定序列、次級設(shè)定序列來標記相關(guān)生物標志物用以 進行高通量分析相應(yīng)分子的表達模式及基因和蛋白表達水平。
本發(fā)明的適用領(lǐng)域包括但不限于升級替代傳統(tǒng)的Northern blot或 Western blot分析才支術(shù)，本發(fā)明還適用于由生物標志物不同屬性所決定的采 用多種不同組份化方法的生物標志物的多種不同的分才斤檢測。
本發(fā)明所涉及的生物標志物類型包括，但不限于核酸，(例如核糖 核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA))或cDNA 、蛋白、多肽、類脂、多糖。
本發(fā)明中所涉及的生物標志物分離組份化方法是指依照生物標志物的 一種或多種屬性而使其于其他分子相分離并產(chǎn)生一個譜系分子組份或一系 列分子組份的方法，這些方法包括但不限于瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺凝膠 電泳(PAGE)、雙向PAGE、等電聚焦、離子交換色譜、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜、原子吸收、親合色譜、梯度離心。利用以上 組份化方法，生物標志物由以下屬性而分離組份化分子量大小、電荷、有 機溶解性、親合力、質(zhì)量、形狀、密度及顏色等。本發(fā)明適用的分離組份化 方法包含全部使生物標志物與其他分子相區(qū)分并產(chǎn)生分子譜系或一系列分 子組^盼的方法。
本發(fā)明的 一個具體應(yīng)用是提供一種從相同或不同組織來源的生物標志 物分子(群)而來的生物標志物高通量分析方法。
第一步驟為組份化，是對于所述的多種生物標志物分子組份(群)依照其 相應(yīng)的分子屬性組份化而使之成為包含生物標志物的 一個i普系或一 系列組 份(群)的一個或多個組份化樣本。在進行組份化才乘作的同時或之前，包含 生物標志物的譜系排列或者系列都被設(shè)計為一級:沒定序列和次級設(shè)計序列。 一級設(shè)定序列可以依照相關(guān)分子以某一組份化方法在組份化媒介中所安排 或表現(xiàn)出來的順序，例如距離、時間或順序等相關(guān)參數(shù)來設(shè)定。用于設(shè)定基 本設(shè)定序列的距離或時間可以是包含生物標志物的組份化分子(群)在組份 化媒介的遷移泳動距離和時間或者是包含生物標志物的組份化分子(群)從 媒介中所遷移出的距離或時間?；驹O(shè)定序列是指以相應(yīng)系列組份在組份化 媒介(如凝膠)中任一自然發(fā)生的順序，或者是主觀重新設(shè)定的順序。
在本發(fā)明中，所指的包含生物標志物的組份化分子(群)可以是由各種 分子所具備的相似或不同屬性而采取的相似或不同分離組份化的方法處理 得到的由相似或不同的生物分子所組成的單 一體或混合物。
所述包含生物標志物的組份化分子(群)可以包括，但不限于以相應(yīng) 初始形態(tài)(如順序)或者后續(xù)操作方便而變更的形態(tài)并經(jīng)組份化處理及其回 收處理而得到的核酸(DNA, cDNAor RNA)、蛋白、多肽、類脂、多糖。組 份化分子(群)的屬性是指常被用于獲得理想的分子組份化形態(tài)的屬性，包 括但不限于分子量、電荷、溶解性、重量、密度、親合性、質(zhì)量、顏色。 適用于本發(fā)明的組份化方法可以是指由以下眾多的方法中所挑選出來的多 種分離方法，包括但不限于瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、雙 向PAGE、等電聚焦、離子交換色譜、過濾色譜、疏水色譜、高效液相色譜 (HPLC)、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜、原子吸收、親合色譜、梯度離心。 需要特別說明的是，本發(fā)明適用的組份化方法是能夠分離組份化生物標志物 相關(guān)分子組份(群)方法中的一種或者兩種以上及其組合。確切地說，當分 子組份(群)需要確定其區(qū)分位置時，可以主觀選擇使用如分子量等作為參置，包括使用分子量標準品的 線性、對數(shù)或者指數(shù)關(guān)系來確定分子組份的切分位置。
第二步驟為回收，分離組份化過程一經(jīng)完成，即可回收在組份化媒介上 的包含生物標志物的組份化系列分子組份(群)。
為了清楚地顯示和回溯所回收的包含生物標志物的組份化分子的特性及來 源，同時也為使高通量操作成為可能，每一系列包含生物標志物的組份化分 子的排列順序嚴格遵守該系列組份化分子(群)在回收時所設(shè)定的一級設(shè)定 序列和相應(yīng)的次級i殳定序列進行排列。
因此，含有生物標志物的系列組份化分子(群)擁有與組份化媒介上排 列或表現(xiàn)相同的"設(shè)計地址"。就此意義而言，本發(fā)明區(qū)別與其他技術(shù)的一 個獨特特點，即建立一種"可尋址，，機制，根據(jù)其相關(guān)性來追蹤、歸類相關(guān) 組份組群。之后，適用于高通量分析的支持材料上系列組份化分子的排列和 矩陣方式也依同理進行。在此需要說明的是，以上所述的回收步驟也可以主 觀進行。具體而言，回收步驟可以釆用全自動方式或者借助市場提供的商品 化工具或材料進行。
第三步驟為矩陣化排列，是對于包含生物標志物的系列組份化分子在支 持材料上按照一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列進行矩陣化排列的過程，以使系 列矩陣化的組份化分子可以依照序號而追溯其樣品組織來源及群組歸屬。對 于在支持材料上矩陣布置的包含生物標志物的組^P分化分子(群)的上樣過程 可以使用自動微型點樣儀器自動完成，也可以手工方式完成。本發(fā)明中每個 支持材料上以一級^L定序列和次級設(shè)定序列上樣的分子組份(群)的數(shù)目可
以為2個到500,000。
另外，上樣步驟可以按主觀序列進行。支持材料可以包括本行業(yè)眾多的 材料選擇。在本發(fā)明應(yīng)用中，本發(fā)明的支持材料包括但不限于硝酸纖維素、 尼龍、塑料、玻璃、多孔板或磁珠。本發(fā)明中，支持材料還可以進一步被電 荷處理或者化學(xué)處理使之具有結(jié)合增強分子，例如多聚賴氨酸或者曱硅烷基 化和硅烷化等支持材料。
第四步驟為設(shè)計和選撙，探針，是設(shè)計和選擇同吸附于支持材料上的包含
生物標志物的系列組份化分子(群)相互作用的揮:針分子。這個步驟進一步 包含對探針分子和吸附于支持材料上的包含生物標志物的組份化分子矩陣 進行孵育和雜交的過程。這種孵育和雜交的處理過程一經(jīng)結(jié)束，與支持材料上生物標志物相互作用的相關(guān)探針分子數(shù)量由其檢測方法確定，這種方法包
括化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法或者放射活性方法。
在本發(fā)明中，探針分子可以是進行化學(xué)標記、熒光標記、放射同位素標 記的RNA、 DNA、蛋白、抗體或者修飾蛋白。這個才企測過程可以是手工進 行，例如在包含生物標志物組份化分子(群)的數(shù)目較少時在實驗室條件下 釆用膠片曝光法，也可以采用相應(yīng)儀器來進行，例如當支持材料上具有較多 含有生物標志物的組份化分子點陣時使用微點陣閱讀儀。
第五步驟為分析回歸處理，本發(fā)明提供一個附加的應(yīng)用是一種依照其一 級設(shè)定序列與次級設(shè)定序列對于含有生物標志物的組份化分子(群)的表達 模式進行分析和回歸的步驟。這種對于含有生物標志物的系列組份化分子表 達模式的優(yōu)選應(yīng)用是借助于計算機化圖像和數(shù)學(xué)分析計算以高通量形式生 成所需數(shù)據(jù)庫。這種數(shù)學(xué)計算分析可以精確測算一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序 列的含有生物標志物系列組份化分子(群)在組份化媒介之中或之外的遷移 距離和時間，這種計算機圖像和數(shù)字化分析可以精確測算基本和次級設(shè)定序 列的含有生物標志物的系列組份化分子數(shù)量。進一步地，這種計算機圖像和 數(shù)據(jù)分析可以放大含有生物標志物的系列組份化分子(群)的微陣列點的圖 像。因此，由于計算機化圖像和數(shù)據(jù)處理的應(yīng)用，本發(fā)明中所需的組份化分 子數(shù)量將遠少于傳統(tǒng)Northern blot分析或Western blot分析。同時，與傳 統(tǒng)的Northern blot分析或Western blot分析方法相比，本發(fā)明中含有生物 標志物的系列組份化分子上樣于支持材料可以提供更強信號從而顯著加強 檢測靈敏度。
由于計算機化的圖像處理和數(shù)據(jù)采集可以直接采集、分析并實現(xiàn)生物標 志物組份化分子(群)信息向數(shù)據(jù)庫的轉(zhuǎn)換。由于本發(fā)明可以從大量組織樣 品而來，例如多種不同或相同組織樣品而來的生物標志物系列組^f分化分子 (群)高通量分析處理平臺，本發(fā)明優(yōu)于傳統(tǒng)Northern blot分析或Western blot分析，具有它們不具備的優(yōu)勢。
本發(fā)明的一個具體應(yīng)用是提供一種從相同或不同的組織樣品的含有生物 標志物的眾多分子(群)的高通量操作方法。這種方法包括如下步驟
(1 )提供來源于相同或不同組織樣品適用于組份化方法的含有生物標 志物的大量分子(群)；
(2)使用至少一種組4分化方法將眾多含有生物標志物的分子(群)組 份化為一個譜系或者包含系列組份化分子亞群的系列組份(群)，所述的含有生物標志物的系列分子組份(群)設(shè)定以相應(yīng)一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序 列，其中一級設(shè)定序列依照相應(yīng)的組份化方法、根據(jù)組份化4某介的組份化參
數(shù)，如距離、時間、或者組^階順序而i殳定；
(3 )以相同的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列從該組4分化々某介上回收所 述的含有生物標志物的系列分子組份；以及
(4)為下一步操作方便，以步驟(2)中相同的一級設(shè)定序列和次級設(shè) 定序列將組份化分子群矩陣排列在支持材料上。
本發(fā)明的另 一個具體應(yīng)用是提供一種高通量地評估眾多不同組織起源 不同含有生物標志物的分子組份群的表達模式的方法。確切而言，這種方法 可以比較不同組織來源的分子組份(群)，這種組織來源可以是從不同的細 胞系或不同的組織。因為使用相同的處理方法處理所有的分子組份(群)， 所以本發(fā)明是高通量地評估眾多不同組織來源的含有生物標志物的相應(yīng)分 子(群)的特異表達模式和特異生物活性的一種優(yōu)異方法。
在實踐中，本方法提供多種不同來源適宜組份化方法的含有生物標志物 的分子組份群；對于所述的組織如一個組織而來的含有生物標志物的不同分 子組份(群)進行組份化，依照其相應(yīng)屬性，并使用所述的至少一種組份化 方法，使所述的分子組份(群)組份化成為一個譜系或一系列包含亞群的系 列分子組份(群)。此處所述含有生物標志物的每一譜系或者系列組份(群) 是指以一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列而設(shè)定標記的，此一級i殳定序列是指在 組份化媒介中依照參數(shù)如距離、時間或者相應(yīng)排列設(shè)定的序列，次級設(shè)定序 列是指按照該組^f分樣本的組織來源而設(shè)定的序列(例如血液樣品l、血液 樣品2、血液樣品3等)；重復(fù)組份化操作以使上述不同來源的含有生物標志 物的分子組份(群)全部被分離組份化；從所述組份化媒介上回收一個組織 來源的含有生物標志物的一系列組份(群)，并且確保每個分子組份都以相 應(yīng)的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列都被全部回收；重復(fù)回收步驟，將所述的 不同組織來源的含有生物標志物的系列組份化分子進行回收操作；為進行下 一步操作，必須將所述的不同組織起源的含有生物標志物的系列組份化分子 (群)以相應(yīng)的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列矩陣化上樣于支持材料；設(shè)計 和選擇于支持材料上的不同組織來源的含有生物標志物的系列組份化分子 (群)相作用的適宜探針分子，以獲得不同樣品來源的矩陣化排列的生物標 志物的的理想4全測表達模式；同時可以對所述眾多不同樣品來源的以一級設(shè)呈現(xiàn)的特征模式進行相應(yīng)的分析和比較。
下面，結(jié)合本發(fā)明的i殳計構(gòu)思，進一步地詳細"i兌明本發(fā)明
本發(fā)明為生物標志物高通量(HT)分析提供一種解決方法，例如生物 樣品中核酸生物標志物或蛋白生物標志物的矩陣化分析。在本發(fā)明的優(yōu)選 具體應(yīng)用中，對信使RNA(mRNA)生物標志物或者蛋白生物標志物進行表達 和分析，用以說明本發(fā)明的內(nèi)涵。
矩陣化HT Northern blot和矩陣化HT Western blot，作為本發(fā)明的兩種 具體應(yīng)用，對信使RNA(mRNA)生物標志物和蛋白生物標志物進行高通量 (HT)分析。然而，在本發(fā)明的具體應(yīng)用中，含有生物標志物的組份化分 子(群)的轉(zhuǎn)移過程同當前傳統(tǒng)的Northern blot或Western blot方法有才艮本 不同。
本發(fā)明的概念由圖1所示，此流程圖顯示HT Northern/Western blot分析 中的主要步驟
1、組4分化分離
多種組織來源的含有生物標志物的蛋白或mRNA以凝膠電泳的方式組 份化分離，以圖中描述的方式將含有生物標志物的凝膠中所包括的各組份 (群)分離成為適宜形態(tài)的許多個組份。
例如，在圖l所示的具體應(yīng)用中，從血液組織而來的含有生物標志物的 蛋白或mRNA不同組份被組份化分離為20個組份。由在凝膠中所表現(xiàn)的初 始距離和順序(參數(shù))來對應(yīng)生成凝膠中各組份的序號。因而，以一級設(shè)定 序列標記相應(yīng)每一組^分，則每一標記序號(一級i殳定序列)所對應(yīng)的組份都 可以用序號來追溯其起源，因而凝膠中的各組份群以初始泳動遷移距離和前 后條帶序列順序生成其記錄序號并可以實現(xiàn)尋址回溯的功能。
在對每一組份標記設(shè)定一級設(shè)定序列的同時，在凝膠中每一組份也生成 次級設(shè)定序列(可以是數(shù)字、符號、縮寫或者字母)，用于特指此組份(或 者組份化分子)的組織或者細胞起源。如果出現(xiàn)了較多標本數(shù)量或者較多相 異組織標本起源，例如，樣品可以分別來自不同組織捐獻者的血液樣品，次 級設(shè)定序列在本發(fā)明的高通量分析中必不可少。
本發(fā)明用來描述的具體應(yīng)用可以包括，但并不限于將上述的組份化過 程重復(fù)地應(yīng)用于不同樣本，以產(chǎn)生進一步分析處理所需的不同的含有生物標 志物的組份化分子(群)組。在本發(fā)明的具體應(yīng)用中，以圖l所示，對含有 生物標志物的血液蛋白質(zhì)樣品，來源于31個不同的組織捐獻者以相同方式進4亍31次處理。
為了對所述的眾多不同組織的大量組織標本進行準確和高通量的處理P 歸的都至關(guān)重要。
基于圖1膜上所示的組份(群)或組份化分子(群)的空間安排和布置，
相應(yīng)地，所有的組份或者組份化分子可以由公式Fxyi得到標示和追溯，這里 F就是所指定的組份，x指代次級設(shè)定序列，相關(guān)于組份的來源，yi指一級 設(shè)定序列，相對于初始在凝膠中的泳動距離、順序或組《分時間，y;中的i 可以是l ， 2， 3, ....n;由凝膠中分離的組份數(shù)目所決定。
由此，整個高通量的處理過程中每一組份都標記以 一級設(shè)定序列和次級 設(shè)定序列，這種標記將確保對不同組織的大量樣本的處理在整個過程是有條 理和準確的。
2、 組份化樣本回收
在凝膠組份中的含有生物標志物的組份化分子(群)可使用膠回收或溶 解回收等方式回收。
3、 矩陣化點樣
從某一組織標本如一個血液捐獻者而來的一組系列組份化分子(群)以 上述在凝膠中所表現(xiàn)的序列及其組織起源或類型的序列(即一級設(shè)定序列和 次級設(shè)定序列)矩陣化點樣于顯微鏡載玻片所支持的雜交膜上。
如圖1所示，在本發(fā)明的優(yōu)選的具體應(yīng)用中，多種不同的組織標本的多 組系列組份化分子可以被集成在一張膜上。
同集成于雜交膜的來源于多種不同樣品的含有生物標志物的組份化 RNA或蛋白相互作用的探針分子可揭示出在雜交膜上的生物標志物表達模 式。生物標志物的關(guān)鍵參數(shù)如分子量和片段大小，在這種檢測中可以檢測和 預(yù)計。
為進一步應(yīng)用、比較和分析的便利，不同樣品而來的含有生物標志物的 組份分子(群)以完全一致的方式重復(fù)進行上述的分離、回收、點樣過程，. 如圖1，這31個從不同組織捐獻者而來的組織樣品以相同方式進行31次處 理，以進行HT Western blot和進一 步分析。
以上所述，本發(fā)明的具體應(yīng)用中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)是含有生物標志物的各 組份的安排、格式和點樣，從凝膠條上所回收到的系列組份依照其一級設(shè)定 序列和次級設(shè)定序列完成在支持材料上的矩陣制備。在此強調(diào)，如需制備更多的血液樣品，在制備高通量Western blot時， 使用高密度點陣設(shè)備時可以在膜上集成更多的樣品，然而，為了對本發(fā)明的 技術(shù)要旨進行明白易懂的解說，此處只用了有限的人血液樣品量來闡述本發(fā) 明的內(nèi)涵。人血液捐獻樣品而來的生物標志物高能量檢測可以使用各種探查 方法，如抗體或者大規(guī)模質(zhì)語法。
如上所述，本發(fā)明可以直接應(yīng)用于Northern blot分析Western blot分析 等方法中。盡管不同生物標志物之間，不同組份化方法之間，不同分子的組 份化屬性之間存在諸多根本不同，但Northern blot和Western blot分析的共 同點是含有生物標志物的分子(群)可以被組份化為一個i普系或系列組份 (群)。
本發(fā)明的核心技術(shù)要旨是將含有生物標志物的組份化i普系或系列組份 (群)轉(zhuǎn)化為矩陣格式，以進行高通量分析處理，因而眾多的含有生物標志 物的相關(guān)分子(群)只要能滿足被相應(yīng)的組份化方法進行組份化處理為一個 i普系或系列組份(群)，就是本發(fā)明的適合的應(yīng)用范圍。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的明顯優(yōu)點
本發(fā)明將分子組份化技術(shù)優(yōu)勢和微陣列、巨陣列大規(guī)模分析的高通量優(yōu) 勢相結(jié)合。在傳統(tǒng)的分子組份化技術(shù)基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供更經(jīng)濟和靈敏的對 寶貴樣品進行^r測的 一個方法。
本發(fā)明最重要的一個特征是可以高通量分析處理來源于大量樣品的含 有生物標志物的分子組〗分(群)，例如在一個微陣列或者大規(guī)^莫陣列上分析 某一特定生物標志物在上百種不同組織中的剪切選擇表達模式及分子量大 小。
進一步地，本發(fā)明可以實現(xiàn)含有生物標志物的分子組份(群)相關(guān)信息 的數(shù)字化采集處理，由矩陣閱讀儀器直接記錄并轉(zhuǎn)換生成相關(guān)生物標志物數(shù) 據(jù)庫，數(shù)據(jù)分析可以結(jié)合微陣列檢測技術(shù)平臺同步進行。
具體地，例如 -使用計算機圖像處理及其數(shù)據(jù)分析所需的組份化分子的
所需數(shù)量要少很多；所述的包含生物標志i的組份化分子(群)直接矩陣化 上樣于支持材料將比傳統(tǒng)的Western blot (免疫印跡)或Northern Blot(RNA印 跡)分析會產(chǎn)生更強的信號和更高的檢測靈敏度；所述的計算機圖像處理及 其數(shù)據(jù)分析的方法，可直接包含生物標志物的從組份化分子(群)中采集、 分析和轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫，而Western blot (免疫印跡)或Northern Blot(RNA印跡)分析無法做到。
為使本發(fā)明的內(nèi)涵以及各種特征可以被更好地理解，我們將結(jié)合附圖來 詳細說明本發(fā)明的實施例，從而便于本發(fā)明優(yōu)先選用的具體運用作詳細描
述。其中
圖1為本發(fā)明的高通量生物標志物的印記分析方法的流程示意圖；圖中 示出了 HTS Western/Northern blot分析中的主要步驟，具體地，不同組織來 源的蛋白或mRNA在凝膠電泳中被組份化分離區(qū)隔為多個含有生物標志物 的組份群(在本應(yīng)用例中數(shù)目是20)，進而使用膠回收或者溶解技術(shù)回收含 有生物標志物的各組份化分子(群)； 一種組織，如肌肉組織而來的組份化 的一組系列分子可以以矩陣方式并按照回收前其在凝膠中所呈現(xiàn)順序矩陣 化上樣于顯微鏡載玻片所支撐的雜交膜上，同樣方式由多種不同組織，例如 供體l、供體2、供體3等可以矩陣化方式上樣排列在一張雜交膜上。
圖2顯示使用凝膠電泳法將包含生物標志物的蛋白和包含有生物標志物 的mRNA進4亍組化分離，同時^使用蛋白分子量標準和RNA分子量標準和測 量尺作為分子量大小的指示；具體地，在聚丙烯酰胺凝膠上的含有生物標志 物的蛋白電泳和在瓊脂糖凝膠上的含在生物標志物的mRNA電泳，其中8mg 人血液蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠進行分離組份化，mRNA在1%曱醛瓊脂 糖上進行分離組傷M匕；mRNA的分布在凝膠中部最多，RNA分子量標準和 測量尺用來測量RNA組份(群)的分子量。
圖3為甲醛1%瓊脂糖凝膠電泳的分子遷移泳動距離與mRNA分子量的 相互關(guān)系曲線；該圖顯示mRNA電泳中的mRNA遷移泳動距離(厘米計) 與分子量大小(核酸數(shù)目)存在一個指數(shù)關(guān)系，此兩種系數(shù)曲線配合系數(shù)為 R2=0.9917;
圖4為從系列凝膠薄片回收得到的組份化mRNA的回收量曲線；該圖 顯示20個組份分別經(jīng)紫外分光光度計所測定的回收量，組份8到20與組份 1到7相比含有更多的mRNA，這與圖2中所示的mRNA在不同區(qū)段的分布 相一致。
圖5為人胎盤組織的組份化mRNA各組份的瓊脂糖凝膠電泳圖；該圖 顯示人胎盤mRNA各組份的相對含量和組份分子量的大小，其中組份8到 20含有比其它組《分更多的mRNA數(shù)量，這與圖2所示的mRNA在凝膠中的不同區(qū)段的分布相一致。
圖6為32個組織的Northern blot高通量分析圖；該圖顯示利用高通量 Northern blot分析從31個不同組織中所制備的mRNA樣品所顯示的相對基 因表達比較，雜交膜的大小與顯微鏡載玻片相同，雜交信號強弱不同指示 GAPDH基因在這些組織的表達水平的高低；
其中，圖6.A,是高通量Northern blot的實際尺寸大小(lx2英寸)，而 圖6.B.為棵眼觀察而準備的9倍放大點樣的組織從左到右分別是l.胎盤；2.陰性對照；3.膀胱；4大腦； 5腦額葉；6.腦海馬；7.腦4先葉；8.腦頂葉；9.腦顳葉；IO.乳腺；ll.小腦； 12.結(jié)腸；13.食道；14.心臟；15.腎臟；16.肝臟；17.肺；18.肌肉；19.卵 巢；20』夷力泉；21.胎盤；22.直腸；23.皮膚；24.小腸十二指腸；25.小腸回 腸；26.小腸空腸；27.脾臟；28.胃；29.睪丸；30.扁桃腺；31.子宮宮頸； 32.子宮宮體。
圖7顯示從血液樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳組份化方法獲得含有生物標 志物的組份化蛋白分子的方法，在聚丙烯酰胺凝膠小分子量蛋白質(zhì)分子及多 肽分子被良好地分離，并被濃縮，來源于血液的蛋白質(zhì)生物標志物是多肽及 小分子蛋白質(zhì)。
圖8為32個組織的Western blot高通量分^f圖；該圖顯示30種不同人 類組織的高通量Western blot的GAPDH蛋白的表達模式；人類30種不同組 織所得到的總蛋白被組份化分離后進行回收操作，以相應(yīng)的一級設(shè)定序列和 次級設(shè)定序列將回收到的組份化蛋白上樣于相應(yīng)雜交膜上，高通量Western blot分析中的GAPDH信號以其相應(yīng)分子大小出現(xiàn)在預(yù)定的組份；
其中，圖8.A是采用化學(xué)發(fā)光底物進行的高通量Western blot篩選，圖 8.B是采用熒光染料方法的高通量Western blot篩選；
圖8中，所述組織從左到右依此為l.分子量標準；2.胎盤；3.陰性對 照；4.脂肪；5.膀胱；6大腦；7.乳腺；8.小腦；9.子宮頸；10.結(jié)腸；11. 橫隔膜；12.十二指腸；13.食道；14.膽嚢；15.心臟；16.回腸；17.空腸； 18.腎臟；19.肝臟；20.肺;21.卵巢；22.胰腺;23.直腸;24.骨骼肌；25, 皮膚；26.脾臟；27.胃；28.睪丸；29.胸腺；30.曱狀腺；31.扁桃腺；32. 子宮。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。必需指出，這些實施例僅限 于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條 件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。
實施例中所涉及的設(shè)備、材料舉例如下1)微點陣相關(guān)設(shè)備A32針 載玻片點樣機(VP478A)及其附件， 一個索引單元(VP470)和手持式微芯片 點樣系統(tǒng)(VP472A)，美國V&P Scientific (SanDiego,CA)購買；2)全凝膠 洗膠儀(165-1251):美國伯樂公司(Hercules, CA); 3) RNaid:從Qbiogene (Carlsbad，CA)購買，用于/人凝月交上回收mRNA; 4)雜交膜Hybond N+(正 電荷尼龍膜)Amersham Biotech; 5)PCR試劑盒、DNA聚合酶和PCR緩沖 液Promega公司(Madison, WI); 6)雜交液配方來源于Church and Gilbert (Church, 1984)，包含以下1% BSA, 0.5M磷酸鈉緩沖液pH 8.0，和7%十 二烷基硫酸鈉(SDS); 7)檢測試劑盒CDP-starAP底物和抗熒光素AP耦 合抗體(Cat. No. 1064285)從Amersham Biotech購買；8) 0.24-9.5 Kb RNA ladder (Cat No. 15620-016)從Life Technologies購買；9)熒光素-12-dUTP (Cat. No. 1373242) A人Roche Molecular Biochemicals購買。
實施例1
本實施例提供一種高通量核酸印記法(HT Northern blotting),其制備與 分析過程包含以下步驟
1) mRNA的分離與純化；
2) 有RNA分子量標準的mRNA瓊脂糖凝膠電泳；
3 )基于RNA分子量標準電泳遷移的mRNA分子量計算；
4 )帶有mRNA的瓊脂糖凝膠被切分為凝膠組份膠條；
5)依據(jù)每個凝膠切片在瓊脂糖凝膠中的距離與順序等標記組份的一級 設(shè)定序列，依據(jù)mRNA來源組織標記組份的次級設(shè)定序列； 6 )從相應(yīng)的凝膠條中抽提回收組份化的mRNA;
7) 依據(jù)相應(yīng)的凝膠條組份生成的一級設(shè)定序列和相關(guān)組織來源生成的 次級設(shè)定序列在相應(yīng)支持組織上點樣組份化mRNA;和
8) 依照相應(yīng)的組份凝膠條的一級設(shè)定序列及其組織來源而定的次級設(shè) 定序列進行HT Northern blotting的數(shù)據(jù)分析。
具體地，由以下提供的本應(yīng)用實施例l及其相應(yīng)數(shù)據(jù)將進一步說明上述操作步驟
步驟l)、首先，將來自31種不同人體組織的mRNA分離并應(yīng)用于帶有 RNA分子量標準的瓊脂糖凝膠電泳。
步驟2)、圖2顯示一個蛋白樣本或mRNA樣本同蛋白分子量標準或 RNA分子量標準一起上樣于聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠，設(shè)置一個標尺作為 蛋白或RNA分子量標準與蛋白或mRNA樣品遷移的定量依據(jù)。
步驟3)、圖3所示mRNA分子量與mRNA遷移距離的可以量化并建立 相應(yīng)數(shù)學(xué)模型。
步驟4 )和5 )、含mRNA的瓊脂糖凝膠被組份化為20個組份，從第一 個凝膠條帶到最后一個凝膠條帶依照其距離關(guān)系標記為一級設(shè)定序列。
步驟6)、每一膠條帶進行回收操作得到相應(yīng)mRNA組份樣品，從凝膠 中mRNA膠回收^f到的組^分化mRNA樣品的平均回收率為43%。圖4和圖 5顯示每個組份mRNA具有與預(yù)計相符的分子量和^:量。
步驟7 )、 mRNA組份的樣本制備完成后可以進行上樣操作
在本發(fā)明優(yōu)選的具體應(yīng)用中，此應(yīng)用例中同時使用了 VP Scientific的設(shè) 備來制備低密度的點陣，每一針吸取5到lOnl溶液點樣于支持材料，如圖 1所示，按照其在分離組份化的凝膠條的過程中所生成和記錄的一級設(shè)定序 列和次級設(shè)定序列，從第一個組織捐獻者而來的含有生物標志物樣品的全部 20個蛋白組份上樣于第一列。依照此法，從第二個組織捐獻者而來的含有生 物標志物20個組也依照其一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列被點樣。其余的29 個不同人類組織捐獻者而來的組織樣品按照以上方式重復(fù)處理并點樣。從31 個不同人類組織捐獻者的樣品和一個陰性對照而來的含有生物標志物的各 蛋白質(zhì)組份，以一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列設(shè)計和排列在支持材料上。如 圖1所示，每個組織來源的含有生物標志物的蛋白組份群都包含20個組份， 這些組份按照其順序在相應(yīng)的膜上點樣為20個點，排成一列。重復(fù)相同的 以上步驟32次使31種不同樣品來源的含有生物標志物的蛋白組份和一個陰 性對照排列成32列。含有生物標志物的蛋白質(zhì)組份來源于31個不同的人體 組織捐獻者以及一個陰性對照^皮依次標記為次級設(shè)定序列，在膜上完成各組 份的點樣和固化后即制備完成。
步驟8)、在本發(fā)明的具體應(yīng)用中， 一個GAPDH探針應(yīng)用于制備完成 的HT Nothern Blot，如圖6所示，次級設(shè)定序列所示的31種不同人體組織 中的第13個組份呈現(xiàn)出各種強弱不同的信號，依照組份凝膠條所記錄的一級設(shè)定序列及其所代表的不同凝膠條的樣品遷移距離，mRNA組份13的分 子量約為1.5 x 1000個核香酸，這與GAPDH的mRNA大小相符，依照mRNA 分子量可以完成相關(guān)分子的分離組份化，而在此過程中相關(guān)分子的分子量屬 性則可以被探測和確認。在本發(fā)明的具體應(yīng)用中，依照一級設(shè)定序列和次級 設(shè)定序列在一致的實驗背景下所制備的高通量Northern Blot可以高通量地 同時分析多種基因的大小及其表達模式。HT Northern Blot分析的圖像數(shù)據(jù) 可以直接從微點陣掃描器中讀取并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號存入相應(yīng)數(shù)據(jù)庫。
見圖6B所示，計算機處理圖像所示的各個組織的微陣列可以被放大， 以便像傳統(tǒng)Northern Blot —樣進行肉眼觀察。
實施例2
本實施例提供一種高通量蛋白印記法(HT Western Blot)。制備高通量 Western Blot的原則與高通量Northern Blot原則是一樣的，雖然組4分化分離 蛋白分子的方法不同。本實施例提供一種高通量核酸印記法(HT Northern blotting),其制備與分析過程包含以下步驟
1) 蛋白的提取和組份化分離；
2) 有蛋白分子量標準的蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳；
3) 基于蛋白分子量標準電泳遷移的蛋白分子量計算；
4) 帶有蛋白的聚丙烯酰胺凝膠被切分為凝膠組份膠條；
5) 依據(jù)每個凝膠切片在聚丙烯酰胺凝膠中的距離與順序等標記組份的 一級設(shè)定序列，依據(jù)蛋白來源組織標記組份的次級設(shè)定序列；
6) 從相應(yīng)的凝膠條中抽提回收組份化的蛋白；
7) 依據(jù)相應(yīng)的凝膠條組份生成的一級設(shè)定序列和相關(guān)組織來源生成的 次級設(shè)定序列在相應(yīng)支持組織上點樣組份化蛋白；和
8) 依照相應(yīng)的組份凝膠條的一級設(shè)定序列及其組織來源而定的次級設(shè) 定序列進行HT Western Blot的lt據(jù)分析。 <
具體地，由以下提供的本應(yīng)用實施例2及其相應(yīng)數(shù)據(jù)將進一步說明上述 操作步驟
步驟1 )、從水凍的人體組織中使用包含清潔劑和蛋白酶抑制劑混合物的 勻漿緩沖器來提取總蛋白。
步驟2)、如圖1所示1.25mg組織總蛋白上樣于20 %的Tris-glycine SDS-PAGE凝膠中(Bio-Rad Laboratories)進行蛋白組份化分離。步驟3)、凝膠中的蛋白組份可以通過不同方法進行回收，比如像在HT Northern Blot那樣從凝膠條中萃取,或者通過專用儀器從凝膠中電轉(zhuǎn)移出來。 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的具體應(yīng)用中，使用全凝膠洗脫儀(Bio-Rad Laboratories) 來洗脫凝膠中的組份化蛋白。洗脫緩沖液中包含25mMTris-HCl、 192mM甘 氨酸、0.1%SDS。洗脫的蛋白組份通過真空吸引來收集，此步J^中，30種不 同的人體組織的組份使用 一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列來標記。蛋白組份液 體使用Amicon (Millipore)試管濃縮達到相同體積。為寫全證分離的蛋白組份， 回收的蛋白組份在同樣條件的凝膠中進行相同條件的電泳，
步驟4 )、使用同樣的微點陣設(shè)備按照一級設(shè)定序列將蛋白組份連續(xù)地點 樣于雜交膜。根據(jù)設(shè)計并記錄的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列，不同人體組 織來源的蛋白組傷"故回收和矩陣化點樣于膜上。
步驟5)、在HT Western Blot分析的應(yīng)用例中，管家基因甘油醛-3-磷 酸鹽脫氫酶(GAPDH)被作為目標蛋白檢測。使用含5 %脫脂牛奶的TBST( 0.1 %Tween20inTBS)封閉液封閉雜交膜抗原結(jié)合表位，小鼠抗GAPDH單克 隆抗體(MAB374， Chemicon International)被加入TBST溶液中4攝氏度過 夜孵育。在三輪TBST清洗后，加入二抗HRP (辣根過氧化物酶)偶連的抗 鼠IgG (NA931, Amersham Biotech )或CY3偶連的抗鼠IgG,圖8A是使 用ECL-Plus試劑(Amersham Biotech)的顯色結(jié)果，圖8B是使用微點陣 閱讀儀所顯示的結(jié)果。
圖8顯示32道HT Western Blot —個應(yīng)用實例，使用從30種不同組織 中所回收到的蛋白組份。這些組織從左到右分別是1,分子量標準。2,胎 盤。3，陰性對照。4,脂肪。5,膀胱。6，腦。7,胸部。8,小腦。9，子 宮頸。10,結(jié)腸。11，橫隔膜。12,十二指腸。13，食道。14，膽。15,心 臟。16,回腸。17,空腸。18,腎。19，肝臟。20,肺。21,卵巢。22，胰 腺。23,直腸。24,骨骼肌。25，表皮。26,脾。27,胃。28,睪丸。29, 胸腺。30,曱狀腺。31,扁桃腺。32，子宮。
同預(yù)期的GAPDH蛋白38 kDa的分子量相一致，依照一級設(shè)定序列， 在24個組份中的第16組份中GAPDH蛋白被檢測出來。依照分子量完成相 關(guān)分子的分離組份化，而在此過程中相關(guān)分子的分子量屬性則可以被探測和 確認。如圖所示，依據(jù)次級設(shè)定序列，不同強度的一系列信號變化顯示了 30 種不同人體組織中表達的GAPDH蛋白的不同高低水平。綜合上述兩個實施例可以看出，由于采用微點陣矩陣模式，顯而易見本 發(fā)明的具體應(yīng)用具有高通量的處理能力。
圖6和圖8分別顯示了本發(fā)明的高通量Northern Blot和高通量Western Blot的兩個具體實施例。傳統(tǒng)的方法通常10個樣品集成在一張2x4英寸的 雜交膜上，與傳統(tǒng)方法相比較，本發(fā)明具體實施例中的32個樣品的組份化 分子點樣于一張lx2英寸的雜交膜。
但是，此處應(yīng)該特別強調(diào)的是，依照本發(fā)明的技術(shù)要旨，樣品的實際應(yīng) 用數(shù)量不受以上實施例的限制。例如， 一個高密度的微點陣可以在每張膜上 集成超過500，000點。因此，本發(fā)明的具體應(yīng)用中，參照樣品可^t處理的組 份數(shù)量，本發(fā)明的具體應(yīng)用在更高密度的微點陣中可以提供更高通量的分析 處理能力，例如，每一樣本被組份化為50個組份，來自10,000樣本的分子 組份可以被集成在一張雜交膜上。
因此，本發(fā)明的具體應(yīng)用HT Northern Blot和HT Western Blot可以提供 更高通量的處理、分析能力，比如，10,000個組織樣品而來的分子組份可 以集成于一張膜上.進一步而言，在本發(fā)明的具體應(yīng)用中，高通量分析產(chǎn)生 的大量數(shù)據(jù)可直接通過微點陣掃描儀閱讀并轉(zhuǎn)換生成相應(yīng)數(shù)據(jù)庫，這些特點 對于傳統(tǒng)Northern Blot或Western Blot分析而言，是本發(fā)明的一個創(chuàng)新點。
通過以上對于本發(fā)明的具體應(yīng)用及具體實施例的描述，本發(fā)明的技術(shù)要 旨可以概括為，4吏用纟敖陣列或超級陣列等方式對相關(guān)生物標志物進行高通量 的分析處理。本發(fā)明將分子分離組份技術(shù)的優(yōu)勢和微陣列和超級陣列的優(yōu)勢 相結(jié)合，所產(chǎn)生新的優(yōu)勢超越了傳統(tǒng)分子組份技術(shù)的局限。另一方面，在傳 統(tǒng)分子組份化技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還創(chuàng)造出一種更敏感和更節(jié)省寶貴原材 料的方法。進一步而言，在本發(fā)明的具體應(yīng)用中，組份分子群可以通過多種 方法探測，包括但不限于核酸雜交，抗體結(jié)合，質(zhì)譜測定等。本發(fā)明的一 個最重要的優(yōu)勢是可以對百計或千計以上的樣本進行高通量處理和分析，如
擇剪切模式。而且，關(guān)于包含生物標志物的分子組份的信息可以數(shù)字化直接 從微陣列掃描儀閱讀并轉(zhuǎn)換存入數(shù)據(jù)庫，并使數(shù)據(jù)處理在一個微陣列技術(shù)平 臺上高通量進行。目前，沒有已知的其他技術(shù)方法可以達到這種技術(shù)要求。 因此本發(fā)明對于分子組份分析，特別是針對Northern /Western blot分析技術(shù) 是一種創(chuàng)新性變革。
本發(fā)明以上述優(yōu)選具體實施方式
詳細地描述了本發(fā)明的技術(shù)要旨。但是，對于所屬技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員而言，本發(fā)明上述優(yōu)選的具體實時方 式可以被進一步改編或^務(wù)改以用于新的應(yīng)用目的，并不與本發(fā)明的基本精神
實施方式。進一步地，本發(fā)明的應(yīng)用范圍還包括了各種基于相同操作原則的 對于本發(fā)明的修改及相似的安排。因而，對于本發(fā)明的權(quán)利要求書所要求的 保護范圍應(yīng)給予最廣泛的解釋，以涵蓋所有這些對本發(fā)明的修改或相類似的 應(yīng)用范圍。
權(quán)利要求
1.一種對于包含生物標志物的樣本進行高通量分析的方法，所述方法包括如下步驟(1)、將包含生物標志物的原始樣本以能夠分離所述生物標志物的方法進行組份化，并依照其進行組份化方法所產(chǎn)生的參數(shù)所設(shè)定的一級設(shè)定序列和根據(jù)所述樣本來源所設(shè)定的次級設(shè)定順序，使得到的包含生物標志物的組份化樣本在組份化介質(zhì)上進行排列或表達，優(yōu)選地，所述樣本來源為組織來源；(2)、從所述組份化介質(zhì)上回收所述組份化樣本，使回收得到的每一個組份化的樣本，都確保依照步驟(1)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列進行分序和排列；(3)、按照步驟(1)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列，將所回收到的包含生物標志物的組份化樣本在支持材料上進行矩陣排列即矩陣化上樣，所述支持材料優(yōu)選選自硝酸纖維素、尼龍、塑料、玻璃、多孔板和珠；(4)、對所述矩陣化上樣的樣本進行高通量分析，從而對所述生物標志物進行檢測、分析和/或預(yù)測；優(yōu)選地，所述高通量分析為對所述矩陣化上樣的核酸樣本進行Northern blot分析或?qū)λ鼍仃嚮蠘拥牡鞍讟颖具M行Western blot分析。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法為檢測來源于眾多 不同或相同組織的生物標志物的表達模式的高通量檢測方法，所述方法包括 對每個不同或相同組織來源的樣本重復(fù)步驟(1)和(2), ^使所有不同或相同組 織來源的包含生物標志物的樣本都完成組份化過程和回收過程。
3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述生物標志物的類型 包括核酸如核4唐核酸(RNA )、脫氧核糖核酸(DNA)和/或cDNA,蛋白， 多肽，脂質(zhì)和/或多糖。
4. 權(quán)利要求l-3任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(l)的組 份化處理，是以生物標志物分子的自身屬性優(yōu)選為生物醫(yī)學(xué)屬性來分離為以 所述一級^L定序列排列的樣本，優(yōu)選地，所述屬性選自分子量、電荷、有 機相溶解性、親合性、質(zhì)量、形狀、密度和顏色；優(yōu)選地，所述分離方法選 自以下的一種或幾種瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、 二維 PAGE、等電聚焦、離子交換色譜、過濾色譜、疏水色譜、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、氣相色譜、原子吸收、親合色鐠和梯度離心。
5. 權(quán)利要求l-4任一項所述的方法，其特征在于，步驟(l)中所設(shè)定 的一級設(shè)定序列所依據(jù)的參數(shù)包括距離、時間和/或順序，所述距離、時間和時間和/或順序，或是所述包含生物標志物的組份化樣本在該組份化i某介之外 的遷移遷移距離、時間和/或順序。
6. 權(quán)利要求l-5任一項所述的方法，其特征在于，步驟(l)中所設(shè)定 的一級設(shè)定序列是根據(jù)樣本的切分點如由相伴隨的分子量標準所指示的組 份的分子量的大小作為切分點來進行排列的；優(yōu)選地，所述系列樣本的分界 點與伴隨的分子量標準呈線性、對數(shù)或指數(shù)關(guān)系；和/或所述一級設(shè)定序列為 自然形成序列或由任一方式重新安排的序列。
7. 權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，所述樣本的組織來 源選自以下的一種或幾種血液、從胎盤、膀胱、大腦、腦額葉、腦海馬、 腦枕葉、腦頂頁、腦顳葉、乳房、小腦、結(jié)腸、食道、心臟、腎臟、肝臟、 肺臟、肌肉、卵巢、胰腺、直腸、皮膚、小腸、十二指腸、小腸回腸、小腸 空腸、脾臟、胃、睪丸、扁桃腺、子宮宮頸和子宮宮體。
8. 權(quán)利要求l-7任一項所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述回 收方法以自動化方式進行，或是使用相關(guān)試劑盒或商品化儀器來進行。
9. 權(quán)利要求l-8任一項所述的方法，其特征在于，步驟(l)中所述的 以一級設(shè)定序列排列的在步驟(3)所述的每個支持材料上進行上樣的系列 組份化樣本的^:目為2到500,000。
10. 權(quán)利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于，步驟(3)中對所定的序列或任意次序來進行。
11. 權(quán)利要求l-10任一項所述的方法，其特征在于，步驟(3)中的所 述矩陣化上樣的方法為通過儀器如微陣列點樣儀器自動進行或通過手工進 行。
12. 權(quán)利要求l-ll任一項所述的方法，其特征在于，對步驟(3)中所 述的支持材料進行電荷或化學(xué)修飾操作以增強其分子結(jié)合能力，所述操作包 括聚賴氨酸化、曱硅烷基化、硅烷化。
13. 權(quán)利要求l-12任一項所述的方法，其特征在于，所述方法的步驟(4) 包括如下操作(4.1)選擇并設(shè)計可以與步驟(3)所述的矩陣化排列在支持材料上的生物標志物相結(jié)合并相互作用的探針分子；優(yōu)選地，所述探針分子選自核 糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)、蛋白質(zhì)、抗體和經(jīng)化學(xué)》務(wù)飾的蛋白； 進一步優(yōu)選地，所述經(jīng)化學(xué)修飾的蛋白是指經(jīng)化學(xué)標記、螢光標記、放射同 位素標記或質(zhì)語分析激光標記的蛋白質(zhì)探針。(4.2) 分析步驟(3)中所述的按照步驟(1)所述的相應(yīng)的一級序列和次級(4.3) 檢測、分析和/或預(yù)測步驟(l)中所述生物標志物的屬性。
14. 權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括將步驟(4.1)行孵育和雜交的步驟，優(yōu)選地，所述纟笨針分子的孵育或雜交過程可以手動操 作或自動化進行。
15. 權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，步驟(4.2)的分析和/或(4.3)的探針分子；優(yōu)選地，該分析和/或^r測方法選自化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、熒光 法、放射法和質(zhì)譜分析法。
16. 權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述分析和/或檢測所述支 持材料上與生物標志物相互作用的探針分子數(shù)量的操作是以手動或自動進 行的，例如使用膠片手工曝光；或是使用儀器進行的，例如使用微點陣掃描 儀來進行。
17. 權(quán)利要求1-16任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)包含 對含有生物標志物的組份化樣本的表達模式的分析；優(yōu)選地，所述分析包括 通過數(shù)學(xué)計算、計算機圖像處理和/或數(shù)據(jù)分析等高通量方式處理并生成相應(yīng) 的數(shù)據(jù)庫。
18. 權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述數(shù)學(xué)計算是用于確定物標志物的組份化樣本的遷移距離i^時間。、、 、
19. 權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述計算機圖像處理及其 數(shù)據(jù)分析是用于確定步驟(l)中所述的以一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列排列 生物標志物分子的數(shù)量。
20. 權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述的計算機圖像處理及 其數(shù)據(jù)分析是用于放大處理包含生物標志物的系列組份化樣本的微點陣圖 像。
21. —種制備用于高通量分析的矩陣化排列樣本的樣本庫的方法，其特 征在于，所述方法包括如下步驟(1) 、將所述包含生物標志物的原始樣本以能夠分離所述包含生物標志物 的方法進行組份化，并依照其進行組份化方法所產(chǎn)生的參數(shù)所設(shè)定的 一級設(shè) 定序列和根據(jù)所述樣本來源所設(shè)定的次級設(shè)定順序，使得到的包含生物標志 物的組份化樣本在組份化介質(zhì)上進行排列或表達，優(yōu)選地，所述樣本來源為 組織來源；(2) 、從所述組份化介質(zhì)上回收所述組份化樣本，使回收得到的每一個組 份化的樣本，都確保依照步驟(l)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序 列進行分序和排列；(3) 、按照步驟(1)中所設(shè)定的一級設(shè)定序列和次級設(shè)定序列，將所回 收到的包含生物標志物的系列組份化樣本在支持材料上進行矩陣化排列，所 述支持材^H尤選選自硝酸纖維素、尼龍、塑料、玻璃、多孔板和珠。
22. 權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法中的原始樣本為 來源于不同個體的不同或相同組織的生物標志物的樣本，所述方法包括對每 一個體的不同或相同組織來源的樣本重復(fù)步驟(1)和(2),從而使所有不同或
23. 權(quán)利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述生物標志物的類 型包括核酸如核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)和/或cDNA,蛋 白，多肽，脂質(zhì)和/或多糖。
24. 權(quán)利要求21-23任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟(l) 的組份化處理，是根據(jù)生物標志物分子的自身屬性優(yōu)選為生物醫(yī)學(xué)屬性來分 離為以所述一級"i殳定序列排列的系列樣本，優(yōu)選地，所述屬性選自以下的一 種或幾種分子量、電荷、有機相溶解性、親合性、質(zhì)量、形狀、密度和顏 色；和/或優(yōu)選地，所述分離方法選自以下的一種或幾種瓊脂糖凝膠電泳、 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、 二維PAGE、等電聚焦、離子交換色譜、過濾 色譜、疏水色譜、高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)、氣相色譜、原 子吸收、親合色譜和梯度離心。
25. 權(quán)利要求21-24任一項所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所 設(shè)定的一級設(shè)定序列所依據(jù)的參數(shù)包括距離、時間和/或順序，所述距離、時 間和/或順序是所述包含生物標志物的組份化樣本在該組份化媒介中的遷移 距離、時間和/或順序，或是所述包含生物標志物的組份化樣本在該組份化々某介之外的遷移距離、時間和/或順序。
26. 權(quán)利要求21-25任一項所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所 設(shè)定的一級設(shè)定序列是根據(jù)樣本的切分點如由相伴隨的分子量標準所指示 的組份的分子量的大小作為切分點來進行排列的；優(yōu)選地，所述系列樣本的 分界點可與伴隨的分子量標準呈線性、對數(shù)或指數(shù)關(guān)系；和/或所述一級設(shè)定 序列為自然形成序列或由任一方式重新安排的序列。
27. 權(quán)利要求21-26任一項所述的方法，其特征在于，所述樣本的組織 來源選自以下的一種或幾種血液、從胎盤、膀胱、大腦、腦額葉、腦海馬、 腦枕葉、腦頂頁、腦顳葉、乳房、小腦、結(jié)腸、食道、心臟、腎臟、肝臟、 肺臟、肌肉、卵巢、胰腺、直腸、皮膚、小腸、十二指腸、小腸回腸、小腸 空腸、脾臟、胃、睪丸、扁桃腺、子宮宮頸和子宮宮體。
28. 權(quán)利要求21-27任一項所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所 述回收方法以自動化方式進行，或是使用相關(guān)試劑盒或商品化儀器來進行。
29. 權(quán)利要求21-28任一項所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所 述的一級設(shè)定序列排列的在步驟(3)所述的每個支持材料上進行上樣的系 列組份化樣本的數(shù)目為2到500,000。
30. 權(quán)利要求21-29任一項所述的方法，其特征在于，步驟(3)中對設(shè)定的序列或任意次序來進行。
31. 權(quán)利要求21-30任一項所述的方法，其特征在于，步驟(3)中的 所述矩陣化排列的方法為通過儀器如微陣列點樣儀器自動進行或通過手工 進行。
32. 權(quán)利要求21-31任一項所述的方法，其特征在于，對步驟(3)中 所述的支持材料進行電荷或化學(xué)修飾操作以增強其分子結(jié)合能力，所述操作 包括聚賴氨酸化、曱硅烷基化、硅烷化。
33. 根據(jù)權(quán)利要求21-32任一項所述的方法所制備的樣本庫，所述樣本 庫包含在支持材料上矩陣化排列的生物標志物的樣本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對于包含生物標志物的樣本進行高通量分析的方法；本發(fā)明還涉及一種制備用于高通量分析的矩陣化排列樣本的樣本庫的方法；本發(fā)明同時涉及根據(jù)本發(fā)明所述的方法所制備的樣本庫。本發(fā)明將分子組份化技術(shù)優(yōu)勢和微陣列、巨陣列大規(guī)模分析的高通量優(yōu)勢相結(jié)合。在傳統(tǒng)的分子組份化技術(shù)基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供更為經(jīng)濟和靈敏地對寶貴樣品進行檢測的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101550441SQ20081010319
公開日2009年10月7日 申請日期2008年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月1日
發(fā)明者王建銘, 范盤生, 紅 趙, 韓曉亮 申請人:博爾誠(北京)科技有限公司