一種預測結腸癌發病年齡的方法及試劑盒的制作方法

專利名稱：：一種預測結腸癌發病年齡的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種預測結腸癌發病年齡的方法及試劑盒，更具體地說是通過測定人C53基因多態性位點1808T/C(rs2737)預測受試者可能的結腸癌發病年齡，該方法可用于疾病的輔助診斷、治療和新藥開發，屬于醫學生物技術和基因診斷領域。
背景技術：
：癌癥是一種嚴重危害人類健康的疾病，是僅次于心腦血管病的第二號殺手。根據世界衛生組織(WHO)報告，每年年全球新發癌癥病人大約900萬，死亡超過500萬人，過去的20年，癌癥患病率增長了一倍以上。全球癌癥仍呈上升趨勢，據世界衛生組織專家預測，未來25年全世界80多億人口中，將有3億人患腫瘤，其中l億人因癌癥而死亡，21世紀癌癥將成為人類健康的"第一殺手"。根據全國性死因回顧調査表明，20年來中國的癌癥發病和死亡率逐年上升，每5個因病死亡的人中，就有l個是死于癌癥，每200個家庭中，有1個家庭因有癌癥病人而遭受磨難。2006年，中國癌癥死亡人數300萬，根據專家預測，到2020年，死亡人數將會超過400萬。癌癥不僅嚴重危害人類的身體健康，也給社會和家庭帶來了沉重的經濟負擔(我國癌癥每年耗費至少約2000億元人民幣)。結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，以40歲50歲年齡組發病率最高。據世界流行病學調查，結腸癌在北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等地的發病率最高，居內臟種瘤前二位，在中國的發病率與死亡率低于胃癌、食管癌、肺癌等常見惡性腫瘤。近年來各地資料顯示隨著人民生活水平的提高，飲食結構的改變，其發病率呈逐年上升趨勢。中國的有關資料顯示，結腸癌發病率占全部惡性腫瘤的第4位，而且有逐年增加的趨勢。有數據顯示，近年來，結腸癌中直腸癌多于結腸癌的情況有所改變，結腸癌的發病比例開始增加。雖然醫療條件不斷改善，醫療技術也有很大提高，但結腸癌的發病率卻一直上升，同吋其治療及預后情況也仍然不容樂觀，5年存活率不到60%。研究表明，在早期檢測出結腸癌的病人，5年存活率達到90%;而晚期檢測出的病人，5年存活率則只有35%。這充分說明了結腸癌的早期診斷對于其治療和預后起著巨大的作用。結腸癌的檢測，除了儀器設備，技術手段的改進，遺傳因素的易感性也是目前世界上研究的熱點之一。而遺傳因素易感性的研究中，采用單核苷酸多態性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)作為基因組標志的關聯分析方法是有效的。SNP是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，在人群中的頻率需>1%，SNP是雙等位基因標記。由于生存的選擇壓力導致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。SNP在基因非編碼區的數量是編碼區的4倍，總數可達3百萬個。SNP以其密度高，平均每lkb就有l個；代表性強，位于基因內部的SNP可能直接影響蛋白質結構或表達水平；遺傳穩定性好，同微衛星多態性比較而言；易于自動化分析，因SNP在人群中為雙等位基因標記，可簡單以"+/-或1/0"直接分型，成為很好的遺傳標志。作為本研究的候選基因，C53基因對于細胞的生長、遷移、粘附以及浸潤都有重要的影響，有研究表明，C53基因與包括肺癌、肝癌、胃癌在內的多種癌癥相關。而在已知的幾個C53基因的SNP位點中，處于其mRNA的3'非翻譯區(3'-UTR)的1808T/C由于處于microRNA379的結合區域而受到我們的關注。MicroRNA是近年來新發現的一類21—25nt長的單鏈小分子RNA。它廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框(ORF)。MicroRNA可以與編碼基因的mRNA3'-UTR相結合，形成不完全的堿基配對，抑制mRNA的表達或是促進mRNA的降解。MicroRNA廣泛地參與了生長發育的全過程，包括干細胞分化、血細胞形成、心臟和骨骼肌發育、神經發生、胰島素分泌、膽固醇代謝和免疫應答反應等。同時MicroRNA也涉及一系列的疾病的病理生理過程，包括癌癥和心腦血管疾病等。目前普遍認為，大概有30%的人類基因受到MicroRNA的調控。在MicroRNA與編碼基因的mRNA3'-UTR結合的過程中，MicroRNA5'端的6~7個堿基對于結合的特異性起著決定性的作用，因此被稱為"種子序列(seedsequence)"。因此與種子序列相對應的mRNA序列也就顯得尤為重要，在這個序列內發生的堿基變化將直接影響MicroRNA與編碼基因mRNA的結合，進而影響MicroRNA對基因的調控，而1808T/C正是處于這個區域內。通過實驗，我們證實，1808T/C確實可以影響microRNA379與編碼基因mRNA的結合。目前，國內外未見利用C53基因多態性預測結腸癌發病年齡的方法及試劑的相關報道。
發明內容本發明的第一個目的是提供一種預測結腸癌發病年齡的方法，以及這種方法在結腸癌的預防、輔助診斷和治療中的用途。本發明的第二個目的是提供兩種預測結腸癌發病年齡的試劑盒，第一種包括特異的PCR引物、限制性內切酶，以及含有上述引物和酶的試劑盒；第二種包括特異的PCR引物、LDR探針，以及含有上述引物和探針的試劑盒。為實現上述目的，本發明采取以下技術方案一種預測結腸癌發病年齡的方法，通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試者的C53基因3'-UTR+1808位點(對應NCBI的SNP庫中標準編號分別是rs2737基因型，預測受試者結腸癌可能的發病年齡。一種分離核酸，是序列表SEQIDNO.l所示的堿基序列。本發明證實，C53基因型為AA純合子時，受試者的易感性最高；增加結腸癌的風險為1.96倍。本發明中C53基因的單核苷酸多態性(SNP)具有SEQIDNO.l所示的核酸序列位點，是與結腸癌發病相關的高風險位點之一。一組預測結腸癌發病年齡的引物，能特異性地擴增出含C53基因的1808位點的擴增產物，是序列表SEQIDN0.2-SEQIDN0.3所示的堿基序列。一種預測結腸癌發病年齡的試劑盒，其由以下試劑組成30^110XPCR緩沖液，50^110mMdNTP混合液，20^15U/plTaqDNA聚合酶，各2|xl50pmoLVlF和R引物，10X酶切緩沖液，5pl10U爾1AccI內切酶，5ml純水；F和R引物是序列表SEQIDN0.2-SEQIDN0.3所示的堿基序列；試劑盒的保存溫度為-20。C。一種分離核酸，具有序列表SEQIDN0.4所示的堿基序列，該序列是與結腸癌發病相關的高風險SNP位點之一。一組預測結腸癌發病年齡的引物序列，能特異性地擴增出含C53基因的1808位點的擴增產物，是序列表SEQIDNO.5-SEQIDNO.6所示的堿基序列。一組預測結腸癌發病年齡的探針序列，是序列表SEQIDNO.7-SEQIDNO.9所示的堿基序列。一種預測結腸癌發病年齡的試劑盒，由以下試劑組成20nl10XHotStarPCR緩沖液，40pl10mMdNTP混合液，20pllOOmMMgS04溶液，5U/plHotStarDNA聚合酶，各2|il50pmol/nlF和R引物，0.5pl40U/plTaqDNA連接酶，10XTaqDNA連接酶反應緩沖液，10(^112.5pmol/|il/eachLDR探針混合物，2ml純水；F和R引物是序列表SEQIDN0.5-SEQIDN0.6所示的堿基序列；LDR探針混合物是序列表SEQIDN0.7-SEQIDN0.9所示的堿基序列；試劑盒的保存溫度為陽20。C。所述的LDR探針序列SEQIDNo.7的5'端磷酸化，3'端標記熒光染料FAM。本發明提供了兩種預測結腸癌發病年齡的診斷試劑盒，其中含有本發明特異性擴增C53基因的PCR引物對，特異的限制性內切酶，以及用于PCR擴增進行LDR檢測的試劑盒的常規組件、試劑、緩沖液等，本領域技術人員熟知這些常規組件和檢測方法。本發明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA，樣品沒有限制如，體液(如血液、腹水和尿液)、組織細胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。本發明具有以下優點本發明首次闡明了C53基因多態性位點與結腸癌的相關性，提供了一種預測結腸癌發病年齡的方法，該方法可用于結腸癌的預防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發。我們使用了兩種試劑盒對SNP1808T/C進行分析分別對應PCR-酶切分析法和新的LDR-PCR測序分型技術。傳統的PCR-酶切分析試劑盒對實驗平臺要求較低，成本低廉，周期短。新的LDR-PCR測序分型試劑盒是利用高溫連接酶實現對基因多態性位點的識別；高溫連接酶一旦檢測到DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應處存在著基因點突變類型的堿基錯配，則連接反應就不能進行，這種試劑盒操作簡便、結果穩定、靈敏度和準確率高。下面結合具體實施方式對本發明作進一步說明，并非對發明的限定，依照本領域公知的現有技術，本發明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開內容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。圖1為C53基因在結腸癌組織中表達情況圖譜。圖2為報告載體熒光素酶活性分析圖譜。圖3為三種基因型(AA型，GG型，AG型)酶切圖譜。圖4為rs2737的LDR分型結果示意圖圖4-1為CT基因型，圖4-2為CC基因型，圖4-3為TT基因型。圖5為SNP1808不同等位基因對結腸癌發病年齡的影響示意圖。圖6為低發病年齡組患者中不同等位基因型的分布頻率圖。具體實施方式實施例1:C53表達水平與結腸癌惡性程度密切相關一一人結腸癌組織芯片分析一.實驗材料人結腸癌組織芯片(cc05-ll-005)購自西安超英生物科技有限公司，包含94個點，每個點均來自不同結腸癌病人的病理組織；免疫組化試劑盒購自北京中山生物公司。二.實驗方法(一)免疫組化檢測C53基因在人結腸癌組織中的表達水平1.C53抗體濃度1:200稀釋2.陰性對照用一抗稀釋液代替；3.實驗詳細染色步驟6(TC烤片30分鐘，常規脫蠟水化；抗原修復以0.01MCB(檸檬酸鹽緩沖液)(pH6.0)高壓修復抗原，冷卻至室溫，PBS洗5分鐘X2次；3XH202-甲醇封閉內源性過氧化物酶，室溫10分鐘，PBS洗5分鐘X2次；滴加抗體，4°C冰箱過夜；0.1%Tween-PBS洗5分鐘X3次；滴加聚合物增強劑，室溫孵育20分鐘；0.1%Tween-PBS洗5分鐘X3次；滴加酶標抗鼠/兔聚合物，室溫孵育30分鐘；0.1%Tween-PBS洗5分鐘X3次；DAB(3.3-四鹽酸二氨基聯苯胺)顯色，蒸鎦水洗終止顯色；蘇木素復染、水洗、分化后充分水洗返藍；常規脫水透明，中性樹膠封片；病理顯微鏡察片，按照著色深淺將C53基因表達水平分為高(3+)、中(2+)、低(1+)三個層次。(二)統計分析C53基因表達水平與結腸癌惡性程度的關系利用SPSS13.0軟件，對C53基因表達水平與結腸癌分級以及浸潤程度做線性相關分析。三.實驗結果圖1為C53基因在結腸癌組織中表達情況圖譜。陰性對照為免疫組化試劑盒內的一抗稀釋液，C53基因表達水平按照著色深淺分為高(3+)、中(2+)、低(1+)三個層次。_表1:C53基因表達水平與結腸癌惡性程度相關性分析_臨床病理表型C53基因表達水平<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>統計結果顯示，C53基因表達水平與結腸腺癌的分級有很強的相關性(Spearman相關系數=0.47,=0.0000001)，與結腸腺癌的浸潤程度也有一定相關性(Spearman相關系數i.21,P《018)，而C53基因的表達水平與結腸粘液腺癌的惡性程度則沒有相關性(P=0.12，0.37)。實施例2:結腸癌組織中microRNA379水平與C53基因表達水平呈負相關一.實驗材料人結腸癌組織芯片(cc05-ll-006)購自西安超英生物科技有限公司，包含150個點，每個點均來自不同結腸癌病人的病理組織；microRNA379雜交探針為超英公司合成；原位雜交試劑盒購自碧云天生物技術研究所，C53抗體為本實驗室自制(同實施例l);免疫組化試劑盒購自北京中山生物公司。二.實驗方法(一)原位雜交檢測microRNA379在人結腸癌組織中的表達水平80。C烤片15分鐘；二甲苯I15分鐘，二甲苯II15分鐘；無水乙醇I5分鐘，取出室溫晾干；胃蛋白酶消化，37。C孵育10-30分鐘或者顯微鏡下控制；梯度乙醇，室溫涼干；設置陽性陰性對照(陽性對照為U6的探針，陰性對照為一段無義的RNA序列探針)；雜交探針用雜交液稀釋至10ng，滴加于組織塊(或組織芯片)，37'C水浴過夜；TTBS(0.1。/。(V/V)Tween20(溶于Tris鹽緩沖液)Tris鹽緩沖液10Ommol/LTrisCL,PH7.50.9%(m/V)NaCl)溶液沖洗3次，每次10分鐘；滴加抗體，37攝氏度孵育30-50分鐘；TTBS溶液沖洗，脫色搖床上10分鐘X3次；稀釋50倍BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸對甲苯胺鹽/氯化硝基四氮唑藍)顯色液，避光顯色2-4小時；蒸餾水終止顯色，置于脫色搖床上5分鐘；復染，30ul/片，蓋上蓋玻片，顯色3-5分鐘；蒸熘水沖洗，置于搖床上15—30分鐘；梯度乙醇，室溫涼干；二甲苯115分鐘。二甲苯1115分鐘；中性樹膠封片；病理顯微鏡察片，按照著色深淺將microRNA379表達水平分為高(2+)、低(1+)兩個個層次。(二)免疫組化檢測C53基因在人結腸癌組織中的表達水平實驗方法同實施例1。(三)統計分析結腸癌組織中microRNA379水平與C53水平的相關性利用SPSS13.0軟件，對C53基因表達水平與結腸癌分級以及浸潤程度做線性相關分析。三.實驗結果表2:結腸癌組織中microRNA379水平與C53基因表達水平的相關性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>統計結果顯示，結腸癌組織中microRNA379水平與C53基因表達水平呈負相關(相關系數=-0.192，OR值K).37，95%可信區間=0.15-0.86，P=0.018)。此結果表明C53基因確實與microRNA379相結合。實施例3:C53基因1808位點不同基因型對microRNA379結合活性的影響一.實驗材料1.生物材料人結腸癌細胞系HCT116購自中國醫學科學院基礎研究所細胞中心;pMIR-Report載體、microRNA379前體以及對照購自Ambion公司；內參pRL-CMV質粒購自Promega公司。2.工具酶及常用試劑Lipofectamine2000(LF2000)、DMEM、Opti-MEMI、FetalBovineSerum購自GIBCOBRL公司；Dual-luciferaseReporterAssay試劑盒購自Promega公司；EndoFreePlasmidMaxiKit購自QIAGEN公司；其余試劑均為進口或國產分析純。3.按照常規方法配制下列試劑并滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)、DMEM高糖培養基、LB培養基、溴化乙錠(EB)溶液(10mg/ml)、TE緩沖液。二.實驗方法1.載體構建依本領域常規操作，將設計好的帶有C53基因1808位點不同基因型的單鏈DNA片段退火，并與經過Spel和HindIII雙酶切的pMIR-Report載體相連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a，酶切篩選得到攜帶不同基因型的報告系統載體(pMIR-CC，野生型和pMIR-TT，突變型)。帶有C53基因1808位點不同基因型的單鏈DNA片段由奧科公司合成野生型序列CTGTGGTGATTGGCCCTGTGGTCTACCAGGAAGCTT-3';(SEQIDNo.10)禾口CGACACCACTAACCGGGACACCAGATGGTCCTTCGAA-3';(SEQIDNo.11)突變型序列CTGTGGTGATTGGCCCTGTGGTCTATCAGGAAGCTT-3，(SEQIDNo.12)和CGACACCACTAACCGGGACACCAGATAGTCCTTCGAA陽3'(SEQIDNo.13)。2.大量提取無內毒素的質粒DNA:挑單克隆菌落于5mlLB中(kana+)，37°C、300rpm振搖8小時，按1:500的比例稀釋至100ml,37°C，300rpm振搖1216小時；6,000rpm，4。C離心15分鐘，收獲細菌，倒盡上清；將細菌重懸于10mlBufferPl(含RNaseA100嗎/ml)，加1OmlBufferP2，輕輕顛倒混勻46次，室溫放5分鐘。準備QIAfilterCartridge:把蓋放到QIAfilterMaxiCartridge上，并將Cartridge放在一管上；加10ml預冷的BufferP3，輕輕顛倒混勻46次，將裂解液移入QIAfilterCartridge中，室溫放置10分鐘，過濾至50ml管中；力n2.5mlBufferER，顛倒混勻10次，放冰上30分鐘；(以下操作在超凈臺中操作)用10mlBufferQBT平衡QIAGEN-tip500，將過濾后的裂解液加入tip中，使其自然流下，加30mlBufferQC洗QIAGEN-tip兩次，用15mlBufferQN洗脫DNA，并用無菌管收集；加10.5ml(0.7V)異丙醇沉淀DNA,混勻，11,000rpm，4。C離心30分鐘；用5mlEndotoxin-free的70%乙醇洗DNA沉淀，ll,OOOrpm離心10分鐘，棄上清，空氣中干燥；重溶于endotoxin-free的TE中。3.細胞轉染分別用250plOpti-MEMI稀釋4pg質粒DNA和10^1Lipofectamine2000，室溫放置5分鐘；將前兩者混合，室溫放置20分鐘；用生理鹽水洗滌細胞，加入1.5ml無抗含10%小牛血清的DMEM培養基；20分鐘后，向混合液中加500pl無抗含10%小牛血清的DMEM培養基，混勻后加入細胞中，置37°C、5%032培養箱內5-6小時之后換為1%血清的DMEM繼續培養。4.熒光素酶活性檢測用脂質體Lipofectamine2000，分別將pMIR-CC或pMIR-TT與microRNA379前體或對照，以及內參pRL-CMV共轉染入結腸癌HCT116細胞，24小時后，棄培養基，用PBS洗一次，去掉PBS;加30(HdlxPLB，在搖床上室溫孵育15分鐘，使細胞完全裂解；將裂解液移入1.5ml離心管中離心，去掉沉淀；取lOOulLARn及2(Hil裂解液至熒光管中，混勻；測量螢火蟲熒光素酶的活性；再加入lOOplStop&GolReagent,測量海膽熒光素酶的活性。三.實驗結果圖2為報告載體熒光素酶活性分析圖譜。攜帶C53SNP1808CC基因型的報告載體(pMIR-CC)，轉染microRNA379前體與轉染microRNA對照組相比較，轉染microRNA379前體組的熒光素酶的活性下降了43%，(P-0.015);攜帶C53SNP1808TT基因型的報告載體(pMIR-TT)，轉染microRNA379前體與轉染microRNA對照組的熒光素酶活性則沒有明顯的差異(P=0.86)。此結果說明，不同基因型能夠顯著地影響C53基因與microRNA379的結合活性。實施例4:預測結腸癌發病年齡的試劑盒及方法(PCR-RFLP法)PCR擴增的目的片段為序列表SEQIDNO.l所示的堿基序列；PCR引物為序列表SEQIDNO.2-3所示的堿基序列；各種限制性內切酶、TaqDNA聚合酶等均為TaKaRa或NEB公司產品；其余各種試劑為進口或國產分析純試劑。一.試劑盒成分30^1IOXPCR緩沖液；(100mMTris-HCl(pH8.3)，500mMKCl，15mMMgCl2)50^110mMdNTP混合液；(dATP，dCTP，dTTP，dGTP各2.5mM)20^15U小1TaqDNA聚合酶；各2^150pmol/nlF和R引物:F引物5'-CAAGAACCCCACGAAAACAG-3'(SEQIDN0.2)R引物5'-AAGATGGAAAGCCACAGGAA-3'(SEQIDN0.3)30^1IOX酶切緩沖液；(50mMKAc，20mMTris-Ac,10mMMg(Ac)2，1mMDTT(pH7.9))5pl10U爾lAccI內切酶；5ml超純水(ddH20);本試劑盒供IO人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20。C。二.使用方法1.PCR擴增目的片段PCR擴增條件總反應體系為10ial，包括20ng基因組DNA1.0pl(提取方法見實施例6)，PCR引物(5pmol/|Lil)各0.6^1，dNTP混合液(10mmol/L)0.2)iil，10xPCR緩沖液(含15mmol/LMg2+)1.0pl，Taq聚合酶(5U/pl)0.1|il，用滅菌蒸餾水(純水、ddH20)補充至10pi。PCR反應參數首先95t:變性10分鐘，隨后迸行35個循環，每一循環包括94"變性30秒，在相應的退火溫度退火30秒，72t:延伸40秒。最后，72'C延伸10分鐘，4t:保存。所用的PCR循環儀是ABI公司的PE9700型。擴增序列為SEQIDNO.l:序列的第147位即為該SNP的位點，有A/G兩種基因CGCTATACTAACTAGAAGGAGAATCTGTGGTTTTCGCCTG回TAGACCACAGGGCCCCGCTTCCTTCCTGTGGCTTTCCATCTT2.限制性酶切片段長度多態性(RFLP)分型(1)SNP1808(rs2737)的酶切位點TGTGGTTTTCGCCTG回TAGACCACAGGGCCAATCACCACA個AccI(GTAGAC)TGTGGTTTTCGCCTGgTAGACCACAGGGCCAATCACCACA下劃線表明的是限制性內切酶Accl的識別序列，箭頭和大寫字是SNP的等位基因。AA基因型的擴增片段不存在Accl酶切位點，將出現一個244bp片段；GG基因型存在AccI酶切位點，將出現147bp和97bp兩個片段；AG基因型則產生244bp、147bp和97bp三個片段。(2)PCR產物酶切體系(20^1):PCR產物8.0plIOX酶切緩沖液2.0^1Accl(lOU/pl)0，ddH209，(3)37'C溫育3小時后，加入IOX上樣緩沖液lpl終止反應；(4)取8nl上述產物，4.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。圖3為三種基因型(AA型，GG型，AG型)酶切圖譜。該試劑盒的優點是對實驗平臺要求較低，對技術人員也沒有特殊的技術要求，只要接受簡單的分子生物學操作培訓即可；成本低廉，檢測所需時間短。實施例5:預測結腸癌發病年齡的試劑盒及方法(PCR-LDR法)PCR擴增的目的片段為序列表SEQIDN0.4所示的堿基序列；PCR引物為序列表SEQIDNO.5-6所示的堿基序列；LDR探針為序列表SEQIDNO.7-9所示的堿基序列；為各種限制性內切酶、T叫DNA聚合酶等均為TaKaRa或NEB公司產品；其余各種試劑為進口或國產分析純試劑。一.試劑盒成分20^110XHotStarPCR緩沖液；(lOOmMTris陽HCl(pH8.3)，500mMKCl，15mMMgCl2，100嗎/mlBSA)40^110mMdNTP混合液；(dATP，dCTP，dTTP，dGTP各2.5mM)2(^1lOOmMMgS04溶液20|xl5U/plHotStarDNA聚合酶；各2pl50pmol/plF和R引物F引物5，-GAAGATGGAAAGCCACAGGA-3'(SEQIDN0.5)R引物5'-TCAACTGCAGGCTCAGAGAA-3'(SEQIDN0.6)0.5^140U1TaqDNA連接酶；10pllOXTaqDNA連接酶反應緩沖液；lOjul12.5pmol/pl/eachLDR探針混合物(探針用SYBRGreen熒光染料進行標記)5，-TTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGAATCTGTGGTTTTCGCCTGG-3'(SEQIDN0.8)2ml超純水(ddH20);本試劑盒供IO人份檢測應用，試劑盒的保存溫度為-20。C。二.使用方法1.通過PCR擴增含有所檢測的SNP位點的DNA片段表3:PCR系統(2(^1體系)組分濃度體移模板(實施例6制備的基因組DNA)HotStarPCR緩沖液10X2^1dNTP混合液10mM2plMgS04lOOmMO如lHotStarDNA聚合酶5unit/pi0.2nlF引物50pmol/(il0.2plR引物50pmol/[il0.2nl超純水9単PCR反應參數95°C5分鐘94°C30秒35個循環—65°C30秒^72°C1分鐘72°C7分鐘PCR產物檢測用3n/。的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,觀察PCR反應的效果，并確定其作為模板在LDR反應中加入的量。2.通過LDR反應測定C53基因SNP+1808多態性LDR系統(10pl體系)組分濃度體積PCR產物lplg/|al1^1TaqDNA連接酶緩沖液10X1^1TaqDNA連接酶40，0,05nl探針混合物12.5pmol/[al/eachlpl超純水6.95mlLDR反應參數95°C35個循環」94°C60°C測序儀ABIPRISM3100。SEQIDN0.4:序列的第99位即為該SNP的位點，有C/T兩種基因型,2分鐘30秒2分鐘,CAGGCGA圖4為LDR分型結果示意圖。該試劑盒的優點是操作簡便、結果穩定、靈敏度和準確率高'實施例6:基因組DNA的提取共計收集結腸癌患者222例，平均年齡58.97土13.87歲，其中男性占57.2%。所有受檢者均為漢族，且簽署知情同意書，這一研究也得到了倫理委員會批準。根據下列方法，用人外周血制備基因組DNA。在抗凝劑EDTA存在下，將收集的10ml人外周血在2500rpm，離心分離30分鐘除去血清。接著加入0.2%NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放置于冰上15分鐘。此后，在2500rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物。用0.2。/。的NaCl溶液，以類似于前面的方式再進行洗滌。在如此獲得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物。將10%SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16^1和20^1，接著上下顛倒懸液輕輕混合。然后，在37"C過夜溫育懸液。過夜后，加入4ml酚/Tds溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm進行離心分離IO分鐘除去水層。將水層和4ml酚/氯仿溶液混合，接著顛倒混勻并以3000rpm離心分離IO分鐘。除去水層。最后，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10體積的3MNaAC(pH5.2)，兩倍量的冷無水乙醇，使DNA沉淀。用70%的乙醇洗滌以獲得基因組DNA。基因組DNA溶解于TE中，然后定量測定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液濃度校正至30ng/|xl，置-20°C冰箱保存。實施例7:C53SNP1808基因型對結腸癌發病年齡的影響一.實驗方法1.測定C53SNP1808多態性位點基因型分別采用實施例4和實施例5所述的試劑盒和方法對實施例6提取得到的結腸癌患者基因組DNA樣本進行檢測。2.統計方法利用SPSS13.0軟件進行分析，檢驗Hardy-Weinberg平衡檢測，數量變量采用t檢驗，質量變量采用卡方檢驗。雙側P〈0.05認為統計學的差異顯著。采用ANOVA檢驗計算不同基因型對結腸癌的發病年齡的影響。二.實驗結果經檢測分析得到，不同基因型對結腸癌的發病年齡的影響圖5為SNP1808不同等位基因對結腸癌發病年齡的影響示意圖。在222例結腸癌患者中，攜帶CC基因型的患者平均發病年齡為55.3歲，而攜帶TT基因型的患者平均發病年齡為63.0歲(95%可信區間=2.6到12.8歲，P=0.003)。可見，C53的1808基因多態性顯著影響了結腸癌的發病年齡。圖6為低發病年齡組患者中不同等位基因型的分布頻率圖。CC基因型在45歲以下發病年齡患者中的分布頻率為io.8%，遠遠低于其在整個患病人群中的分布頻率(26.6%)。本發明具有實用性的例證1)本發明的C53基因多態性的檢測方法可用于分析C53基因上的SNP1808位點的多態性，應用在對結腸癌的輔助性診斷和對個體可能的結腸癌發病年齡進行評估。以利于開展結腸癌的早期干預和治療。2)利用本發明闡述冠結腸癌心病基因的多態性，作為生物標志物之一，可用作藥物設計的分子靶標的篩選，以幫助尋找具有調節C53表達的活性分子，促進結腸癌新藥的開發。3)本發明建立的檢測C53基因多態性的核酸序列和結腸癌相關位點，可高靈敏度、特異性地應用于結腸癌基因診斷用的試劑盒。如上所述，得出結論，C53基因的多態性與結腸癌的發病年齡具顯著相關性。因此，根據本發明，測定多態性可用于進行基因診斷。本發明敘述了C53基因結腸癌相關的SNP位點，并提供了一種測定C53基因多態性的方法。而且，根據本發明，只需要少量DNA樣品就足以測定C53基因的多態性。結果，本發明提供了一種測定結腸癌相關基因多態性的基因診斷方法。序列表〈110〉中國醫學科學院阜外心血管病醫院〈120〉一種預測結腸癌發病年齡的方法及試劑盒〈130〉<160〉13<170>Patentlnversion3.5<210〉1〈211>244<212>畫<213〉人屬，人種〈220〉〈221>SNP位點〈222〉(147)<223>r:a或g〈400>1caagasccccacga^已C3ggtgcgaagcctcaactgc已ggctcag已gaagcagcataag60gaactgtcagtactgaagcaagagttttttcctcttttattaagtccgctatactaacta120ctgtggttttcgcctgrtagaccacagggcc犯tcaccacagcttcttgt180g卿gtgccac鄉tgccgcttccttcctgtggctttcca240tctt244〈210〉2〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉2caagaaccccacgaaaacag20〈210〉3〈211〉20〈212〉腿<213〉人工合成〈400〉3aagatgga犯gccacaggaa20〈210〉4〈211〉215<212〉DNA〈213〉人屬，人種〈220〉〈221〉SNP位點<222>(99)〈223〉y=t或c〈400〉4gaagatggaaagccacaggaaggaagcggcacctgatggtgatcttggcactctccatgt60tctctacaagaagctgtggtgattggccctgtggtctaycaggcgaaaaccacagattct120ccttctagttagtatagcggactt犯taaaagaggaaaaaactcttgcttcagtactgac180agttccttatgctgcttctctgagcctgcagttga215〈210〉5〈211〉20〈212〉腿<213>人工合成<400〉5g犯gatggaaagccacagga20〈210〉6〈211>20<212>DNA〈213>人工合成〈400〉6tcaactgcaggctcagagaa20〈210〉7<211〉41〈212〉DNA〈213〉人工合成<400〉7tagaccacagggccaatcaccacagtttttttttttttttt41〈210〉8〈211〉41〈212〉醒〈213〉人工合成〈400〉8ttttttttttttttttaggagaatctgtggttttcgcctgg41〈210〉9〈211〉43〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉9ttttttttttttttttttaggagaatctgtggttttcgcctga43〈210〉10〈211〉87<212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉10actagtgcacctgatggtgatcttggcactctccatgttctctacaagaagctgtggtga印ttggccctgtggtctaccaggaagctt8了<210>11〈211〉87〈212〉腿<213〉人工合成〈400〉11tgatcacgtggactaccactagaaccgtgagaggtacaagagatgttcttcgacaccact60aaccgggacaccagatggtccttcgaa87<210〉12〈211〉87〈212〉DNA〈213>人工合成〈400〉12actagtgcacctgatggtgatcttggcactctccatgttctctacaagaagctgtggtga60ttggccctgtggtctatcaggaagctt87<210〉13〈211〉87〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>13tgatcacgtggactaccac"tagaaccgtgagaggtacaagagatgttcttcgacacceict60aaccgggacaccagatagtccttcgaa8權利要求1.一種預測結腸癌發病年齡的方法，其特征在于該方法通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試者的C53基因1808位點(rs2737)的基因型，預測受試者可能的結腸癌發病年齡。2.—種分離核酸，是序列表SEQIDNO.l所示的堿基序列。3.—組預測結腸癌發病年齡的引物，能特異性地擴增出含C53基因的1S08位點的擴增產物，是序列表SEQIDNO.2-SEQIDN0.3所示的堿基序列。4.一種預測結腸癌發病年齡的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成30^1IOXPCR緩沖液，50pl10mMdNTP混合液，20^15U/VTaqDNA聚合酶，各2pl50pmol/pilF和R引物，3C^110X酶切緩沖液，5pl10U/plAccI內切酶，5ml超純水；F和R引物是序列表SEQIDN0.2-SEQIDN0.3所示的堿基序列；試劑盒的保存溫度為-20。C。5.—種分離核酸，具有序列表SEQIDN0.4所示的堿基序列。6.—組預測結腸癌發病年齡的引物序列，能特異性地擴增出含C53基因的1808位點的擴增產物，是序列表SEQIDNO.5-SEQIDNO.6所示的堿基序列。7.—組預測結腸癌發病年齡的探針序列(寡核苷酸序列)，是序列表SEQIDNO.7-SEQIDN0.9所示的堿基序列。8.—種預測結腸癌發病年齡的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成20pllOXHotStarPCR緩沖液，lOmMdNTP混合液，20jillOOmMMgS04溶液，20pl5U/plHotStarDNA聚合酶，各2pl50pmol/|alF和R引物，0.5(^140U/|iilTaqDNA連接酶，10^1lOXTaqDNA連接酶反應緩沖液，lOpl12.5pmol/nl/eachLDR探針混合物，2ml超純水；F和R引物是序列表SEQIDNO.5-SEQIDNO.6所示的堿基序列；LDR探針混合物是序列表SEQIDNO.7-SEQIDNO.9所示的堿基序列；試劑盒的保存溫度為-20。C。9.根據權利要求8所述的預測結腸癌發病年齡的試劑盒，其特征在于所述的LDR探針序列SEQIDNo.7的5'端磷酸化，3'端標記熒光染料FAM。全文摘要本發明涉及一種預測結腸癌發病年齡的方法及試劑盒，屬于醫學生物技術和基因診斷領域。一種預測結腸癌易感性的方法，通過提取宿主細胞基因組DNA，測定受試者的C53基因多態性1808位點(rs2737)的基因型，預測受試者對結腸癌的易感性。本發明的優點是首次闡明了C53基因多態性位點與結腸癌發病年齡的相關性，提供了一種預測結腸癌易感性的方法，該方法可用于結腸癌的預防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發。文檔編號C12N15/11GK101245393SQ200810102699公開日2008年8月20日申請日期2008年3月25日優先權日2008年3月25日發明者暉于,凱孫,張禪那,惠汝太,濤楊,毅石,陳敬洲申請人:中國醫學科學院阜外心血管病醫院