專利名稱：：一種生產蟲草素的方法及高產蛹蟲草菌株byb-08的選育與應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于農業微生物
技術領域：
。具體涉及一種蟲草素的生產方法以及用于該方法的蛹蟲草菌株的選育與應用。技術背景蛹蟲草[Cor辦"戸w邊'/"&]，又名北冬蟲夏草(簡稱北蟲草)、蠶蟲草，屬子囊菌亞門(/4，附戸"—核菌綱CP戸wo附拜to)球殼目(S//am'w/ey)麥角菌禾斗(C7a順c//,flfceae)蟲草屬(Coe辦ce戸)，是我國名貴中藥材之一。蛹蟲草無性型是蛹蟲草擬青霉(Paec"o，cesm!7ton'sLiang)，其無性型在單孢子菌株水平上，菌落特征、有性子實體形成能力、產孢結構等方面差異較大。蛹蟲草和冬蟲夏草[Cora[yce戸w'"ew^(Berk.)Sacc.]都是蟲草屬真菌的模式種，是由子座與菌核(即昆蟲蛹或幼蟲的尸體部分)兩部分組成的復合體。蛹蟲草宿主主要是鱗翅目蠶蛾科、舟蛾科、天蠶蛾科等科的昆蟲,這些昆蟲冬季蟄居土里,菌類寄生其中吸收營養，最后昆蟲體內充滿菌絲而死亡。春末夏初氣溫轉暖后,從其尸體上長出子座，形似草，夏至前后采集菌核和子座復合體而得。主要分布在吉林、遼寧、陜西、廣東等地。除我國之外，亞洲、歐洲、北美洲等很多國家和地區都有分布。國內外報道蟲草種類計300多種，我國有57種以上，是蟲草資源分布最多最廣的國家之一。中醫常用的冬蟲夏草主產于我國青海、云貴高原、橫斷山脈及祁連山等高寒灌叢或草甸地帶，然而其產量卻極為有限。國內外對冬蟲夏草雖作了多方面的培養研究，但至今未能實現有效的子實體人工培養及規模化生產。國內外對已經成功誘導形成的蟲草子實體研究表明，蛹蟲草食用和藥用價值可與天然冬蟲夏草相媲美，不僅具有營養滋補功能，而且能有效地抑制腫瘤生長和病毒繁殖，并具有其它多種藥用功能，而蛹蟲草中的蟲草素含量遠高于冬蟲夏草中蟲草素的含量，是冬蟲夏草最理想的替代品，這一發現導致世界各地對蛹蟲草的需求量激增，但野生蛹蟲草與野生冬蟲夏草一樣，在自然界中極為稀少且價格昂貴。液體深層發酵培養可以有效提高蛹蟲草代謝產物的產量，如初級代謝產物(氨基酸、核苷酸、蛋白質、核酸、類脂、多糖類、有機酸類等)和次級代謝產物(抗菌素、生物堿、色素、植物生長因子等)。這兩大類物質在營養和醫藥上都有重要作用，特別是蟲草素所具有的對人體抗腫瘤細胞和治療白血病的功效，被許多醫學研究所證實，其治療白血病的功能在美國已經進入第三期臨床驗證。如果從藥用菌子實體中提取代謝產物，不僅生產環節多，耗時多，而且成本高，產量底，而液體培養可以克服以上缺點。因此，人工培育具有自然形態的蛹蟲草子實體和液體培養蛹蟲草菌絲體發酵液具有特殊意義。由于蟲草素將有可能投入藥用，其需求量的上升將給蟲草素的生產帶來契機。國內已有的生產蟲草素的專利中，申請號為01124109.8的專利申請公開了一種發酵培養生產蟲草素的方法，利用20L生物反應器中進行大規模培養生產蟲草素，發酵結束后發酵液中蟲草素含量為7.1嗎/L。由于該文獻沒有公開用于發酵的菌株來源，也沒有提交用于專利程序的生物材料樣品的保藏，導致該專利申請公開不充分。申請號為01133167.7的生產蟲草素的專利文獻，涉及一種液體培養蟲草菌體及利用其培養液制備蟲草素的方法，但該申請的說明書未說明液體培養基中蟲草素的含量，人們無法評價其發明效果。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，研制一種提高蟲草素產量的生產方法以及選育用于該方法的蛹蟲草菌株。本發明還包括將本發明選育的蛹蟲草菌株應用于發酵生產蟲草素及其制品生產上。本發明的特點是采用深層發酵培養和表層靜止發酵培養相結合的發酵方法提高蟲草素的產量。本發明的方法能很好地控制蛹蟲草菌絲體的生長及代謝過程，以達到縮短培養周期，降低成本，從而有效提高了發酵液中蟲草素的含量。本發明通過以下技術方案實現一種生產蟲草素的方法，采用液體深層發酵和表層發酵相結合的方法進行發酵，其步驟如下(1)將保藏號為CCTCCNO:M207091的蛹蟲草菌株BYB-08，接種于固體培養基的平皿內，于2028'C避光培養15d，再用散射光培養5d，用無菌水洗下分生孢子制成分生孢子懸液，備用；(2)將步驟(1)得到的分生孢子懸液接入發酵罐的液體發酵培養基中，接種量按孢子懸液與液體培養基體積比為12%的量接入；(3)按照所述的液體深層發酵和表層發酵相結合的方法培養步驟(2)的培養物在發酵培養起始階段，控制發酵罐通氣量為120170ml/min，攪拌速度為150rpm200rpm，溫度為23°C27°C，培養34d后，待發酵液中還原糖濃度為0.050.09g/L時停止深層攪拌發酵，將發酵液轉移至容器口蓋有滅菌紗布的廣口容器中，控制發酵溫度為2327'C，靜止表層發酵1620d后停止發酵，得到含蟲草素的發酵原液；(4)將步驟(3)得到的蟲草素發酵原液以3000rpm，25。C離心30分鐘，取上清液，將該上清液經減壓濃縮至發酵原液體積的1/10左右，加入3倍體積的95%乙醇，去除其中的沉淀物，將剩余的發酵原液貯藏在2'C條件下，采用5000rpm離心10min后取上清，再經減壓蒸出乙醇，將其濃縮至發酵原液體積的1/5左右，除去其中的蛋白，得到初步提純的蟲草素溶液，其中步驟(1)所述的固體培養基組分為(按重量體積計)馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，KH2P04lg，MgSO40.5g，VB110mg，瓊脂粉20g，補充自來水至lOOOml，調pH步驟(2)在發酵罐中的液體培養基按照重量體積計為葡萄糖2%，豆粕8%，馬鈴薯浸出粉2%，腺苷0.6%，KH2P040.2%，MgS040.1%,補充自來水至100%，調pH至6.57.0，備用。為了獲得高產蛹蟲草菌株，申請人經過大量試驗獲得了1株蛹蟲草菌株(Cor辦cre;wm,7/ton'"BYB-08，該菌株于2007年6月29日送交中國湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心(英文簡稱；CCTCC)保藏，獲得保藏號為CCTCCNO:M207091(具體選育方法參見實施例)。蛹蟲草菌株BYB-08的生物學特征菌絲管狀、無色、透明、有隔，菌絲體頂端可形成分生孢子梗，分生孢子球形或橢圓形，表面有刺狀突起，2x3.2|iimxl.53|_un，分生孢子梗獨生或在輪生部上分枝，3040|iimxl2pm，前端稍膨大。在蛹蟲草栽培培養基(大米50g，蛋白胨15.625g，葡萄糖20g，酵母膏6.25g，馬鈴薯200g，加水定容至1000mL)上，菌落白色，見光后轉色呈淡黃或橙黃。菌絲體長滿栽培瓶后，每天10h以上200lux左右光照，同時給予不少于6h的IO'C以上的溫差刺激時，菌絲體開始分化扭結形成原基，原基繼續生長形成子座。子座單生或叢生，橙黃色，幼嫩的子座呈圓錐狀，成熟的子座呈棒狀，多為雙叉分枝，常有縱溝或略扭曲，粗壯，生長整齊，長20100mm，粗0.54.5mm，平均鮮重0.41g，平均長度4.2cm。子實體子座上部外圍有子囊殼環狀排列，子囊殼突出呈卵形或瓶型，孔口向外半埋生于子座中，側壁由擬薄壁組織形成，厚1020pm。子囊殼內有多個圓柱形子囊，18個子囊孢子在子囊內線狀排列，多隔，成熟后斷裂成次生子囊。在人工栽培條件下，成熟的子座外周會長出許多白色營養菌絲。上述蛹蟲草菌株BYB-08已經成功地應用本發明的發酵生產中，獲得良好的生產效果。與現有技術相比，本發明具有以下積極效果申請號為01124109.8的發明是利用20L生物反應器中大規模生產蟲草素，發酵結束時發酵液中蟲草素含量為7.1pg/L。本發明生產的發酵原液中，蟲草素的含量遠遠超過用其它培養方法和培養基發酵獲得發酵原液中蟲草素的含量，所獲得的發酵原液中蟲草素產量達到3028pg/mL。與申請號為01124109.8的方法的產量相比，本發明發酵液中蟲草素含量是其專利文獻所報導的420多倍，是蛹蟲草液體發酵生產蟲草素取得的重大突破。圖l:本發明的技術路線圖；圖2:是本發明制備的蛹蟲草53個原生質體再生菌株酯酶同工酶模式圖。圖2A是蛹蟲草親本菌株NO4(SHN4)、N08(B1-0I)和25個原生質體再生菌株酯酶同工酶模式圖，圖2B是蛹蟲草28個原生質體再生菌株酯酶同工酶模式圖；圖3:是本發明先U備的引物P6對蛹蟲草53個原生質體再生菌株PCR擴增的結果。圖M是引物PG對蛹蟲草親本菌株N04(SHN4)、N08(B1-01)和26個原生質體再生菌株PCR擴增結果,圖3B是引物P6對蛹蟲草親本菌株N04(SHN4)、N08(B1-01)和31個原生質體再生齒株PCR擴增結果；圖4:是本發明制備的蟲草素標準品及菌株BYB-08菌絲體的HPLC色譜圖。圖4A是蟲草素標樣HPLC色譜圖，圖4B是菌株BYB-08HPLC色譜圖；圖5:蟲草素標準品的標準曲線；圖6:本發明的實施例中表層發酵時間對蟲草素產量的影響；圖7:本發明的實施例中深層發酵時間對蟲草素產量的影響；圖8:蟲草素標準品高效液相色譜圖；圖9:本發明實施例中不同發酵階段蛹蟲草發酵液中腺苷和蟲草素含量的色譜對照圖；圖10:本發明實施例中發酵終止時蛹蟲草發酵液的高效液相色譜圖；圖11:本發明實施例中不同發酵初始pH對蛹蟲草發酵液中蟲草素含量的影響。具體實施方法實施例1:蛹蟲草高產菌株BYB-08的選育本發明生產工藝所用的菌株為申請人所在的華中農業大學應用真菌研究所采用滅活原生質體融合法選育的1株高產蛹蟲草菌株，申請者將該菌株命名為BYB-08。該株蛹蟲草菌株(Cw辦ce;w7w7z'to&)BYB-08于2007年6月29日送交中國湖北省武漢市武漢大學內的中國典型培養物保藏中心保藏，獲得保藏號為CCTCCNO:M207091。具體步驟如下(1)原生質體融合親本菌株篩選從全國各地收集9個蛹蟲草菌株，分別編號為NOlN09。制備以下培養基(1)菌絲體培養基(配方如下葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏20g，MgS04-7H200.5g，KH2P040.46g，K2HP(V3H20l.Og，瓊脂18g，補充自來水至1000mL，pH6.57.5)，(2)栽培培養基(容量為1.5L的玻璃瓶每瓶裝商品大米50g，蛋白胨15.625g，葡萄糖20g，酵母膏6.25g，馬鈴薯200g，補充自來水至1000mL，pH6.57.5)，(3)固體再生培養基(配方麥芽糖10g,葡萄糖4g，酵母粉4g，瓊脂18g，補充蒸餾水至1000ml;穩滲劑為0.6M蔗糖；硫酸鏈霉素和青霉素鈉各5萬單位，pH6.57.5)，(4)半固體再生培養基(配方同上述固體再生培養基，但瓊脂含量減半，pH6.57.5)進行栽培(按照常規濕熱滅菌法滅菌，即在12rC高壓蒸汽下滅菌40分鐘至1小時)，觀察其農藝性狀，并釆用通用的高效液相法(HPLC)測定菌絲體胞內蟲草素、腺苷和尿苷的含量。結果表明蛹蟲草菌株SHN4(上海市農業科學院食用菌研究所提供)原基分化早，分化率高；菌株B1-01(貴州大學真菌資源研究室提供)子實體粗壯、生長整齊，蟲草素及胞內糖含量高于其它菌株。因此選定SHN4和Bl-Ol菌株作為滅活原生質體的親本。(2)滅活原生質體融合原生質體的親本菌株酶解條件和融合條件按參考文獻(LiangZR，AnMP，TongZYPolarizedprotoplastfosionbetweenP/ewrafiwsq/orca/wandiSt/H.zo//^//w;co/w附wrte[7].Mycosystema.2001.20(1):Ul115);菌株SHN4采用紫外線G0W紫外燈，置于距超凈工作臺臺面上原生質體懸浮液30cm處)滅活8min，將菌株Bl-Ol采用60。C熱水浴滅活14min。將濃度為108個/ml的兩個親本菌株滅活原生質體懸浮液等量混合，3000rpm離心10分鐘，去上清液，加30°/。PEG(聚乙二醇)，3(TC保溫10min;再加Ca2+緩沖液(0.05MCaCl22H20，0.05M氨基乙酸，0.6M蔗糖，pH79)稀釋，靜置15min，3000rpm離心10min，去上清液，滲透壓穩定劑(0.6MMgSO4)洗滌沉淀3次，加適量滲透壓穩定劑(0.6MMgS04)懸浮沉淀后培養。滅活原生質體融合后，25。C培養4d，隨機挑取228個再生菌株。(3)融合子鑒定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和ISSRPCR反應,對再生菌株進行融合子鑒定，篩選出真正的融合子。聚丙烯酰胺凝膠電泳采用濃縮膠5.0%，分離膠8.0%，菌絲體培養20d，操作方法參照邊銀丙等報道的方法(邊銀丙等，木耳栽培菌株酯酮同工酶的酶譜多樣性研究m，菌物系統,2000,19(1):9196)。將隨機挑取的228個再生菌株進行酯酶同工酶電泳分析，同時具有親本菌株SHN4和Bl-Ol特有帶Rf0.225和Rf0.75的再生菌株共53個菌株。根據酯酶同工酶酶譜，初步判定這53個再生菌株為融合子(見圖2A,圖2B)。ISSRPCR反應條件與唐利華等報道的方法(參見:唐利華，肖揚，邊銀丙，黑木耳ISSRPCR反應體系的正交優化[J]，菌物研究，2005，3(4):1518)基本相同，但每條引物擴展時退火溫度不同，采用的13條ISSR引物進行PCR擴增，引物的序列和退火溫度見表l。表1供試的13條引物編號及序列引物編號序列(5'—3')sequenceTm('C)P3GAGAGAGAGAGAGAGAT52.2P4GAGAGAGAGAGAGAGAC54.6P5AGAGAGAGAGAGAGAGG54.6P6AGAGAGAGAGAGAGAGC54.6P9GSGGTGTGTGTGTGTGTGT50.8P10AGAGAGAGAGAGAGAGT52.2P16TCTCTCTCTCTCTCTCC54.6P21AGAGAGAGAGAGAGAGYA52.7P22AGAGAGAGAGAGAGAGYC55.0P25GAGAGAGAGAGAGAGAYC55.0P26GAGAGAGAGAGAGAGAYT52.7P27GAGAGAGAGAGAGAGAYG55.0P30GAGAGAGAGAGAGAGAA54.6選用P6、P22、P27等3條能同時擴增出親本特有帶的引物，對初篩的53個菌株進行ISSRPCR反應，根據兩個親本特有擴增帶的有無，從分子水平上對53個初篩菌株進行融合子鑒定。引物P6對53個初篩菌株擴增結果顯示，20個菌株同時具有親本SHN4和Bl-01的特異帶(圖3A,圖3B)。ISSRPCR分析與酯酶同工酶酶譜分析相結合，鑒定出26個再生菌株是真正的融合子。(4)融合子蟲草素含量測定對生長良好的原生質體融合再生菌株進行蟲草素含量分析。樣品處理及高效液相色譜條件參考文獻(鞠建明等，HPLC測定冬仙膠囊中蟲草素的含量[J].中成藥，2005，27(2)Vol.27,No.2:215216.)進行。采用Varian高效液相色譜儀，依利特高效液相色譜柱SinoChromODSBP;蟲草素標樣購于sigma公司。蟲草素含量測定結果顯示，融合子中有部分菌株蟲草素含量低于和近似于兩個親本菌株，部分融合子蟲草素含量高于親本菌株B1-01，其中BYB-08是所有融合子和親本菌株中蟲草素含量最高的菌株(見圖4B)。實施例2:本發明的菌株應用于蟲草素的生產舉例(1)菌種制備采用固體培養基制備菌種(菌株為本發明選育的蛹蟲草菌BYB-08，保藏號為CCTCCNO:M207091)。該培養基的組分及配比為(按照重量體積計)馬鈴薯浸出粉(購自商品)20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，KH2P04lg,MgSO40.5g，VBdOmg,瓊脂粉20g，補充自來水至1000ml，調pH至6.57.5。按照常規方法在12rC高壓蒸汽滅菌45分鐘1小時，備用。在每個滅過菌的培養皿中倒入滅菌的上述培養基20ml，待凝固冷卻后接入大小為lci^左右的保藏號為CCTCCNO:M207091的蛹蟲草菌株BYB-08菌絲塊；將培養皿放入培養箱中于20。C28。C(優選溫度為2225X:)避光培養15d，再用散射光條件下培養5d，待菌絲體由白轉變成金黃色，用無菌水洗下分生孢子后,配制成均勻的分生孢子懸液作為發酵培養的菌種，調節孢子懸液中分生孢子數達到每毫升3.2><109個，將上述孢子懸液置051:冰箱中保藏備用。(2)液體發酵罐中培養基制備與液體深層發酵培養將上述制備好的蛹蟲草分生孢子懸液接入5L發酵罐(培養基的實際裝量按3L發酵罐的容量計)，接種量按分生孢子懸液占液體培養基體積的12%的量接種到液體培養基中。在發酵罐中的液體培養基配方為(按照重量體積計)葡萄糖2%，豆粕8%，馬鈴薯浸出粉2%，腺苷0.6%，KH2PO40.2%，MgSO40.1%，補充自來水至100%，調pH至6.57.0，備用o為了提高本發明中蟲草素的產量，申請人研制了一種液體深層發酵和表層發酵相結合的方法生產蟲草素。具體步驟是在發酵培養起始階段，控制發酵罐通氣量為120ml/min170ml/min，攪拌速度控制為150rpm200rpm，溫度控制為23°C27°C，培養34d。待發酵液中還原糖濃度為Q.050.09g/1時，停止深層攪拌發酵，將發酵液轉移至容器口蓋有滅菌紗布的廣口容器中，控制發酵溫度為23'C27。C,靜止表層發酵16d20d后停止發酵，得到含蟲草素的發酵原液.(3)蟲草素發酵原液的初步分離用商購的大型離心機將上述步驟得到的發酵原液用3000rpm離心機在25。C下離心30分鐘，取上清液。將該上清液采用SHZ-D(m)循環水式真空泵(鄭州市亞榮儀器有限公司生產，按照產品說明書操作)，進行抽真空減壓蒸發，濃縮至發酵原液原體積的1/10左右時，再加入3倍體積的95%乙醇沉淀出其中的多糖等物質，并將除去沉淀的發酵原液置4'C冰箱中靜置過夜；然后將冰箱貯藏的發酵液在4'C條件下，采用5000rpm離心10min后，取上清，再采用SHZ-D(III)循環水式真空泵(鄭州市亞榮儀器有限公司生產，按照產品說明書操作)，進行減壓蒸發，蒸溜出乙醇；最后將該發酵液濃縮至發酵原液體積的1/5左右，得到最終濃縮液。用Sevage法(參見文獻李衛旗等，啤酒酵母中P-(1-3)葡聚糖的提取及其性能分析[J]，浙江大學學報，1999，26(2):7579)除去濃縮液中的蛋白質，所得溶液為初步提純的蟲草素溶液，作為進一步制作蟲草素精制品的原料。(4)發酵液中蟲草素濃度的測定取上述步驟制備的最終濃縮液0.2ml，稀釋至lml，常溫下于12000rpm離心5min后，用高效液相色譜進樣針取上清作為進樣的樣品。高效液相(HPLC)色譜條件的選擇利用乙腈:水體積比7:93作為流動相，流速為lml/min，使發酵液中蟲草素與其它組分達到基線分離；蟲草素的保留時間少于20min，在進樣后10min左右出峰，做3個重復檢測，平均峰面積為36076456，根據蟲草素標準曲線所得值乘以稀釋倍數，即可以得到蛹蟲草發酵液中蟲草素濃度為3028昭/ml。蟲草素標準品曲線見附圖5所示。蟲草素標準品高效液相色譜圖見附圖8所示。不同發酵階段的發酵液中腺苷和蟲草素含量的對照圖見附圖9所示。終止發酵時發酵液高效液相色譜圖見附圖IO所示。(5)發酵培養條件優化表2顯示了本發明的蛹蟲草液體發酵過程中總糖、還原糖、氨態氮和蟲草素含量的變化。由表2可以看出，蛹蟲草液體發酵過程中總糖和還原糖在發酵進行到第12d時幾乎消耗殆盡，氨基氮的含量先上升后下降，蟲草素的含量在發酵的第8天開始激增，至發酵結束時發酵液中蟲草素的含量達到3028嗎/ml。表2蛹蟲草發酵過程中發酵液主要物質的變化趨勢測定<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>在本發明的實施例中，申請人比較了菌種3種不同制作方式對發酵液中蟲草素得率的影響。試驗采用的菌種為本發明所得的蛹蟲草菌株BYB-08，按以下方案設計(1)培養皿固體菌種培養基接種，避光培養20d后制成分生孢子懸液；(2)培養皿固體菌種培養基接種，避光培養15d后，再加光照培養5d后制成分生孢子懸液；(3)液體發酵培養基(其配方同上述發酵罐液體培養基)接種分生孢子并振蕩培養4d后作為菌種。將上述3種方式得到的菌種接種到發酵罐的液體培養基中，在22'C下避光培養712d。試驗結果見表3所示。表3菌種不同制備方法對發酵液中蟲草素含量的影響(單位(ig/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>說明表3使用的菌種為本發明獲得的蛹蟲草BYB-0S菌株。表4顯示了不同接種量對蛹蟲草發酵的影響。采用表3所制備的菌種進行接種，接種量分別按菌種占培養基體積的1%，2%，3%，4%，5%進行接種。試驗結果見表3。表4菌種不同接種量對蛹蟲草發酵的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>從表3、表4、圖6、圖7和圖11試驗數據的比較可以看出，本發明所得的最佳工藝和菌種制作工藝為培養皿菌種固體培養基接種，避光培養15d后再光照培養5d，制成分生孢子懸液作為發酵罐液體培養基用菌種；深層振蕩發酵4d，再表層靜止發酵16d，接種量為培養基體積的12%(分生孢子懸液濃度為3.2xl0MVmL)，發酵初始pH為6.57.0。同其它對照相比，本發明的生產工藝所得蛹蟲草發酵液中蟲草素含量最高。本發明中不同培養基的對比試驗結果見表5。表5本發明液體發酵培養基中不同配方對蟲草素含量的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表5可知，本發明中液體培養基配方中以試驗2、3、4、6、7培養效果較好，其中試驗3效果最好，發酵液中的蟲草素含量最高達3167嗎/mL，平均含量為3028嗎/mL。研究結果表明，本發明采用深層發酵培養和靜置表層發酵培養工藝相結合，所獲得的發酵液中蟲草素含量比文獻公開報道和專利文獻公開的方法所獲得的蟲草素產量有明顯提高。權利要求1、一種生產蟲草素的方法，其特征在于，采用液體深層發酵和表層發酵相結合的方法進行發酵，其步驟如下(1)將保藏號為CCTCCNOM207091的蛹蟲草菌株BYB-08，接種于固體培養基的平皿內，于20～28℃避光培養15d，再用散射光培養5d，用無菌水洗下分生孢子制成分生孢子懸液，備用；(2)將步驟(1)得到的分生孢子懸液接入發酵罐的液體發酵培養基中，接種量按孢子懸液與液體培養基體積比為1～2％的量接入；(3)按照所述的液體深層發酵和表層發酵相結合的方法培養步驟(2)的培養物在發酵培養起始階段，控制發酵罐通氣量為120～170ml/min，攪拌速度為150rpm～200rpm，溫度為23～27℃，培養3～4d后，待發酵液中還原糖濃度為0.05～0.09g/L時停止深層攪拌發酵，將發酵液轉移至容器口蓋有滅菌紗布的廣口容器中，控制發酵溫度為23～27℃，靜止表層發酵16～20d后停止發酵，得到含蟲草素的發酵原液；(4)將步驟(3)得到的蟲草素發酵原液以3000rpm，25℃離心30分鐘，取上清液，將該上清液經減壓濃縮至發酵原液體積的1/10左右，加入3倍體積的95％乙醇，去除其中的沉淀物，將剩余的發酵原液貯藏在2℃條件下，采用5000rpm離心10min后取上清，再經減壓蒸出乙醇，將其濃縮至發酵原液體積的1/5左右，去除其中的蛋白，得到初步提純的蟲草素溶液，其中步驟(1)所述的固體培養基組分為按重量體積計，馬鈴薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，KH2PO41g，MgSO40.5g，VB110mg，瓊脂粉20g，補充自來水至1000ml，調pH至6.5～7.5；步驟(2)在發酵罐中的液體培養基按照重量體積計為葡萄糖2％，豆粕8％，馬鈴薯浸出粉2％，腺苷0.6％，KH2PO40.2％，MgSO40.1％，補充自來水至100％，調pH至6.5～7.0，備用。2、一個選育的蛹蟲草菌株(Co/^KceAS肌7itarj's)BYB-08，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為CCTCCNO:M207091。3、權利要求2所述的蛹蟲草菌株BYB-08在生產蟲草素及其制品中的應用。全文摘要本發明屬于農業微生物
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。具體涉及一種生產蟲草素的方法，高產蛹蟲草菌株的選育與應用。本發明通過誘變選育得到一株高產蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)菌株BYB-08，該菌株作為專利程序已于申請日前保藏在中國典型培養物保藏中心(保藏號為CCTCCNOM207091)。本發明公開了本發明獲得的蛹蟲草菌株BYB-08在優化的深層發酵和靜置表層發酵培養相結合的方法中的成功實施例，本發明所獲得的發酵液中蟲草素含量比現有專利文獻和非專利文獻報道的方法所獲得的蟲草素生物學產量有非常明顯的提高。文檔編號C12P19/40GK101245361SQ20081010171公開日2008年8月20日申請日期2008年3月11日優先權日2008年3月11日發明者俞海峰,周洪英,邊銀丙申請人:華中農業大學