專利名稱：16型重組人乳頭瘤病毒疫苗的制作方法
技術領域：
本發明涉及人乳頭瘤病毒感染的預防和治療領域。具體地，本發明涉及 16型重組人乳頭瘤病毒疫苗及其應用。
背景技術：
子宮頸癌(Cervical Cancer)每年直接造成約超過30萬成年女性死亡(國 際衛生組織資料)，成為世界范圍內僅次于乳腺癌的威脅婦女生命健康的第二 號殺手。科學研究證實，導致宮頸癌的罪魁禍首是一種名為人乳頭瘤病毒 (Human Papillomavirus,簡稱HPV)的DNA致癌病毒。該病毒主要通過兩
性接觸傳染，專性侵染人體上皮細胞特別是生殖器官，部分病毒攜帶者在反 復感染后表現出多種臨床癥狀。女性受高危險型(HPV16、 HPV18等)病毒感 染后，小部分患者由最初的宮頸細胞學異常，發展成i-ni的宮頸內皮細胞 瘤樣變(CIN I-III)和浸潤性宮頸癌變(ICC)，最終發展成致命的子宮頸癌。 部分低危險型(HPV6、 HPV11)病毒感染可導致男女兩性生殖器官部位的尖銳濕疣。
最新研究表明HPV除了直接導致宮頸癌，還與支氣管肺癌、直腸癌、口 腔癌和皮膚癌有重大關系。根據國際衛生組織WHO的有關資料，除了導致宮 頸癌，HPV感染還可能解釋60。/。的皮膚癌，60%的食管癌，50%的肺癌、50 %的乳腺癌、25%的口腔癌等人類重大癌癥。
HPV病毒在長期的進化中形成了上百種變異類型，其中HPV16、 HPV18等 13種高危險型確認能夠導致宮頸癌癥，HPV6、 HPV11等低危險型是造成男女 生殖部位尖銳濕疣的關鍵病原體。在眾多高危險型中HPV16占全部宮頸癌的 約50%，本發明正是針對由HPV16引起的感染所設計的疫苗。
發明內容
(一)要解決的技術問題
3本發明的目的之一是提供16型重組人乳頭瘤病毒疫苗；本發明的另 一 目
的是提供該重組人乳頭瘤病毒疫苗制備藥物中的應用。 (二)技術方案
本發明所述的16型重組人乳頭瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐劑、 可藥用的賦型劑、穩定劑等輔料，其中，所述的活性成分包括重組HPV16L1 蛋白五聚體。
所述輔料中的佐劑包括鋁鹽、3-0-去酰化單磷酸類脂(3D-MPL)、脂質
A衍生物。
所述輔料中的賦型劑包括生理鹽水及其它藥物上可接受的賦型劑。 所述輔料中的穩定劑包括基于磷酸鹽的生理緩沖液。 所述重組HPV16L1蛋白五聚體的含量為40-50yg/支疫苗。 本發明所述的疫苗還可包括HPV16的L2蛋白、其它能與HPV16 Ll蛋 白五聚體結合的蛋白，例如HPV16的E6/E7蛋白。 一種生產所述疫苗的方法，它包括如下步驟
(1) 表達、分離、純化重組HPV16L1蛋白五聚體；
(2) 將所得重組HPV16 Ll蛋白五聚體與輔料混合制劑，得到16型重 組人乳頭瘤病毒疫苗。
其中，表達、分離、純化重組HPV16 Ll蛋白五聚體的具體方法參見專 利PCT/CN2008/000314、 CN200810055700.5，得到純度為95%以上的Ll蛋 白五聚體。
本發明公開了所述疫苗在制備用于預防和/或治療由HPV16引起的感染 和疾病的藥物中的應用。
本發明還公開了所述疫苗在制備用于預防和/或治療由于抗體交叉反應 而由HPV16以外的其它一種或多種HPV型引起的感染和疾病的藥物中的應 用。
前述的感染和疾病包括子宮頸癌、尖銳濕疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直 腸癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關的疾病。優選地，所述的感染和疾病是由HPV16引起的子宮頸癌。
本發明所述的疫苗可釆用多種方法作用于人體，包括肌肉和皮下注射。
該疫苗在能引發對L1蛋白免疫反應的有效劑量范圍內使用。用于增強免疫反
應的復合物的特定劑量依照Ll復合物不同而變化。 一般而言，Ll五聚體的
用量在l-5jLig/Kg體重之間。上述劑量范圍并不排除更高或更低劑量的可能。
例如，具體的劑量會根據是否伴隨有其他藥物劑量而定，或取決于個人的藥
代動力學、藥物積累和代謝速率。 (三)有益效果
本發明所述的16型重組人乳頭瘤病毒疫苗能夠預防50%宮頸癌，同時 也能預防由HPV16感染引起的其它疾病。該疫苗的活性成分為HPV16 Ll蛋白 的五聚體，該五聚體與HPV16 Ll蛋白的VLP (類病毒顆粒，為HPV16 Ll蛋 白的七十二聚體)具有相同的免疫原性和抗原性，且相對于VLP而言具有結 構更穩定、工業成本大幅降低的優點。所以，本發明所述的疫苗與目前已有 的疫苗(活性成分均為HPV Ll蛋白的VLP)相比，質量穩定、成本低廉，給
發展中國家的患者帶來了福音，具有良好的經濟效益和深遠的社會影響。
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例l 16型重組人乳頭瘤病毒疫苗的制備
以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。
1、 克隆HPV16 Ll衣殼蛋白基因，克隆到T-Easy vector質粒(購自美國 Promega生物試劑公司)上。
2、 修飾HPV16 Ll衣殼蛋白基因，并在大腸桿菌中表達將含有堿基替 代突變的載有HPV16 Ll基因插入片段的表達質粒pGEX-6-l通過熱激法導入 大腸桿菌BL21細胞之后，使用LB培養基(配方見《分子克隆》第三版，科學 出版社，2002年8月出版)進行攝氏37度培養，菌種接入后生長12小時開始用表達誘導劑IPTG (購自美國Promega公司)誘導，9小時后收獲細胞，細胞用 Niro Soavi NS2006型高壓勻質機在800bar下重復破碎細胞2次，顯微鏡檢査 細胞破碎率達到90°/。以上。
3、 HPV16 Ll蛋白的五聚體的分離、純化上清溶液中的L1蛋白經親和 色譜純化蛋白預裝谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂(Amersham公司生產的 Glutathione Sepharose 4 B )色譜柱，取濃度為50%的Glutathione Sepharose 4B勻漿放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml勻漿)。用5-IO倍的柱床 體積的緩沖液A(組分為50 mmol/L Trie-HC1, 200mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA ，pH 8.0)洗滌樹脂，將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻并在室 溫下作用20分鐘后放出濾過液，用10倍柱床體積的緩沖液A洗滌樹脂柱。用電 鏡觀察純化產物，得到HPV16 Ll的五聚體。
4、 活性成分與輔料混合制劑將純化的HPV16Ll的五聚體與含有100mM NaCl的標準磷酸緩沖液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩沖液置換
(buffer exchange,見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得L1 五聚體保存在pH值為7.2的磷酸緩沖液中，通過調整L1蛋白五聚體的濃度至 50jig/支疫苗，制劑成為16型重組人乳頭瘤病毒疫苗，在4'C保存。
實施例2 16型重組人乳頭瘤病毒疫苗的制備
以下步驟中涉及的基因克隆、修飾等的操作參見PCT/CN2008/000314、 CN200810055700. 5。
1、 克隆HPV16 Ll衣殼蛋白基因，克隆到T-Easy vector質粒(購自美國 Promega生物試劑公司)上。
2、 修飾HPV16 Ll衣殼蛋白基因，并在大腸桿菌中表達將含有堿基替 代突變的載有HPV16 Ll基因插入片段的表達質粒pGEX-6-l通過熱激法導入 大腸桿菌BLn細胞之后，使用LB培養基(配方見《分子克隆》第三版，科學 出版社，2002年8月出版)進行攝氏37度培養，菌種接入后生長12小時開始用 表達誘導劑IPTG (購自美國Promega公司)誘導，9小時后收獲細胞，細胞用Niro Soavi NS2006型高壓句質機在800bar下重復破碎細胞2次，顯微鏡檢查 細胞破碎率達到90%以上。
3、 HPV16 Ll蛋白的五聚體的分離、純化上清溶液中的L1蛋白經親和 色譜純化蛋白預裝谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂(Amersham公司生產的 Glutathione Sepharose 4 B)色譜柱，取濃度為50%的Glutathione Sepharose 4B勻漿放入色譜柱中(每200ml蛋白清液需要5-10ml勻漿)。用5-10倍的柱床 體積的緩沖液A(組分為:50咖ol/L Tric-HCl， 200咖ol/L NaCl， 1畫1/L EDTA，pH8. O)洗滌樹脂，將蛋白清液加入色譜柱中，與樹脂混合均勻并在室 溫下作用20分鐘后放出濾過液，用10倍柱床體積的緩沖液A洗滌樹脂柱。用電 鏡觀察純化產物，得到HPV16 Ll的五聚體。
4、活性成分與輔料混合將純化的HPV16 Ll的五聚體與含有100mM NaCl 的標準磷酸緩沖液(見《分子克隆實驗指南》第三版，)通過緩沖液置換(buffer exchange,見《分子克隆實驗指南》第三版)方式混合，使得L1五聚體保存 在pH值為7.2的磷酸緩沖液中，同時加入氫氧化銷150Mg,通過調整L1蛋白 五聚體的濃度至40Mg/支疫苗，制劑成為16型重組人乳頭瘤病毒疫苗，在4
x:保存。
實施例3 16型重組人乳頭瘤病毒疫苗的動物安全性試驗
將實驗用成年健康雄性或雌雄比戈犬按照急性毒性、慢性毒性、生殖毒 性、異常毒性的實驗目標要求隨機分組，每個目標組有比戈犬42只，目標組 內再分為7個小組，每小組6只，其中3個小組作為一個試驗劑量處理重復， 另1個小組作為空白實驗對照，然后對每只處理比戈犬按照實驗目標要求的 劑量分三次肌肉注射實施例1所制得的16型重組人乳頭瘤病毒疫苗，注射的 間隔期為14天。空白對照注射不含HPV16 Ll蛋白五聚體的磷酸鹽生理緩沖 液。生殖毒性目標組全部使用懷孕兩周的雌雄動物，第一次注射后開始觀察 和記錄妊娠情況；
急性毒性和異常毒性目標組在給定劑量(最高劑量為人體標準允許劑量200810101637.4
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的20倍)第一次注射后立即開始觀察和記錄動物出現的任何異常情況；在給 定劑量注射三次注射兩周后進行解剖，按照急性毒性和異常毒性實驗要求釆 集體血液和內各器官組織的樣本進行相關指標的檢查和化驗，對釆集的實驗 數據進行統計分析。檢驗結果發現，重組HPV16疫苗對供試動物未發現任何 可觀測到的急性毒性和異常毒性，全部毒性檢測指標為陰性。
慢性毒性目標組在給定劑量注射三次后，連續喂養觀察動物90天，90 天后按照慢性毒性實驗要求采集體內各器官組織的樣本進行相關指標的檢查 和化驗，對釆集的實驗數據進行統計分析。檢驗結果發現，重組HPV16疫苗 對供試動物未發現任何可觀測到的慢性毒性，全部毒性檢測指標為陰性。
生殖毒性目標組全部使用懷孕2-3周的雌雄動物，在三次注射完成后的 第14天解剖動物，按照生殖毒性實驗要求釆集體血液和內各器官組織的樣本 進行相關指標的檢查和化驗，對釆集的實驗數據進行統計分析。檢驗結果發 現，重組HPV16疫苗對供試動物未發現任何可觀測到的生殖毒性，全部生殖 毒性檢測指標為陰性。
實施例4 16型重組人乳頭瘤病毒疫苗的動物有效性試驗
ED50實驗將供試8-10周齡BALB/c雄性小鼠隨機分為6組，每組10只， 留一個使用對照組，其余5個小組的每只小鼠分三次腹腔注射實施例l所制 得的16型重組人乳頭瘤病毒疫苗，每次注射劑量為0. 0125微克、0. 05微 克、0.2微克、0.8微克和3.2微克劑量。第三次注射后14天，釆集小鼠血 液，使用Ll蛋白五聚體為抗原，ELISA法檢測血液內由HPV16 Ll抗原誘導 的特異抗體的水平。檢驗結果發現，重組HPV16疫苗能夠誘導供試動物產生 強烈的抗體保護反應，計算得到抗體有效中濃度ED50在0. 4 - 2. 0微克。
將供試8-10周齡動物BALB/c雄性小鼠隨機分為6組，每組10只，留一個 使用對照組，其余5個小組的每只小鼠分三次腹腔注射實施例1所制得的16型 重組人乳頭瘤病毒疫苗，每次注射劑量為計算出的ED50劑量。第三次注射后 14天，釆集小鼠血液，使用L1蛋白五聚體為抗原，ELISA法檢測血液內由HPV16Ll抗原誘導的特異抗體的水平。檢驗結果發現，重組HPV16疫苗能夠誘導供試 動物產生強烈的抗體保護反應，抗原的免疫原性及抗體的滴度水平很高，抗 體血清在稀釋1000倍后仍然顯著高于對照的背景水平。
實施例5 16型重組人乳頭瘤病毒疫苗的動物穩定性試驗
為檢測疫苗的穩定性，實驗疫苗分別在攝氏4度、25度和37度保存，在0 天、15天、30天、90天、180天、360天和540天分別檢測疫苗的物理化學性 狀及生物活性。
在上述每個預定的檢測日期，對在不同溫度條件下保存的疫苗樣品取出 進行純度、分子量、外觀色澤、可見異物、降解程度等一系列生理生化指標 測量(方法均為本領域技術人員熟知的常規操作)，并與O天對照相比較。檢 測結果發現，在攝氏4度條件下，疫苗在540天內的各項理化指標保持高度穩 定，無顯著改變。
生物活性測定時，將供試試8-10周齡BALB/c雄性小鼠隨機分為4組，每 組10只，留一個使用對照組，其余3個小組的每只小鼠分三次腹腔注射實施例 1所制得的16型重組人乳頭瘤病毒疫苗，每次注射劑量為計算出的ED50劑量。 第三次注射后14天，釆集小鼠血液，使用L1蛋白五聚體為抗原，ELISA法檢測 血液內由HPV16 Ll抗原誘導的特異抗體的水平。檢驗結果發現，重組HPV16 疫苗在攝氏37度下的免疫原性與0天對照相比可維持19天不變，在攝氏25下的 免疫原性可維持90天不變，在攝氏4度下的免疫原性維持540天不變。進一步 的穩定性實驗仍然在進行中。
權利要求
1、16型重組人乳頭瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑、穩定劑等輔料，其特征在于所述的活性成分包括重組HPV16L1蛋白五聚體。
2、 根據權利要求1所述的疫苗，其特征在于所述輔料中的佐劑包括 鋁鹽、3D-MPL、脂質A衍生物。
3、 根據權利要求l所述的疫苗，其特征在于所述輔料中的穩定劑包括基 于磷酸鹽的生理緩沖液。
4、 根據權利要求l所述的疫苗，其特征在于所述重組HPV16L1蛋白五 聚體的含量為40 - 50 )i g/支疫苗。
5、 一種生產如權利要求l-4之任一所述疫苗的方法，它包括如下步驟(1) 表達、分離、純化重組HPV16L1蛋白五聚體；(2) 將所得重組HPV16 Ll蛋白五聚體與輔料混合制劑，得到16型重 組人乳頭瘤病毒疫苗。
6、 根據權利要求1所述的疫苗在制備用于預防和/或治療由HPV16引起 的感染和疾病的藥物中的應用。
7、 根據權利要求1所述的疫苗在制備用于預防和/或治療由于抗體交叉 反應而由HPV16以外的其它一種或多種HPV型引起的感染和疾病的藥物中 的應用。
8、 根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于所述的感染和疾病包括 子宮頸癌、尖銳濕疣、乳腺癌、支氣管肺癌、直腸癌、食道癌、咽癌、口腔 癌、皮膚癌及其它與HPV密切相關的疾病。
9、 根據權利要求8所述的應用，其特征在于所述的感染和疾病是由 HPV16引起的子宮頸癌。
全文摘要
本發明提供了16型重組人乳頭瘤病毒疫苗，它包括活性成分以及佐劑、可藥用的賦型劑、穩定劑等輔料，所述的活性成分包括重組HPV16 L1蛋白五聚體。該疫苗能夠預防約50％官頸癌，同時也能預防由HPV16感染引起的其它疾病。本發明所述的疫苗與目前已有的疫苗相比，質量穩定、成本低廉，給發展中國家的患者帶來了福音，具有良好的經濟效益和深遠的社會影響。
文檔編號C12N15/70GK101530612SQ20081010163
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月10日 優先權日2008年3月10日
發明者陳小江, 馬潤林 申請人:北京康樂衛士生物技術有限公司