低表達cyp7a1的肝細胞及其構建方法

文檔序號：565025閱讀：608來源：國知局

專利名稱：低表達cyp7a1的肝細胞及其構建方法
技術領域：
本發明涉及小干擾RNA及其編碼基因與應用，特別是涉及抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA及其編碼基因與其在抑制肝細胞中CYP7A1基因表達水平中的應用。
背景技術：
由多種原因(病毒、藥物、腫瘤和遺傳性疾病等)引發的終末期肝病嚴重威脅到人類的健康。肝移植是目前治療終末期肝病最為有效的方法，但是受者對移植物的排斥是移植成功的主要障礙。近年來，國內外著重致力于生物人工肝(bioartificialhver system, BAL)支持療法的基礎研究，以使其短期支持肝臟功能，維持并延長患者生命，幫助患者渡過危險期，提高患者的存活率，從而為肝臟移植贏得寶貴時間。
分泌膽汁酸是肝細胞特有的生理功能，對膽固醇的溶解和食物脂類的消化、吸收具有重要意義。膽汁酸主要在肝細胞內由膽固醇轉化而來，具有經典途徑和替代途徑兩種合成途徑。大部分膽汁酸由經典途徑合成，而膽固醇7a羥化酶(CYP7A1， cholesterol 7ahydroxylase， GenBank號NM— 000780)是肝細胞生物合成膽汁酸經典途徑的起始酶，也是關鍵酶，其表達水平的高低反映了膽汁酸合成的快慢。
生物人工肝(BAL)是專指人工培養的肝細胞為基礎構體的體外生物反應系統。生物入工肝在體外與患者循環通路相連，由人工部分(生物反應器)和生物部分(肝細胞)組成。其基本原理是將體外培養的肝細胞置于體外循環裝置(生物反應器)中，患者血液(血漿)流過生物反應器時，通過容器內的纖維素半透膜或直接與肝細胞進行物質交換，從而達到人工肝支持肝功能的目的。
在BAL設計中常常忽略了膽汁酸的排除問題，因此膽汁酸只能靠殘留的受損肝臟或直接經由血液循環排出。BAL內的肝細胞不斷產生膽汁酸鹽，它們多數具有與蛋白結合的毒性，從而進一步提高了血中的膽汁酸濃度。
慢病毒(Lentivirus)載體系統具有如下特點(1)安全，病毒大部分基因被刪除或替換，所以病毒不具備自身復制能力，而且因為刪除了LTR3'U3使病毒不能產生病毒RNA，病毒具有自身滅活作用；(2)宿主范圍廣，由于用VSV-G替代HIV的胞膜糖蛋白，人、鼠等多種屬多類型細胞都能高效感染；(3)不僅保留了普通逆轉錄病毒穩定整合宿主基因組的特點，而且增加了高效感染靜止期細胞以及高表達外源蛋白并且能逃避甲基化抑制的特點。慢病毒載體系統的這些特點使得其在分子生物
學、細胞生物學等多學科和多領域中均得到廣泛應用。

發明內容
本發明的目的是提供一種效果顯著的抑制肝細胞中CYP7A1表達水平的方法。本發明所提供的抑制肝細胞中CYP7A1表達水平的方法，是將抑制CYP7A1基因
表達的小干擾RNA編碼基因導入肝細胞，肝細胞中CYP7A1的轉錄水平得到抑制。在上述抑制肝細胞中CYP7A1表達水平的方法中，可按照常規方法設計抑制
CYP7A1基因表達的小干擾RNA，具體來講，所述抑制CYP7A1基因表達的小干擾
RNA，可為下述雙鏈RNA序列之一
1) 正義鏈為序列表中的SEQIDNo: 1，反義鏈為序列表中SEQIDNo: 2的雙鏈RNA序列；
2) 正義鏈為序列表中的SEQIDNo: 3，反義鏈為序列表中SEQ ID No: 4的雙鏈RNA序列
3) 正義鏈為序列表中的SEQIDNo: 5，反義鏈為序列表中SEQ ID No: 6的雙鏈RNA序列。
將具有1 )的雙鏈RNA序列命名為siRNAl ，其反義鏈與mRNA(GenBank 號NM—000780)的1083-1101位置序列5'-gaaugaccugccaguauuau-3，互補。序列表中的SEQ ID No: l由20個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端—3'端；序列表中的 SEQ ID No: 2由20個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端—3^^。
將具有2)的雙鏈RNA序列命名為siRNA2，其反義鏈與mRNA的 1047-1065位置序列5，-ggaaggcaauccuauuuguu-3，互補。序列表中的SEQ ID No: 3由20 個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端—3'端；序列表中的SEQIDNo: 4由20個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端—3'端。
將具有3 )的雙鏈RNA序列命名為siRNA3 ，其反義鏈與C1757^ mRNA的987-1005 位置序列5'-gaaagcagcuacugaagaau-3，互補。序列表中的SEQ ID No: 5由20個堿基組成，序列的方向從左至右為5端—3'端；序列表中的SEQIDNo: 6由20個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端—3端。
為獲得更高的穩定性和更優越的抑制效果，可將所述抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的3'端雙核苷酸懸垂(Bass BL. RNA interference. The short answer-Nature, 2001， 411:428 429)，以使其較難被核酶降解。
具體來講，所述抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA分子的編碼基因可具有下述l) 、 2)和3)中至少一個雙鏈核苷酸序列(請確認下述序列)1) 有義鏈(正義鏈)(不做模板的DNA鏈)具有序列表中SEQIDNo: 7的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No: 7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈(做模板的DNA鏈)具有序列表中SEQIDNo: 8的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No: 8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；
2) 有義鏈(正義鏈)具有序列表中SEQIDNo: 9的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNo: 9限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID No: 10的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No: 10 限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；
3) 有義鏈(正義鏈)具有序列表中SEQIDNo: 11的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNo: 11限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ ID No: 12的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No: 12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴謹條件可為在0.1xSSPE(或O.lxSSC)， 0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下雜交并洗膜。
將具有l)的雙鏈寡核苷酸序列編碼基因命名為siDNAl，編碼siRNAl。序列表中的SEQIDNo: 7由55個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端—3'端；序列表中的SEQ ID No: 8由59個堿基組成，序列的方向從左至右為3端—5端。
將具有2)的雙鏈寡核苷酸序列編碼基因命名為siDNA2，編碼siRNA2。序列表中的SEQIDNo: 9由55個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端—3'端；序列表中的SEQIDNo: 10由59個堿基組成，序列的方向從左至右為3'端—5'端。
將具有3)的雙鏈寡核苷酸序列編碼基因命名為siDNA3，編碼siRNA3。序列表中的SEQIDNo: 11由55個堿基組成，序列的方向從左至右為5'端—3'端；序列表中的SEQIDNo: 12由59個堿基組成，序列的方向從左至右為3'端—5^^。
此外，可按照常規方法將抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞，如通過含有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組真核表達載體或利用慢病毒載體系統將抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞。
所述利用慢病毒載體系統將本發明抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞的方法，可包括以下步驟
A)將抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入慢病毒載體系統中的目的基因轉移載體中，得到攜帶有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒載體；B) 將攜帶有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒載體與慢病毒載體系統中的兩種包裝質粒和包膜質粒按4.5-5.5: 3.7-4.7: 1.5-2.5:2.3-3.3的重量份數比混合后，用脂質體介導法轉染慢病毒包裝細胞，得到攜帶有抑制CYP7A1 基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒；
C) 將攜帶有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒轉染肝細胞，肝細胞中CYP7A1的表達水平得到抑制。
在上述利用慢病毒載體系統將本發明抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞的方法中，步驟A)中慢病毒載體系統中的目的基因轉移載體為pSicoR
(Andrea Ventura, Alexander Meissner, Tyler Jacks, al et.Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes. PNAS,2004 vol.101 no.28,10380—10385 )用限制性內
切酶T^ I和&/ I進行雙酶切(切除兩個酶切位點之間的基因片段)后與正義鏈為
5 ，-ggctagcatgctctagagcgctg-3 ，，反義,連為3 ，-acgtccgatcgtacgagatctcgcgacagct-5 ，白勺多克隆位點序列連接得到。)，優選為慢病毒RNA汗涉載體pSicoR;攜帶有抑制CYP7A1 基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒載體可為pSicoR-CYP7Al-l、 pSicoR-CYP7Al-2或pSicoR陽CYP7Al-3。步驟B)中的慢病毒載體系統中的兩種包裝質粒可為pLPl和pLP2 (均可購自 Invitrogen公司)，該包裝質粒主要起到病毒包裝作用，其轉錄表達后形成病毒衣殼結構蛋白及酶蛋白；包膜質粒可為pLP/VSVG (可購自Invitrogen公司)，該包膜質粒轉錄表達后形成病毒包膜蛋白；慢病毒包裝細胞可為293-FT細胞(可購自Invitrogen 公司)。
步驟C)中還包括對經攜帶有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒轉染的肝細胞進行流式細胞術分選的步驟，從而得到低表達CYP7A1的肝細胞。
用上述方法得到的低表達CYP7A1的肝細胞也屬于本發明的保護范圍。本發明提供了低表達CYP7A1的肝細胞及其構建方法。所述低表達CYP7A1的肝細胞是通過將抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞后得到的。可利用慢病毒載體細胞將所述抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞。實驗證明，用本發明的方法可顯著下調(knockdown)肝細胞中CYP7A1基因在mRNA水平和蛋白水平的表達水平，并可進一步有效降低總膽汁酸的分泌量，從而改善了肝細胞培養的微環境，提高了肝細胞的生存質量，同時還能較好地維持其生物學功能。此外，用本發明方法獲得的低表達CYP7A1的肝細胞進植，避免了植入患者體內的生物人工肝中肝細胞分泌的膽汁酸對肝細胞本身的毒害作用以及可能造成的其它不良影響。本發明低表達CYP7A1的肝細胞及其構建方法可用于生物
人工肝支持療法的基礎研究及臨床應用中，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。說明書附圖

圖1為攜帶有siDNAl、 siDNA2或siDNA3的重組慢病毒RNAi干涉載體的雙酶切鑒定結果
圖2為慢病毒包裝前、后293-FT細胞的熒光顯微鏡觀察結果
圖3為經慢病毒感染前、后的L-02細胞的熒光顯微鏡觀察結果
圖4為經由攜帶pSicoR-CYP7Al的慢病毒轉染的L-02細胞的流式細胞術分選結
果
圖5為慢病毒感染前、后的肝細胞的生物學特性基因ALB、 J尸尸、C《7S、 C《W 和CT尸7W mRNA水平的表達情況的半定量RT-PCR法檢測結果
圖6為轉pSicoR-CYP7Al的L-02與轉染空載體pSicoR的L-02肝細胞中CYP7A1 基因表達情況的半定量RT-PCR檢測結果以及CYP7A1 siRNA干涉效果的實時熒光定量RT-PCR檢測結果
圖7為轉pSicoR-CYP7Al的L-02與轉染空載體pSicoR的L-02肝細胞中CYP7A1 蛋白表達情況的Western blot檢測結果
圖8為轉pSicoR-CYP7Al的L-02與轉染空載體pSicoR的L-02肝細胞的生長曲
線
圖9為轉pSicoR-CYP7Al的L-02與轉染空載體pSicoR的L-02肝細胞的總膽汁酸分泌量測定
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。所用引物及DNA序列均由北京奧科生物公司合成。
所述百分比濃度均為質量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。所述各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，而不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的同類生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用；在產業實施中，來源于大鼠、小鼠、豬或人等哺乳動物的各種細胞均為離體的，并包括從細胞庫中取得、從商業途徑購買獲得，還包括按照已有文獻的介紹制備獲得，以及經可以商業獲取的多種干細胞用己知方法誘導而來的。實施例1、低表達CYP7A1的L-02肝細胞的獲得應用RNAi技術及慢病毒載體系統獲得低表達CYP7A1的肝細胞(以人肝細胞 L-02細胞株為例)，具體方法包括以下步驟
一、 L-02肝細胞的傳代擴增
將L-02肝細胞(由軍事醫學科學院實驗血液學實驗室惠贈)接種于25cmH咅養瓶中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基(購自Sigma公司)在37。C、 5%(302細胞培養箱內進行平面常規培養，隔天更換培養液，用0.25% (V/V)胰酶消化傳代，在相同條件下進行培養。
二、抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的設計
根據GenBank公布的CZP7J7 mRNA序列(NM— 000780)以及慢病毒RNAi干涉載體pSicoR的使用要求，用Gene specific siRNA selector軟件
(http://bioinfo.wistar.upenn.edu/siRNA/siRNA.htm)設計三對以CYP7A1編碼區為耙點的特異性CYP7A1 siRNA序列，分別命名為siRNAl (序列表中序列1和序列2)、 siRNA2 (序列表中序列3和序列4)和siRNA3 (序列表中序列5和序列6) ， siRNAl 作用于Cy 7J7 mRNA的1083-1101位置序列5，- gaaugaccugccaguauuau -3，， siRNA2 作用于CT尸7J/ mRNA的1047-1065位置序列5，- ggaaggcaauccuau皿guu -3，， siRNA3 作用于CJ7VJ/ mRNA的987-1005位置序列5，- gaaagcagcuacugaagaau -3，。
三、抑制CYP7A1基因表達的慢病毒RNAi干涉載體的構建
1、根據siRNAl、 siRNA2和siRNA3所作用的靶序列以及慢病毒RNAi干涉載體 pSicoR的使用要求，設計能夠產生siRNAl、 siRNA2和siRNA3的siDNA序列，分別命名為siDNAl、 siDNA2禾P siDNA3，具體序列如下(下劃線堿基序列為針對CTPZ4/ mRNA的耙序列) siDNAl正義鏈
5，- tgaatgacctgccagtattattcaagagataatactggcaggtcattcttttttc-3,(序歹U表中序歹lj7) siDNAl反義鏈
3，-acttactggacggtcataataagttctctettatgaccgtccagtaag:aaaaaagagct-5，(序歹ij表中序歹lj8); siDNA2正義鏈
5'-tggaaggcaatcctatttgtttcaagagaacaaataggattgccttccttttttc-3，(序歹U表中序歹l1 9) siDNA2反義鏈
3，-accttccgttaggatoaacaaagttctcttgtttotcctoacggaaggaaaaaagagct-5，( 序歹U表中序歹lllO); siDNA3正義鏈
5,-tgaaagcagctactgaagaattcaagagattcttcagtagctgctttcttttttc-3'( 序歹ll表中序歹llll) siDNA3反義鏈3，-actttcgtcgatgacttcttoagttctcteagaactcatcgacgaaagaaaaaagagct-5，( 序歹U表中序歹lJ 1 2)。 2、合成步驟l中的三對siDNA序列，然后取正向、反向siDNA寡核苷酸片段 (siDNAl、 siDNA2或siDNA3)各l)itl與48/^1退火緩沖液混合，在95。C下溫育4min 后，再在70。C下溫育10min，然后緩慢冷卻至室溫進行退火；取5/d退火后的siDNA 雙鏈寡核苷酸片段加到2;ulT4DNA連接酶緩沖液中，加入1UPNK激酶，在37"C下溫育30min后，再在70"C下溫育10min進行磷酸化反應；同時用限制性內切酶//;^ I 和lo/1將慢病毒RNAi干涉載體pSicoR (Pro.Tyler Jacks惠贈)線性化；再將線性化的慢病毒RNAi干涉載體pSicoR與磷酸化后的siDNA雙鏈寡核苷酸片段進行連接，將重組質粒轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，挑選陽性克隆，搖菌擴增并提取質粒，對質粒用限制性內切酶^w/1和處W I進行雙酶切鑒定，酶切鑒定結果如圖l所示(泳道M: DL2000 Marker,泳道l: pSicoR-CYP7Al-l雙酶切產物，泳道2: pSicoR-CYP7Al-2雙酶切產物，泳道3: pSicoR-CYP7Al-3雙酶切產物，泳道4: pSicoR 空載體雙酶切產物)，經酶切獲得400bp和350bpDNA片段的為陽性質粒，然后對經初篩獲得的陽性質粒用測序的方法做進一步鑒定，結果獲得了插入序列及位置均正確的攜帶有siDNAl、 siD—NA2或siDNA3的重組慢病毒RNAi干涉載體，分別命名為 pSicoR-CYP7Al誦l、pSicoR-CYP7Al-2和pSicoR-CYP7Al-3(統稱為pSicoR-CYP7Al )。四、慢病毒的包裝
培養293-FT (購自Invitrogen公司)慢病毒包裝細胞，培養基為添加10% FBS， 0.1 mmol/LNEAA， 2 mmol/L L-谷氨酰胺，1% 青-鏈霉素，500嗎/mL G418的高糖 DMEM培養基(Sigma公司產品，Ca快D5648)。用步驟三構建的攜帶有抑制CYP7A1 基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒RNAi干涉載體pSicoR-CYP7Al-l、 pSicoR-CYP7Al-2或pSicoR-CYP7Al-3以及空載體pSicoR (對照)分別和包裝質粒 pLPl (購自Invitrogen公司)、pLP2 (購自Invitrogen公司)及包膜蛋白質粒pLP/VSVG (購自Invitrogen公司)按5ug: 4.2ug: 2ug: 2.8ug的比例混合后加入1.5mL無血清 Opti-MEM I培養基(購自Invitrogen公司)中，輕輕混勻，在另一個無菌的5mL管中將42uL lipofectamine 2000(購自Invitrogen公司)稀釋于1.5mL的無血清Opti-MEM I培養基中，室溫靜置5分鐘，混合以上兩種液體，室溫孵育20分鐘以形成 DNA-lipofectamine2000復合物。用0.25%胰酶(Gibco公司產品，Ca快25200-056) 消化收集培養的293-FT細胞，計數約6><106個細胞，將其重懸到5mL不含抗生素的生長培養基(在高糖DMEM培養基(Sigma公司產品，Cat#D5648)的基礎上添加 10%胎牛血清(FBS) (Biochrom公司產品，cat#S0115) ， 0.1 mmol/L非必需氨基酸(Non-Essential Amino Acids， NEAA)(購自HyClone公司)禾卩2mmol/L L-谷氨酰胺)中，再將293-FT包裝細胞懸液與3mL含有DNA-lipofectamine 2000復合物的培養基混勻后加入到含有5mL不含抗生素的生長培養基的10cm細胞培養皿中，混勻，放于37"C、 5%(:02孵箱中培養，次日用含有lmmol/L丙酮酸鈉的完全培養基(在高糖DMEM培養基的基礎上添加10%胎牛血清，0.1mmol/L非必需氨基酸，2mmol/L L-谷氨酰胺，P/。青-鏈霉素和1 mmol/L丙酮酸鈉)更換含有DNA-lipofectamine 2000復合物的培養基進行包裝，并分別在包裝24、 48、 36、 72小時后取樣，對經包裝的293-FT 細胞在熒光顯微鏡下進行觀察，結果如圖2所示((a)為包裝前的293-FT細胞，(b)為經慢病毒包裝后48 — 72小時的293-FT細胞(200x))，包裝24小時后即可見到293-FT 細胞內有綠色熒光蛋白GFP表達(GFP基因為慢病毒RNAi干涉載體pSicoR攜帶)，表達綠色熒光蛋白GFP的細胞超過95。/。，表明包裝效率很高，且伴隨著包膜質粒 pLP/VSVG中VSVG基因的表達，逐漸出現293-FT細胞的多細胞合胞體，包裝72小時后培養上清為淡黃色，此時收集病毒液上清于15mL的無菌離心管中，4'C、 3000rpm 離心15min去除細胞碎片，將四種病毒上清凍存于-70。C備用。
五、慢病毒感染人肝細胞(L-02)和感染后肝細胞(L-02)的流式細胞術分選病毒感染前一天，于六孔板中接種L-02細胞至細胞密度為3xl()S細胞/孔，感染時，每孔加入lmL步驟四獲得的病毒上清和終濃度為8pg/mL的聚凝胺(polybrene，購自Sigma公司，可促進病毒的轉染效率)，晃動培養瓶使病毒液能接觸到所有細胞， 3小時后加入3mL L-02細胞培養基(RPMI1640培養基(Sigma公司產品，Cat# D0547) 按1:1體積比混合后加入體積百分濃度為10%的胎牛血清(Biochrom公司產品，cat# S0115)，再過3小時，更換新的培養基。在熒光顯微鏡下觀測慢病毒感染前、后的 L-02細胞，結果如圖3所示((a)為未轉染的L-02細胞，(b)為由攜帶pSicoR空載體的慢病毒轉染的L-02細胞，(c)為由攜帶pSicoR-CYP7Al的慢病毒轉染的L-02細胞 (100x))，顯微鏡觀察結果表明本發明的慢病毒可高效率地轉染L-02細胞，再將轉染后的細胞通過流式細胞術(FACS)進行分選，結果如圖4所示((a)為光學顯微鏡下由攜帶pSicoR-CYP7Al的慢病毒轉染的L-02細胞中GFP的表達情況，(b)為熒光顯微鏡下由攜帶pSicoR-CYP7Al的慢病毒轉染的L-02細胞中GFP的表達情況，(c)為a 和b的疊加(lOOx)， (d)為流式細胞術分選結果)，將感染有攜帶siDNAl、 siDNA2 或siDNA3的重組慢病毒RNAi干涉載體pSicoR-CYP7Al和慢病毒RNAi干涉載體 pSicoR空載體的L-02細胞分別命名為L-02/CYP7A1 (將感染有攜帶siDNAl的重組慢病毒RNAi干涉載體pSicoR-CYP7Al-l的L-02細胞命名為L-02/CYP7A1-1 ，將感染有攜帶siDNA2的重組慢病毒RNAi干涉載體pSicoR-CYP7Al-2的L-02細胞命名為L-02/CYP7A1-2，將感染有攜帶siDNA3的重組慢病毒RNAi干涉載體pSicoR-CYP7Al-3的L-02細胞命名為L-02/CYP7A1-3)禾卩L-02/pSicoR。
實施例2、半定量RT-PCR法檢測慢病毒感染前、后的肝細胞的生物學特性基因 mRNA水平的表達情況
用半定量RT-PCR法檢測實施例1獲得的慢病毒感染前、后的L-02肝細胞的生物學特性基因^L8、 JFP、 cWS、 cW9和CI7^W mRNA水平的表達情況，具體方法為提取正常L-02肝細胞和轉染慢病毒干涉載體pSicoR-CYP7Al的肝細胞(包括 L-02/CYP7Al-l、 L-02/CYP7A1-2和L-02/CYP7A1-3)的總RNA并以此為模板，在表 1所示的各引物對的引導下進行RT-PCR檢測(退火溫度見表l)，同時用/3-actin基因作為內參(所用正向引物序列為5'-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3'，反向引物序列為5'-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3')。檢測結果如圖5所示((a)為 pSicoR-CYP7Al轉染組，(b)為未轉染組)，慢病毒干涉載體pSicoR-CYP7Al轉染前、后的肝細胞中ALB、 ckl8和CYPlbl基因均獲得表達，而AFP和ckl9基因均不表達，表明慢病毒感染前、后的人肝細胞的生物學性狀沒有改變，本發明攜帶 pSicoR-CYP7Al的慢病毒具有較高的安全性和穩定性。
表1 半定量RT-PCR法檢測^LS、 y!F尸、cWS、 cW9和CZP7W mRNA水平表
達情況的弓I物序列及最佳退火溫度
基因引物序歹IJ大小退火溫度('c)
正義鏈反義鏈(bp)ALBTGCTTGAAGGTGCTGATGACAGGGAAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC21760
AFPTGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGACATAGCGAGCAGCCCAAAGAAGAA13860
ckl9ATGGCCGAGCAGAACCGGAACCATGAGCCGCTGGTACTCC32857
ckl8GAGGCATCCAGAACGAGAAGAGCCTCGATCTCTGTCTCCA39257
CYP1B1GAGAACGTACCGGCCACTATCACTGTTAGGCCACTTCAGTGGGTCATGAT35757
實施例3、半定量RT-PCR法和實時熒光定量RT-PCR法檢測慢病毒感染前、后肝細胞中CYP7A1基因的表達情況
分別取實施例1中經分選獲得的lxl()6個L-02/CYP7Al (L-02/CYP7Al-l、 L-02/CYP7A1-2和L-02/CYP7A1-3各lxl()6個)和L-02/pSicoR，提取細胞總RNA后，用RT-PCR法檢測CYP7A1基因在mRNA水平的表達情況(所用引物為Pl:5，-CCGATGGATGGAAATACCAC-3，， P2: 5，- TTTCATTGCTTCTGGGTTCC-3，,擴增片段長度為391bp)，同時用/3-actin基因作為內參(所用正向引物序列為 5，-GATCCACATCTGCTGGAAGG-3，，反向引物序列為
5'-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3，)，退火溫度均為57。C。反應結束后，對PCR 擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖6中的圖②和⑨所示((a) CYP7A1基因的表達情況，(b)/3-actin基因的表達情況；圖(a)和(b)中，1:未轉染組； 2:pSicoR空載體轉染組；3: pSicoR-CYP7Al轉染組)，L-02/CYP7A1與L-02/pSicoR 中的/3-actin基因均可在mRNA水平上獲得表達，而L-02/CYP7A1的CYP7A1基因在mRNA水平上比陰性對照L-02/pSicoR的表達水平低，表明CYP7A1基因在 L-02/CYP7A1中獲得低表達。為進一步驗證pSicoR-CYP7Al質粒的RNAi干涉效果，以上述獲得的不同組細胞的RNA經反轉錄得到的cDNA作為模板，進行以/5-actm為內參照的CYP7A1基因相對表達量的實時熒光定量PCR檢測，反應在Bio-Rad熒光定量PCR儀上運行，用SYBR Green染料分析，表達量最高的細胞樣品設為100%，比較Ct值計算相對含量。實時熒光定量PCR檢測結果如圖6中的圖(c)所示(縱坐標為CYP7A1基因的相對表達量；normal:未轉染組，pSicoR: pSicoR空載體轉染組， siRNAl: pSicoR-CYP7A1-1轉染組;*P〉0.05， **P<0.05)，轉染慢病毒干涉載體 pSicoR-CYP7Al-l的L-02細胞中CYP7A1基因的相對表達量受到明顯抑制，與對照組相比，轉染慢病毒干涉載體pSicoR-CYP7Al-l的肝細胞中CYP7A1基因的相對表達量僅為正常肝細胞相對表達量的38.08%，即干涉效率為61.92%，為轉染pSicoR空載體的肝細胞相對表達量的44.81。/。，干涉效率為55.19%，均具有顯著差異(P<0.05)，此外，pSicoR-CYP7Al-2轉染組干涉效率，干涉效率僅為20.16% (相對于正常肝細胞)，pSicoR-CYP7Al-3轉染組(因測序不正確，放棄了)。
上述檢測結果證明利用本發明的小干擾RNA及慢病毒載體系統可有效地抑制肝細胞中CYP7A1基因的表達水平。
實施例4、 Western blot法檢測慢病毒感染前、后肝細胞中CYP7A1蛋白的表達情
況
分別取實施例1中經分選獲得的lxl(^個L-02/CYP7Al-l和L-02/pSicoR， L-02 細胞，用放射性免疫沉淀裂解緩沖液RIPA (50mmol/LTris'HCl (pH8.0) ， 150mmol/L NaC，lmmol/LDTT， 0.5mmol/L EDTA， 1.0% NP40， 0.5%去氧膽酸鈉，0.1%SDS， 100/ig/mLPMSF, 1]Ug/mL胰蛋白酶肽，2/ig/mL亮抑制肽，100/xmol/L正釩酸鈉。) 裂解細胞，然后對裂解細胞進行不連續SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，再用半干式電轉的方法將蛋白質轉移至PVDF膜，接著用5%脫脂奶粉封閉2小時，再與相應的一抗(一抗為山羊抗人CYP7A1多克隆抗體，購自Santa Cruz公司，Cat #:SC-14426)和辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗山羊二抗(購自中杉金橋公司) 孵育后，用化學發光試劑(購自Santa Cruz公司，Cat# :SC-2048)于暗室自顯影，同樣用/3-actin蛋白作為內參(iS-actin，購自Santa Craz公司產品，Cat# :sc-1616-R;辣根過氧化酶標記的兔抗山羊二抗IgG抗體購自中杉金橋公司)。Western blot檢測結果如圖7所示(h未轉染組；2:pSicoR空載體轉染組；3: pSicoR-CYP7Al-l轉染組)，作為對照組的未轉染的L-02細胞與轉染pSicoR空載體的L-02細胞中的CYP7A1基因均在蛋白水平上獲得表達，而轉染慢病毒干涉載體pSicoR-CYP7Al-l的L-02細胞 (L-02/CYP7A1-1)中的CYP7A1基因在蛋白水平上的表達量受到明顯抑制。上述檢測結果進一步證明利用本發明的小干擾RNA及慢病毒載體系統可有效地抑制肝細胞中CYP7A1基因的表達水平。
實施例5、 L-02/CYP7Al-l、 L-02/pSicoR和L-02生長曲線的繪制與總膽汁酸分泌量測定
取實施例1中經分選獲得的L-02/CYP7A1-1和L-02/pSicoR和L-02細胞，以每孔 104個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200/d，每塊板接種兩列，每列6孔(第一列用作生長曲線，第二列用作膽汁酸測定)共8塊板。接種后，將培養板放入37'C、 5%(302孵箱中進行培養，待細胞貼壁后取一個培養板，每孔加入cck-8溶液(購自 Dojindolaboratories), 10^1，繼續在孵箱中孵育1小時，然后選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的光吸收值，共測3次，記錄結果，作為第0天數據；同時，第二列每孔每天定點收集細胞上清200m檢測總膽汁酸分泌情況。以后每隔24小時取出一個培養板，用相同方法進行比色，最后以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制生長曲線，如圖8所示(normal:未轉染組，pSicoR: pSicoR空載體轉染組，siRNAl: pSicoR-CYP7Al-l轉染組)，L-02和L-02/pSicoR兩組的細胞數量逐漸增長，由圖8 可以看出，作為對照組的轉染前的肝細胞和轉染pSicoR空載體的肝細胞數量隨著時間的推移，第0-4天呈對數期生長，4-5天進入平臺期，5-7天細胞數量急劇下降；與此對應的總膽汁酸分泌量(TBA)也是先增加，后逐漸下降，如圖9所示(normal: 未轉染組，pSicoR:pSicoR空載體轉染組，siRNAl: pSicoR-CYP7Al-l轉染組)，隨著細胞數量的增加，總膽汁酸分泌量也增加，而總膽汁酸分泌量增加到一定程度后，可能是由于膽汁酸對肝細胞的損害而致，細胞數量迅速下降，因而又引起總膽汁酸分泌量的減少。相對于前兩者，轉染pSicoR-CYP7Al-l第0-4天先增殖，4-7天緩慢下降，與之對應的總膽汁酸分泌量較未轉染組和pSicoR空載體轉染組明顯減少。上述檢測結果表明利用本發明的小干擾RNA及慢病毒載體系統可有效地抑制肝細胞中 CYP7A1的表達水平，從而可有效降低肝細胞的膽汁酸分泌量。序列表
<160> 12
<210> 1
<211> 20
<212〉 RNA <213>人工序列
<220> <223>
<400> 1
gaaugaccug ccaguauuau 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA <213>人工序列
<220> <223>
<400> 2
auaauacugg caggucauuc 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA <213>人工序列
<220><223>
<400〉 3
ggaaggcaau ccuauuug皿 20
<210〉 4
<211> 20
<212> RNA <213>人工序列
<220> <223〉
<400> 4
aacaaauagg auugccuucc 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220> <223〉
<■> 5
gaaagcagcu acugaagaau 20
<210> 6
<211〉 20
<212> RNA
<213〉人工序列
17<220〉 <223>
<400> 6
auucuucagu agcugcuuuc 20
<210〉 7
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> <223>
<400> 7
tgaatgacct gccagtatta ttcaagagat aatactggca ggtcattctt ttttc 55
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220> <223>
<400> 8
acttactgga cggtcataat aagttctcta ttatgaccgt ccagtaagaa aaaagagct 59
<210> 9
<211> 55
<212> DNA
<213〉人工序列<■〉 9
tggaaggcaa tcctatttgt ttcaagagaa caaataggat tgccttcctt ttttc 55
<210> 10
<211> 59
<212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉 <223>
<400> 10
accttccgtt aggataaaca aagttctctt gtttatccta acggaaggaa aaaagagct 59
<210> 11
<211> 55
<212> DNA <213>人工序列
<220〉 <223>
<■> 11
tgaaagcagc tactgaagaa ttcaagagat tcttcagtag ctgctttctt tttte 55
<210> 12
<211> 59
<212〉 DNA<213〉人工序列
<220〉 <223>
<400> 12
actttcgtcg atgacttctt aagttctcta agaactcatc gacgaaagaa aaaagagct 59
權利要求
1、一種抑制肝細胞中CYP7A1表達水平的方法，是將抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞，肝細胞中CYP7A1的表達水平得到抑制。
2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA，是下述雙鏈RNA序列之一1) 正義鏈為序列表中的SEQIDNo: 1，反義鏈為序列表中SEQIDNo: 2的雙鏈RNA序列；2) 正義鏈為序列表中的SEQIDNo: 3，反義鏈為序列表中SEQ ID No: 4的雙鏈RNA序列3) 正義鏈為序列表中的SEQIDNo: 5，反義鏈為序列表中SEQ ID No: 6的雙鏈RNA序列。
3、根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的3'端雙核苷酸是懸垂的。
4、根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因具有下述1) 、 2)和3)中至少一個雙鏈核苷酸序列1) 有義鏈具有序列表中SEQIDNo: 7的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No: 7限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ IDNo: S的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNo: 8限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；2) 有義鏈具有序列表中SEQIDNo: 9的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ IDNo:9限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQ IDNo: 10的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNo: 10限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；3) 有義鏈具有序列表中SEQIDNo: 11的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNo:ll限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；反義鏈具有序列表中SEQID No: 12的核苷酸序列或在高嚴謹條件下可與序列表中SEQIDNo: 12限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5、根據權利要求l-4任一項所述的方法，其特征在于通過含有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組真核表達載體或利用慢病毒載體系統將抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞。
6、根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述利用慢病毒載體系統將抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞的方法，包括以下步驟A) 將抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入慢病毒載體系統中的目的基因轉移載體中，得到攜帶有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒載體；B) 將攜帶有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒載體與慢病毒載體系統中的兩種包裝質粒和包膜質粒按4.5-5.5: 3.7-4.7: 1.5-2.5:2.3-3.3的重量份數比混合后，用脂質體介導法轉染慢病毒包裝細胞，得到攜帶有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒；C) 將攜帶有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒轉染肝細胞，肝細胞中CYP7A1的表達水平得到抑制。
7、根據為要求6所述的方法，其特征在于所述步驟A)中慢病毒載體系統中的目的基因轉移載體為慢病毒RNA汗涉載體pSicoR;步驟B)中的慢病毒載體系統中的兩種包裝質粒為pLPl和pLP2，包膜質粒為pLP/VSVG,慢病毒包裝細胞為293-FT細胞。
8、根據為要求7所述的方法，其特征在于所述步驟A)中攜帶有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒載體為pSicoR-CYP7A 1-1 。
9、根據為要求6所述的方法，其特征在于所述步驟C)中還包括對經攜帶有抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA編碼基因的重組慢病毒轉染的肝細胞進行流式分選的步驟。
10、用權利要求l-9任一項所述方法得到的低表達CYP7Al的肝細胞。
全文摘要
本發明公開了低表達CYP7A1的肝細胞及其構建方法。該抑制肝細胞中CYP7A1表達水平的方法是將抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞，肝細胞中CYP7A1的表達水平得到抑制。可利用慢病毒載體系統將抑制CYP7A1基因表達的小干擾RNA的編碼基因導入肝細胞。實驗證明，用本發明的方法可顯著下調肝細胞中CYP7A1基因在mRNA水平和蛋白水平的表達水平，并可進一步有效降低總膽汁酸的分泌量。本發明低表達CYP7A1的肝細胞及其構建方法可用于生物人工肝支持療法的基礎研究及臨床應用中，應用前景廣闊。
文檔編號C12N5/10GK101591653SQ20081009747
公開日2009年12月2日申請日期2008年5月27日優先權日2008年5月27日
發明者文岳, 偉師, 裴雪濤, 鄭吉春申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所

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