專利名稱：：高效重組表達(dá)的一種殼聚糖酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)，具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種全長(zhǎng)殼聚糖酶的N端截短形式的殼聚糖酶，以及通過(guò)基因工程手段在大腸桿菌中以可溶形式重組表達(dá)該殼聚糖酶的方法等。發(fā)明背景幾丁質(zhì)(chitin)是一類豐富的自然資源，每年產(chǎn)量超過(guò)10億噸，僅次于纖維素。幾丁質(zhì)不溶于常用溶劑，直接利用非常困難，通常需要用堿液將幾丁質(zhì)處理成脫乙酰基的產(chǎn)物——?dú)ぞ厶?chitosan，其脫乙酰度為65%99%，以70%80%最常見)，才能加以利用。殼聚糖溶于酸性溶劑并帶正電荷，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、制藥、紡織、污水處理等行業(yè)。殼聚糖可進(jìn)一步通過(guò)酶法降解成殼寡糖(一般由幾個(gè)到十幾個(gè)糖殘基組成)。由于殼寡糖具有好的水溶性，而且具有多種生物活性，例如可以抑制細(xì)菌和真菌生長(zhǎng)、具有抗腫瘤與調(diào)節(jié)免疫活性、可增強(qiáng)植物抗病性等，因此針對(duì)殼寡糖的生產(chǎn)和利用的研究近年來(lái)越來(lái)越受到重視。在酶法降解殼聚糖的生產(chǎn)工藝中r最關(guān)鍵的就是殼聚糖酶。殼聚糖酶(chitosanase,EC3.2丄123)是一類可以將殼聚糖降解的酶，其水解殼聚糖中的P-l,4-糖苷鍵。目前已經(jīng)有不少殼聚糖酶被開發(fā)出來(lái)了，如Genbank登錄號(hào)ZP—00240544.1、ZP—02591206.1、YP—084010.1、ZP—02259755.1、NP—845032.1等示描述的殼聚糖癒。但是這些酶的i基酸序列都i^較長(zhǎng)，通過(guò)基因i程表達(dá)時(shí)，表達(dá)宿主負(fù)擔(dān)較大，因而使得表達(dá)水平相對(duì)較低，也相對(duì)增加了下游分離純化出均一的酶的難度，生產(chǎn)成本也因此較高。.為此，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期艱苦實(shí)踐，令人'驚訝地發(fā)現(xiàn)了一種截短的殼聚糖酶，其在全長(zhǎng)殼聚糖酶的N端被截短大約10%后仍舊能保持相同的酶活力。這樣的殼聚糖酶不但能夠保持用殼聚糖酶酶解生產(chǎn)殼寡糖中所應(yīng)有的傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)，例如殼寡糖的得率高、對(duì)環(huán)境污染小等，更能在用基因工程手段生產(chǎn)它時(shí)減輕宿主表達(dá)負(fù)擔(dān)，獲得更高的表達(dá)水平，較小的蛋白質(zhì)也相對(duì)降低了后期酶分離純化的難度，且酶的比活力高達(dá)700U/毫克，從而降低了這種殼聚糖酶在生產(chǎn)中的使用重量，使得這種成本更低的殼聚糖酶更適宜在殼寡糖生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)產(chǎn)期摸索，發(fā)現(xiàn)用金屬螯合層析進(jìn)行的分離純化能大大簡(jiǎn)化后期分離的步驟，回收率大于90%，具有工藝簡(jiǎn)單而分離純化效果好的優(yōu)點(diǎn)，這進(jìn)一步降低了本發(fā)明的殼聚糖酶生產(chǎn)成本
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供新型的重組殼聚糖酶和其應(yīng)用，以及制備該酶的方法和其中所用的核酸、載體、宿主細(xì)胞等。本發(fā)明的重組殼聚糖酶比全長(zhǎng)殼聚糖酶短，能通過(guò)基因工程手段高效表達(dá)，并能用簡(jiǎn)化的純化工藝分離純化，因此生產(chǎn)成本低，比全長(zhǎng)殼聚糖酶更適合在實(shí)際使用中推廣。具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了一種重組殼聚糖酶，其特征在于，所述重組殼聚糖酶是(a)由SeqlDNO,2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或者(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有殼聚糖酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的重組殼聚糖酶相對(duì)于全長(zhǎng)殼聚糖酶，N端被截短，盡管由于蛋白質(zhì)表達(dá)后折疊過(guò)程一般是從N端開始的，N端的氨基酸序列對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象及相應(yīng)功能有較大影響，但是仍舊本發(fā)明的重組殼聚糖酶具有殼聚糖酶活性。本發(fā)明的重組殼聚糖酶可以在由SeqlDN0.2所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選是取代、缺失或添加一個(gè)至五個(gè)氨基酸殘基，.更優(yōu)選是取代、缺失或添加一個(gè)至三個(gè)氨基酸殘基。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，通過(guò)改變已知蛋白質(zhì)的編碼基因序列并將其導(dǎo)入表達(dá)載體，可以制備出取代、缺失或添加了氨基酸殘基的多肽，這些方法已經(jīng)廣泛記載于《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(北京科學(xué)出版社，2002年)等文獻(xiàn)中。在取代的氨基酸殘基中，優(yōu)選取代為與原氨基酸殘基側(cè)鏈性質(zhì)相似的其他氨基酸。側(cè)鏈性質(zhì)相似的氨基酸分別有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、親水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羥基側(cè)鏈的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子側(cè)鏈的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺側(cè)鏈的氨基酸(D、N、E、Q)、含堿性基團(tuán)側(cè)鏈的氨基酸(R、K、H)、含芳香族側(cè)鏈的氨基酸(H、F、Y、W)。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述重組殼聚糖酶是由SeqIDN0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"具有殼聚糖酶活性"指的是能夠?qū)ぞ厶墙到鉃椴缓瑔翁堑臍す烟堑拿富钚?。殼聚糖酶活性可以通過(guò)'i領(lǐng)域已經(jīng)存在的大量酶學(xué)實(shí)驗(yàn)方法來(lái)測(cè)量，如本發(fā)明實(shí)施例所提供的具體方法。優(yōu)選本發(fā)明的重組殼聚糖酶的殼聚糖酶活性相對(duì)于全長(zhǎng)殼聚糖酶的活性基本不減弱，優(yōu)選活性可降低不到30%，更優(yōu)選可降低不到10%，更優(yōu)選不減弱，最優(yōu)選活性有提高。在第二方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明第一方面所述的重組殼聚糖酶的核酸。在本文中，"多核苷酸"、"核酸"、"核酸分子"、"核苷酸序列"可以相互替換使用，均指一個(gè)含意。本發(fā)明的核酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，優(yōu)選DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是編碼鏈或模板鏈。通過(guò)常規(guī)技術(shù)，如PCR方法、重組技術(shù)或人工合成的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得本發(fā)明的編碼重組殼聚糖酶的核苷酸序列或其片段。這些序列一旦獲得，就可以將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入相應(yīng)的細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)的宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖，從中分離得到大量的核酸。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的核酸的核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。在第三方面，本發(fā)明提供了一種載體，其含有本發(fā)明第二方面所述的核酸。在本文中，"載體"是指本領(lǐng)域中常用的細(xì)菌質(zhì)粒、粘粒、噬菌粒、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、動(dòng)物病毒及其它各種病毒載體。本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細(xì)菌中表達(dá)用的載體(原核表達(dá)載體)、在酵母中表達(dá)用的載體(如畢赤酵母載體、漢遜酵母載體等)、在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的桿狀病毒載體、在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)用的載體(痘苗病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺伴病毒載體等)、在植物中表達(dá)用的植物病毒載體以及在哺乳動(dòng)物乳腺中表達(dá)用的各種載體。總之，只要能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制，任何質(zhì)粒和載體都可使用。優(yōu)選表達(dá)載體包含選擇標(biāo)記基因，如細(xì)菌的氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因、卡那霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷選擇標(biāo)志，如His,Leu，Trp等；真核細(xì)胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氫葉酸還原酶基因及熒光蛋白標(biāo)記基因等。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用DNA重組技術(shù)等一系列技術(shù)，構(gòu)建含本發(fā)明所述編碼重組殼聚糖酶的DNA序列、合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列、啟動(dòng)子及選擇性標(biāo)記基因等特定元件的表達(dá)載體。上述載體可用來(lái)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染合適的宿主細(xì)胞，以便獲得所需要的蛋白產(chǎn)物。本發(fā)明的載體優(yōu)選是原核表達(dá)載體，更優(yōu)選是適于大腸桿菌表達(dá)的載體。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的載體是名為pET/chitosanase的質(zhì)粒。在第四方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞含有本發(fā)明第三方面所述的載體，或者所述細(xì)胞已用本發(fā)明第二方面所述的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，也可以是真核細(xì)胞，如，細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。宿主細(xì)胞在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含本發(fā)明所述編碼重組殼聚糖酶的核酸序列后，即構(gòu)成工程化細(xì)胞或細(xì)胞株，可用于生產(chǎn)所需蛋白產(chǎn)物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠恰當(dāng)?shù)剡x擇適當(dāng)?shù)妮d體、宿主細(xì)胞，并熟知如何將載體高效地轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中，所用方法包括但不限于氯化鈣法、電穿孔法用于細(xì)菌細(xì)胞，電穿孔法和'原生質(zhì)體融合法用于酵母細(xì)胞，脂質(zhì)體包裹、磷酸鈣共沉淀、電融合法以及顯微注射法用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選是細(xì)菌細(xì)胞，更優(yōu)選是大腸桿菌細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞是大腸桿菌菌株BL21(DE3)。在第五方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明第一方面所述的重組殼聚糖酶的方法，其包括，用本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明第一方面所述的重組殼聚糖酶，并分離所述的重組殼聚糖酶。該制備方法包括發(fā)酵步驟和分離純化步驟。在發(fā)酵過(guò)程中，宿主細(xì)胞可以通過(guò)常規(guī)方法培養(yǎng)來(lái)表達(dá)所需要的蛋白產(chǎn)物，并使表達(dá)出的蛋白產(chǎn)物出現(xiàn)在在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜上或分泌到細(xì)胞周質(zhì)中或細(xì)胞外。本發(fā)明優(yōu)選通過(guò)誘導(dǎo)方式來(lái)表達(dá)重組殼聚糖酶。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式是通過(guò)IPTG誘導(dǎo)使轉(zhuǎn)化的菌株表達(dá)該重組殼聚糖酶的。對(duì)于分離純化步驟，有大量分離純化的方法可供選擇，所述方法包括但不限于裂菌(如，超聲波裂菌、滲透壓裂菌)，離心，鹽析，分子篩色譜，離子交換色譜，吸附色譜(如，親和層析、金屬鏊合層析)，反向色譜，高效液相色譜，毛細(xì)管電泳，制備性等電聚焦以及常規(guī)的變性、復(fù)性處理等，或以上方法的組合。本發(fā)明經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期摸索發(fā)現(xiàn)，在將表達(dá)菌體裂解后，通過(guò)金屬螯合層析分離純化重組殼聚糖酶，就能一步實(shí)現(xiàn)分離純化的目的，可以不再需要其他分離純化步驟，因此大大簡(jiǎn)化了分離純化步驟并降低了生產(chǎn)成本。因此，本發(fā)明優(yōu)選分離純化步驟中包括用金屬螯合層析進(jìn)行的分離純化步驟，尤其優(yōu)選用金屬螯合層析進(jìn)行分離純化后不再使用其他分離純化步驟。在第六方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面所述的重組殼聚糖酶在將殼聚糖降解制備成殼寡糖中的應(yīng)用。由于本發(fā)明的重組殼聚糖酶具有表達(dá)量高、成本低廉、生產(chǎn)周期短、純化簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，因此適宜應(yīng)用于殼寡糖的生產(chǎn)。為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說(shuō)明書的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見的。另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文己經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣。圖l:構(gòu)建本發(fā)明的殼聚糖酶表達(dá)載體流程圖。圖2:本發(fā)明示例的殼聚糖酶的編碼核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列。圖3:重組表達(dá)本發(fā)明的殼聚糖酶并進(jìn)行純化的流程圖。圖4:金屬螯合層析純化前、后殼聚糖酶樣品用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定圖譜。圖5:本發(fā)明示例的重組殼聚糖酶的酶活力測(cè)定所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)表示吸光度的差值。圖6:用硅膠薄層層析分析本發(fā)明的重組殼聚糖酶水解生產(chǎn)的殼寡糖。具體實(shí)施方式以下本文將通過(guò)具體的實(shí)施例來(lái)描述發(fā)明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國(guó)，2001年)等實(shí)驗(yàn)手冊(cè)以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列的方法來(lái)實(shí)施。實(shí)施例1殼聚糖酶表達(dá)載體的構(gòu)建從革蘭氏陽(yáng)性桿菌菌株BacillusA520(可購(gòu)自浙江豐安生物制藥有限公司)中提取基因組DNA并以該基因組DNA為模板，用寡核苷酸P1和P2為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出編碼該截短的殼聚糖酶的DNA片段。具體而言，所用引物P1的核苷酸序列為5'-GCTGCTGCAAAGGAAATGAAA-3，；所用引物P2的核苷酸序列為5'-TTAATTATCGTATCCTTCATAAATT-3'。PCR循環(huán)參數(shù)為94。C，30秒；50°C，50秒；72°C，120秒，共30個(gè)循環(huán)。最后一步于72°C保溫15分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠鑒定，與T載體(購(gòu)自Promega公司)連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH12S菌株(可購(gòu)自Invitrogen公司)。挑取數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)化的克隆抽提質(zhì)粒，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定目的基因是否正確插入。選取有目的基因插入的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測(cè)定，選取測(cè)序所得的DNA序列如圖2所示的正確的質(zhì)粒，以該質(zhì)粒為模板，以寡核苷酸P3和P4為引物，通過(guò)第二輪PCR擴(kuò)增出兩端帶有合適酶切位點(diǎn)的殼聚糖酶基因。其中，引物P3的核苷酸序列為5'-AAAAAAACATATGGCTGCTGCAAAGGAAATGAAA-3，，弓|物P4的核苷酸序列為5，-GGCCGCGAATTCACTAGTG-3，。PCR循環(huán)同上所述。擴(kuò)增出的DNA片段用限制性內(nèi)切酶Ndel和EcoRI酶切，然后連接到預(yù)先用Ndel和EcoRI酶切的pET載體(可購(gòu)自Invitrogen公司)中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH12S菌株(可購(gòu)自Irwitrogen公司)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA序列測(cè)定后，將正確的殼聚糖酶表達(dá)載體命名為pET/chitosanase。以上所述克隆工作流程如圖1所示，然后如圖3所示進(jìn)行表達(dá)、純化。實(shí)施例2重組殼聚糖酶的誘導(dǎo)表達(dá)用實(shí)施例1構(gòu)建的pET/chitosanase質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)(可購(gòu)自Invitrogen公司)，轉(zhuǎn)化克隆生長(zhǎng)在含有胺芐青霉素(100pg/ml)的固體LB培養(yǎng)基上。挑取單克隆接種于50ml液體LB培養(yǎng)基中(含有100(ig/ml的胺芐青霉素)，于37。C震蕩培養(yǎng)過(guò)夜(轉(zhuǎn)速250rpm)。將15ml上述菌液接種于500ml液體LB培養(yǎng)基中(含有100pg/ml的胺芐青霉素)，于37°C震蕩(轉(zhuǎn)速250rpm)培養(yǎng)至菌液在600nm的吸光度為0.6-1.0，然后加入IPTG至終濃度為lmmo1/1。菌液于37。C繼續(xù)震蕩(轉(zhuǎn)速l卯rpm)培養(yǎng)約18小時(shí)。高密度搖瓶培養(yǎng)時(shí)，大腸桿菌于500ml液體LB培養(yǎng)塞中(含有100pg/ml的胺芐青霉素)在37。C震蕩(轉(zhuǎn)速250rpm)培養(yǎng)至菌液在600nm的吸光度約為2，加入50ml濃縮培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)至菌液在600nm的吸光度為3-4。然后加入IPTG至終濃度為1mmo1/1，同時(shí)加入40ml的濃縮培養(yǎng)基。菌液于37°C繼續(xù)震蕩(轉(zhuǎn)速160rpm)培養(yǎng)約18小時(shí)。根據(jù)如圖4所示的SDS-PAGE鑒定結(jié)果，高密度培養(yǎng)時(shí)殼聚糖酶的表達(dá)量高于500毫克/升。其中，液體LB培養(yǎng)基的配方為稱取胰化蛋白胨10克、酵母提取物5克、NaCl10克，加入蒸餾水l升，攪拌溶解，于121。C高溫滅菌20分鐘；固體LB培養(yǎng)基的配方為每100毫升上述液體LB培養(yǎng)基中加入瓊脂粉1.4克，于121。C高溫滅菌20分鐘；濃縮培養(yǎng)基的配方為稱取胰化蛋白胨100g、酵母提取物50g、NaCl10g，加入蒸餾水1升，攪拌溶解，于121°C高溫滅菌20分鐘。實(shí)施例3重組殼聚糖酶的純化將500毫升實(shí)施例2高密度誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心(5000g,10min)，去上清，菌體用50毫升裂解緩沖液(含0.5mol/l的20mmol/l磷酸鈉溶，，pH7.5)洗滌菌體。再次離心(5000g,10min)，菌體用30毫升上述裂解緩沖液重懸。重懸菌液在冰上用超聲波破碎(功率200瓦，超聲5秒，間歇2秒，總超聲時(shí)間為20分鐘)。破碎菌液離心(8000g,10min)，取上清，其中含有重組殼聚糖酶。將上清分3次上到用裂解緩沖液預(yù)平衡的金屬螯合(Ni2+)層析柱(可購(gòu)自Pharmacia公司)上(直徑1.5厘米，柱高6厘米)，流速1毫升每分鐘。然后用含20mmo1/1咪唑的裂解緩沖液淋洗，最后用含100mmo1/1咪唑的裂解緩沖液洗脫殼聚糖酶，收集洗脫峰。根據(jù)SDS-PAGE鑒定結(jié)果(其結(jié)果如圖4所示)，金屬螯合層析回收的重組殼聚糖酶的回收率大于90%。實(shí)施例4重組殼聚糖酶的酶活力測(cè)定酶活力測(cè)定的底物為0.5克每升的殼聚糖溶液(殼聚糖購(gòu)自，藥集團(tuán)，脫乙酰度大于等于90%)，溶解在0.1mo1/1的NaAc-HAc(pH4.5)緩沖液中。取0.6毫升上述底物溶液于50。C預(yù)熱10分鐘，然后加入定量的殼聚糖酶(加入體積5-10微升，酶溶液可做適當(dāng)稀釋后加入)，酶解反應(yīng)于50。C保溫15分鐘。隨后向酶反應(yīng)體系中加入0.5g/1的鐵氰化鉀溶液0.8毫升(溶于0.5mo1/1Na2C03溶液中)并立即于沸水中保溫5分鐘。將上述煮沸后的溶液離心(12000g，5min)除去殼聚糖絮狀沉淀，然后用分光光度計(jì)測(cè)定上清液在420nm的光吸收。通過(guò)與氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，可計(jì)算出酶解反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖的量。一個(gè)酶活力單位(U)定義為在上述活力測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生1pmole還原糖所需的酶的量。重組表達(dá)的殼聚糖酶的比活力為700U/mg。其中根據(jù)如下方法進(jìn)行氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制稱取133毫克D-氨基葡萄糖鹽酸鹽(分子量216)用200毫升0.1mo1/1的NaAc-HAc(pH4.5)緩沖液溶解，該溶液中D-氨基葡萄糖鹽酸鹽的濃度為0.66g/1，折算為殼聚糖殘基(每個(gè)殼聚糖殘基的分子量為162)的濃度為0.5g/1。分別取上述D-氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液0，20，'30，40，50，60微升于相應(yīng)的eppendorf管中(每管對(duì)應(yīng)殼聚糖殘基的量分別為0，10，15，20，15，30微克)，然后向每管加入0.1mo1/1的NaAc-HAc(pH4.5)緩沖液，使每管的總體積均為600微升。向上述每管中均加入800微升0.5g/l的鐵氰化鉀溶液，混勻并于沸水中保溫5分鐘。上述每一個(gè)點(diǎn)均做兩個(gè)平行管。然后用分光光度計(jì)測(cè)定每管液體在420nm的光吸收。上述每管測(cè)出的光吸收值均減去未加入D-氨基葡萄糖管的光吸收值，算出每管的光吸收差值。以每管中加入糖殘基的量(微克數(shù))為橫坐標(biāo)，以每管的光吸收差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖5所示)。實(shí)施例5重組殼聚糖酶水解殼聚糖生產(chǎn)殼寡糖稱取10克殼聚糖粉末，加入95毫升水，攪拌使殼聚糖粉末懸于水中。加入70酶活力單位的上述實(shí)施例所得的重組殼聚糖酶，混勻。向上述殼聚糖懸液中加入冰醋酸5毫升，迅速攪拌，形成粘稠固體。將該粘稠固體于50。C保溫，于不同時(shí)間取樣1毫升立即凍存于-20。C待進(jìn)一步分析。隨酶解的進(jìn)行，上述粘稠固體逐漸轉(zhuǎn)化為液體，粘度不斷下降。然后通過(guò)硅膠薄層層析分析殼聚糖水解產(chǎn)物將不同時(shí)間取樣的殼聚糖水解產(chǎn)物分別點(diǎn)到硅膠薄板上，每個(gè)點(diǎn)0.5-1微升。將硅膠板在層析缸中用展開劑(100毫升正丙醇+50毫升30%(w/v)氨水)展開，層析時(shí)間2-3小時(shí)。層析后將薄板在熱板(90°C)上徹底烘干。然后用小噴霧器將0.1%茚三酮溶液(溶于正丙醇飽和水中)均勻噴灑在薄板上，至薄^微濕。然后將薄板在熱板(90°C)上烘烤至紅色斑點(diǎn)顯現(xiàn)，其結(jié)果如圖6所示。另外根據(jù)如下方法進(jìn)行殼寡糖平均鏈長(zhǎng)的測(cè)定將不同時(shí)間取樣的殼聚糖水解產(chǎn)物分別取少量(5-10微升，對(duì)原液可以進(jìn)行適當(dāng)稀釋)加入到600微升0.1mo1/1的NaAc-HAc(pH4.5)緩沖液中。然后向上述每管中均加入800微升0.5g/1的鐵氰化鉀溶液，混勻并于沸水中保溫5分鐘。離心(10000g,3min)除去殼聚糖沉淀，上清用分光光度計(jì)測(cè)定420nm的光吸收。根據(jù)每管的光吸收值，通過(guò)D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每管中還原糖殘基的量。用每管中總糖殘基的量(微克)除以每管中還原糖殘基的量(微克)即等于該管中殼寡糖的平均鏈長(zhǎng)，其結(jié)果如表l所列。表l:殼聚糖酶酶解時(shí)間與所得殼寡糖平均鏈長(zhǎng)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>序列表<110>(浙江豐安生物制藥有限公司)<120>高效重組表達(dá)的一種殼聚糖酶<160〉2〈170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211>1248〈212〉DNA〈213〉未知<400〉1atgcatcacctatggctgctgcaaaggaaatgaaaccatttccccagcaa60gttaattatgcaggtgttataaaaccgaatcatgttacacaggaaagtttaaatgcttct120gtaagcagttactacga_ta_3ttggaa犯agaaatatttgaaa^tg3tttatcctcttta180cctggtggttattacgt3幼aggag卿ttacgggtgatgcggatgggtttaagccactt240ggaacttcaga鄉(xiāng)tca鄉(xiāng)gtatgggatggtaattax:3gtattaatggctggttatgat300tcgaa/tgctcaaaaaatctatgscggtttattta^aacagcaagaacttttaaaagctct360caaaatcctaatttaatgggatgggttgtcgcagatagtaaggtcatttt420gattctgctactgatggggatttagatattgcgtattctcttcttcttgctC3ta^gcsg480tggggstc犯3tgg鄉(xiāng)agttaattatttgaagacatgattac3犯aggt540gtaatgttacaaataatagccgactaaatttagg卿ttggga^tctaa^600agttcacttgatscga^ccatctgattggatgatgtcacaccttagagcattttatgaa660tttacaggtgataaaacttggctcactgttattaataatttgtacgatgtttatacgcaa720tttagtaataagtactctccaaatacaggacttatttcagattttgttgt780ccacaacccgcacctaaagacttcttagatgagtcagaatatacaaatgcatattattac840aatgctagtcgggtaccattgagaattgtaatggactatgcgatgtacggtgagaagcga9003gt肌agtcatttctgataaagtatcttcatggattcaaaataaaacgaatggaaatcct960tctaaaattgtggatggttatcaattaaacggatccaatattggtagttatccaactgct1020gtattcgtttcgccatttattgctgcaagtataacgagtagcaataatcaaaagtgggta1080aatagcggttgggattggatgaagaataagagagaaagctattttagtgatagttataat1140ttattaactatgttatttattacaggaaattggtggaaacctgtacctgataa/taaaaag1200acacaaaatcaaataaatgatgcaatttatgaaggatacgataattaa1248〈210〉2〈211>415<212>PRT〈213〉未知〈400〉2MetHisHisHisHisHisHisMetAlaAlaAlaLysGluMetLys151015ProPheProGinGinValAsnTyrAlaGlyVallieLysProAsn202530HisValThrGinGluSerLeuAsnAlaSerValSerSerTyrTyr354045AspAsnTrpLysLysLysTyrLeuLysAsnAspLeuSerSerLeu505560ProGlyGlyTyrTyrValLysGlyGlulieThr'GlyAspAlaAsp657075GlyPheLysProLeuGlyThrSerGluGlyGinGlyTyrGlyMet808590VallieThrValLeuMetAlaGlyTyrAspSerAsnAlaGinLys95100105lieTyrAspGlyLeuPheLysThrAlaArgThrPheLysSerSer110115120GinAsnProAsnLeuMetGlyTrpValValAlaAspSerLysLys125130135AlaGinGly140AlaTyrSerAlaValAsnlieLysAlaAspTrpAspMetMetSerThrTrpLeu230PheSerAsnValValLysGluSerGluProLeuArgSerLysVal305ThrAsnGlyGlySerAsnPhelieAlaHisPheAspSer145AlaThrAspGlyAspLeu150LeuLeu155TyrLeu170SerAsn185SerLys200HisLeu215ThrVal235LysTyr245AsnPro260TyrThr275lieVal290lieSer310AsnPro320lieGly335AlaSer350LeuAlaLysGluValThrSerSerArgAlalieAsnSerProProGinAsnAlaMetAspAspLysSerLysSerTyrlieThrHisLys160AlaGin175AsnAsn190LeuAsp205PheTyr220AsnLeu240AsnThr250ProAla265TyrTyr280TyrAla295ValSer315GinTrpAspMetSerArgThrArgGluPheTyrAspGlyLeuProLysTyrAsnMetTyrSerTrplieValAspGly325ProThrAlaVal340SerSerAsnAsn355GlySer165lieThr180LeuAsn195ProSer210ThrGly225ValTyrlieSer255AspPhe270AlaSer285GlyGlu300lieGinTyrGin330PheVal345GinLys360AsplieAsnGlyLysGlyLeuGlyAspTrpAspLysThrGinAspPheLeuAspArgValLysArgAsnLysLeuAsnSerProTrpValAsnSerGlyTrpAspTrpMet365SerAspSerTyrAsnLeuLeu380385TrpTrpLysProValProAsp395AsnAspAlalieTyrGluGly410序列表LysAsnLysArgGluSerTyrPhe370375ThrMetLeuPhelieThrGlyAsn390AsnLysLysT'hrGinAsnGinlie400405TyrAspAsn41權(quán)利要求1.一種重組殼聚糖酶，其特征在于，所述重組殼聚糖酶是(a)由SeqIDNO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或者(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有殼聚糖酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1所述的重組殼聚糖酶，其是由S叫IDN0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。3.編碼權(quán)利要求1或2所述的重組殼聚糖酶的核酸。一4.權(quán)利要求3所述的核酸，其序列如SeqIDNO.l所示。5.—種載體，其含有權(quán)利要求3或4所述的核酸。6.—種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞含有權(quán)利要求5所述的載體，或者所述細(xì)胞已用權(quán)利要求3或4所述的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。7.權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其是大腸桿菌。8.制備權(quán)利要求1或2所述的重組殼聚糖酶的方法，其包括，用權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞表達(dá)權(quán)利要求1或2所述的重組殼聚糖酶，并分離所述的重組殼聚糖酶。9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述分離包括用金屬螯合層析進(jìn)行的分離純化步驟。10.權(quán)利要求1或2所述的重組殼聚糖酶在將殼聚糖降解制備成殼寡糖中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及新型的重組殼聚糖酶和其應(yīng)用，以及制備該酶的方法和其中所用的核酸、載體、宿主細(xì)胞等。本發(fā)明的重組殼聚糖酶比全長(zhǎng)殼聚糖酶短，能通過(guò)基因工程手段高效表達(dá)，表達(dá)量高于500毫克/升，并能用簡(jiǎn)化的純化工藝分離純化，其酶的比活力能達(dá)到700U/毫克，因此生產(chǎn)成本低，更適合在實(shí)際使用中推廣。文檔編號(hào)C12N15/63GK101397552SQ200810094340公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2008年4月28日優(yōu)先權(quán)日2008年4月28日發(fā)明者劉亞麗,吳海水,瑞徐,戚正武,舒蔣,郭占云申請(qǐng)人:浙江豐安生物制藥有限公司