專利名稱：穩(wěn)定表達(dá)t7 rna聚合酶的st細(xì)胞系及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ST細(xì)胞系，尤其涉及一株能夠穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的ST 細(xì)胞系，本發(fā)明還涉及該細(xì)胞系的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
十余年前，在分子病毒學(xué)研究領(lǐng)域興起了一種反向遺傳操作技術(shù)，即病毒 的感染性全長cDNA克隆技術(shù)，解決了RNA病毒基因組難以體外操作這一難題。 RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)，是采用病毒的基因組，在培養(yǎng)細(xì)胞或易感宿主中重 新拯救出活病毒或其衍生病毒。能夠拯救病毒的基因組克隆稱為感染性克隆， 一般是在細(xì)菌質(zhì)粒中插入整個(gè)病毒基因組cDNA拷貝，使得cDNA本身或從cDNA 體外轉(zhuǎn)錄所得的RNA具有感染性。反向遺傳操作主要有3種方案。 一是基于體外 轉(zhuǎn)錄的感染性RNA， 二是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的感染性RNA，三是基于DNA的感染性 cDNA克隆。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄主要采用表達(dá)RNA聚合酶(如T7 RNA聚合酶)的重組 病毒(Baron MD, Barrett T. Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J Virol, 1997， 71(2): 1265-1271; Evans S, Cavanagh D， Britton P, Utilizing fowlpox virus recombinants to generate defective RNAs of the coronavirus infectious bronchitis virus. J Gen Virol, 2000, 81(12):2855-2865.)和穩(wěn)定細(xì)胞系(Radecke F， Spielhofer P, Schneider H， et al. Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO J. 1995, 14(23):5773-5784; Xiu MH, Wang Q， Tang LH, et al. Rescue of minireplicon by using the cell line stably expressing the T7 RNA polymerase. Bing Du Xue Bao(病毒 學(xué)報(bào)),2007, 23(4):326畫330; Freiberg A， Dolores LK, Enterlein S, et al.Establishment and characterization of plasmid-driven minigenome rescue systems for Mpah virus: RNA polymerase I- and T7-catalyzed generation of flinctional paramyxoviral RNA. Virology, 2008, 370(l):33-44.)。
T7 RNA聚合酶是T7噬菌體編碼的一種依賴于DNA的RNA聚合酶，對(duì)T7啟 動(dòng)子序列具有高度特異性，是分子克隆和反向遺傳操作常用的一種RNA聚合酶。 T7 RNA聚合酶基因能夠穩(wěn)定地整合到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組中，并且能夠在多 種IE細(xì)胞內(nèi)高7jC平表達(dá)(Elroy-Stein O， Moss B. Cytoplasmic expression system based on constitutive synthesis of bacteriophage T7 RNA polymerase in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87: 6743-6767.)。由于T7 RNA聚合酶在真核 細(xì)胞中具有一定程度的轉(zhuǎn)錄活性， 一直廣泛應(yīng)用于病毒拯救中(KwonB,Ansari IH， Osorio FA， et al. Infectious clone derived viruses from virulent and vaccine strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus mimic biological properties of their parental viruses in a pregnant sow model. Vaccine, 2006, 24(49-50):7071-80.)。
盡管豬瘟病毒的反向遺傳操作平臺(tái)已經(jīng)建立，但由于豬瘟病毒的允許細(xì)胞 范圍有限，影響了病毒的有效拯救。因?yàn)槔梅聪蜻z傳操作技術(shù)，從CSFV全長 cDNA體外轉(zhuǎn)錄獲得基因組RNA，其感染性通常很低，vanGennip等(1999)建 立了一個(gè)能穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的SK6細(xì)胞系(SK6/T7)，用線性化的全長 cDNA克隆直接轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，病毒滴度可以提高200倍(van Ge皿ip HG, vanRijn PA, Widjojoatmodjo MN, a/. Recovery of infectious classical swine fever virus (CSFV) from fbll國length genomic cDNA clones by a swine kidney cell line expressing bacteriophage T7 'RNA polymerase. J Virol Methods, 1999, 78(l-2):117-28.)，為豬瘟病毒的反向遺傳操作提供了便利手段。但該細(xì)胞系為專利細(xì)胞，不易獲得。ST細(xì)胞(來源于豬睪丸組織)是豬瘟病毒等豬源病毒的敏 感細(xì)胞系，常用于豬瘟病毒的分離培養(yǎng)和體外增殖。
長期以來，人們利用重組DNA技術(shù)在DNA分子水平上對(duì)病毒基因組進(jìn)行 修飾，從而對(duì)基因組的結(jié)構(gòu)與功能有了進(jìn)一步的了解，而對(duì)于非逆轉(zhuǎn)錄RNA病 毒來說，其復(fù)制周期不經(jīng)歷DNA階段，重組DNA技術(shù)不能直接運(yùn)用于病毒基 因組的修飾與分析，而且許多分子生物學(xué)技術(shù)和工具都是針對(duì)DNA設(shè)計(jì)的，針 對(duì)RNA的很少，RNA病毒反向遺傳方法的建立和應(yīng)用則解決了這一難題。
經(jīng)典的反向遺傳操作系統(tǒng)是以RNA轉(zhuǎn)錄本為基礎(chǔ)，通過RNA聚合酶(T7或 SP6 RNA聚合酶)體外轉(zhuǎn)錄獲得有感染性的病毒基因組RNA，繼而拯救出病毒 粒子。早先的研究已證實(shí)T7RNA聚合酶可以轉(zhuǎn)錄插人T7啟動(dòng)子下游的外源病毒 基因組，并實(shí)現(xiàn)病毒的高效拯救(Schnell MJ, Mebatsion T， Conzelmann KK. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J, 1994， 13:4195-4203.Acaniello VR， Baltimore D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science, 1981,214(4523):916-919.)。該系統(tǒng)主要包 括痘苗病毒/T7 RNA聚合酶(W/T7)系統(tǒng)及基于T7 RNA聚合酶的替代系統(tǒng)。 Vassilev等(1996)首先利用痘苗病毒/T7 RNA聚合酶系統(tǒng)從牛病毒性腹瀉病毒 的全長cDNA獲得了感染性病毒粒子(Vassilev VB， Collet, MS, Donis R. In vivo rescue of infectious bovine viral diarrhoea virus by transfection of plasmid DNA into cells infected with vaccinia virus expressing T7 RNA polymerase. Edwards S, Paton DJ, Wensvoort G. Proceedings of the Third ESVV Symposium on Pestivirus Infections. Weybridge: Central Veterinary Laboratory, 1996:1-7.)， 隨后，又用該 系統(tǒng)成功拯救出了狂犬病病毒、水泡性口炎病毒、仙臺(tái)病毒(GarcinD,PeletT， Calain P, et al. A highly recombinogenic system for the recovery of infectious Sendaiparamyxovirus from cDNA: generation of a novel copy-back non-defective interfering virus. EMBOJ， 1995, 14:6087-6094.)。但該系統(tǒng)致命的缺點(diǎn)是干擾被 拯救病毒的產(chǎn)生，因?yàn)槎幻绮《驹诟腥舅拗骷?xì)胞時(shí)產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)，最終 會(huì)殺死細(xì)胞，而外源基因表達(dá)并非一個(gè)連續(xù)過程，很可能外源病毒未被拯救， 負(fù)載的細(xì)胞已經(jīng)死亡。因此，尋求一種基于T7 RNA聚合酶、但更為安全的替代 系統(tǒng)是必要的，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的敏感細(xì)胞系就是一種較佳選擇。
目前，豬瘟病毒的反向遺傳學(xué)研究已取得了很大突破。Moormann等(1996) 率先采用一步法從豬瘟病毒兔化弱毒疫苗株(C株)的全長cDNA轉(zhuǎn)錄出感染性 RNA，但其感染性較低(Moormann RJM, van Gennip HGP, Miedema GKW, et al. Infectious RNA from an engineered fbll-length cDNA template of the genome of a pestivirus. J Virol, 1996,70:763-770.) 。 van Gennip等(1999)建立了一個(gè)能穩(wěn)定 表達(dá)T7 RNA聚合酶的SK-6細(xì)胞系，其拯救病毒的感染性提高了200倍，給豬瘟 病毒反向遺傳研究提供了新途徑。隨著拯救技術(shù)的發(fā)展成熟，反向遺傳操作系 統(tǒng)在豬瘟病毒功能基因組的研究上將起到無可替代的作用。
鑒于ST細(xì)胞系是豬瘟病毒等多種豬源病毒的敏感細(xì)胞，非常適合于豬瘟病 毒C株的體外培養(yǎng)和增殖，構(gòu)建一株能夠穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系對(duì) 于開展豬瘟病毒等RNA病毒的反向遺傳操作的研究具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一株穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系。 本發(fā)明的目的之二是提供一種構(gòu)建上述穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系 的方法。
本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一株穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞系，其微生物保藏號(hào)是CGMCCNo.
2444;分類命名豬睪丸細(xì)胞系(ST細(xì)胞系)；保藏單位中國微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院 微生物研究所；保藏時(shí)間2008年4月8日。
本發(fā)明主要采用下述方法構(gòu)建得到所述的穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì) 胞系:采用PCR方法，以穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的BHK/T7細(xì)胞基因組為模 板擴(kuò)增T7 RNA聚合酶基因，將其定向插入到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP的 Wol和^W7ffl位點(diǎn)之間，從而得到帶有新霉素抗性基因、綠色熒光蛋白(EGFP) 和T7 RNA聚合酶基因的三順反子表達(dá)載體pIRES2-EGFP-T7;用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 ST細(xì)胞，通過G418篩選和單細(xì)胞克隆化，同時(shí)用RT-PCR及T7啟動(dòng)子控制下 的紅色熒光蛋白的表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，檢測T7 RNA聚合酶的表達(dá)，篩選得到 穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系ST/T7。
對(duì)所構(gòu)建得到的細(xì)胞系ST/T7進(jìn)行RT-PCR檢觀U，可以擴(kuò)增到T7RNA聚合 酶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；用含有T7啟動(dòng)子控制下的紅色熒光蛋白(RFP)基因的表達(dá) 質(zhì)粒pET-PT7-RED轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，可以觀察到RFP的表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā) 明所構(gòu)建的細(xì)胞系ST/T7能反式提供T7 RNA聚合酶，可以用于豬瘟病毒等一些 正鏈RNA病毒的反向遺傳操作，同時(shí)，本發(fā)明所構(gòu)建的細(xì)胞系ST/T7還可以作為 體外轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng)，用于研究基因的結(jié)構(gòu)與功能。
圖l用重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-T7瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后EGFP的表達(dá)情況；A: 轉(zhuǎn)染后24h; B:轉(zhuǎn)染后48h。
圖2 pIRES2-EGFP-T7瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的ST細(xì)胞的RT-PCR檢測；1:DL 15000分子量標(biāo)準(zhǔn)；2:壓0對(duì)照；3:轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-T7的ST細(xì)胞。
圖3 T7 RNA聚合酶基因和RFP基因在pIRES2-EGFP-T7和pET-PT7-RED共 轉(zhuǎn)染的ST細(xì)胞中的共表達(dá)(轉(zhuǎn)染后24h); A: pIRES2-EGFP-T7/pET-PT7-RED共 轉(zhuǎn)染的ST細(xì)胞；B: pET-PT7-RED轉(zhuǎn)染的ST細(xì)胞。
圖4第1代ST/T7細(xì)胞的RT-PCR鑒定；1-2: ST/T7細(xì)胞；3: EbO對(duì)照；4:DL 15000分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖5第5代ST/T7細(xì)胞的RT-PCR檢測；1: DL 15000分子量標(biāo)準(zhǔn)；2: HbO對(duì)
照；3: ST細(xì)胞系；4: ST/T7細(xì)胞；5: BHK/T7細(xì)胞；6: DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖6第15代ST/T7細(xì)胞中T7 RNA聚合酶表達(dá)的檢測(轉(zhuǎn)染后24h); A: ST/T7
細(xì)胞；B: BHK/T7細(xì)胞對(duì)照；C: ST細(xì)胞對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著 描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何 限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì) 本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā) 明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的ST/T7細(xì)胞系的構(gòu)建及檢測 1材料與方法
1.1菌株、質(zhì)粒與細(xì)胞
大腸桿菌JM109、 ST細(xì)胞系、BHK/T7細(xì)胞系(Ito N, Takayama-Ito M,
Yamada K, et al. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using avaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol Immunol, 2003， 47(8):613-617)由本實(shí)驗(yàn)室保存；均用含10%犢牛血清(PAA公司)的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；pIRES2-EGFP真核表達(dá)載體(可購自Clontech公司)由本實(shí) 驗(yàn)室保存，pDSRED-Nl (可購自Clontech公司)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)肖少波博士惠 贈(zèng)。
1.2 T7 RNA聚合酶基因的PCR擴(kuò)增
以BHK/T7細(xì)胞基因組DNA為模板，以PT7PolS(5'-GAG CTC GAG CCA
CCA TGA ACA CGA TTA ACA TCG-3') 、 PT7PolR (5'-GAT ^GA TCC| TTA CGCGAACGCGAAGTCC-3')為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得T7 RNA 聚合酶基因，反應(yīng)體系為DNA模板(0.2ng/pL) lpL、上下游引物各2pL (10pmol/L)、 LA &《DNA聚合酶0.5jiL、 10xPCR Buffer 3pL， dNTP (各 2.5mmol/L) 2|iL，用ddH20補(bǔ)足30^iL。擴(kuò)增程序?yàn)?5。C預(yù)變性5min; 94°C 變性lmin， 60。C退火lmin， 72。C延伸3min， 30個(gè)循環(huán);最后72。C延伸10min。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 1.3重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-T7的構(gòu)建
用膠回收試劑盒回收2.65kb的PCR產(chǎn)物，將其插入到pMD18-T載體中， 得到重組質(zhì)粒pMD18-T7，測序正確后，用^YM[和BamHI從其中切下含T7 RNA 聚合酶基因的DNA片段，將其插入到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP的^oI和 5amHI位點(diǎn)之間，從而得到帶有新霉素抗性基因、綠色熒光蛋白(EGFP)和 T7 RNA聚合酶基因的三順反子表達(dá)載體，命名為pIRES2-EGFP-T7。 1.4轉(zhuǎn)染級(jí)高純度質(zhì)粒的制備
應(yīng)用堿裂解法和聚乙二醇沉淀法提取重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-T7，測定其濃 度與純度。當(dāng)濃度達(dá)到1嗎 L以上、OD26o/OD28o達(dá)到1.8 2.0時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。1.5 T7啟動(dòng)子控制下的紅色熒光蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建
將質(zhì)粒pDSRED-Nl分別用^oI和A^I酶切后，得到紅色熒光蛋白(RFP) 基因片段(0.7kb)，回收目的片段，將其插入到pET-32a (Novagen公司)中的 T7啟動(dòng)子下游，得到含有T7啟動(dòng)子控制下的RFP報(bào)告基因的重組質(zhì)粒 pET-PT7-RED。 1.6轉(zhuǎn)染
用含10%犢牛血清的DMEM將ST細(xì)胞培養(yǎng)于50mL培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞生 長至80%單層左右，用彎頭滴管吹下細(xì)胞，按1:2的比例鋪于一 6孔板中，在 37°C、 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。將純化的重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-T7或 pIRES2-EGFP-T7/pET-PT7-RED用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent (Invitrogen公司)按其操作說明書轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置正常ST細(xì)胞培養(yǎng)孔 對(duì)照，置于37X:、 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)染后24h，將培養(yǎng)板置于熒光顯 微鏡下觀察，同時(shí)釆集熒光圖像。轉(zhuǎn)染60后提取細(xì)胞基因組，用RT-PCR檢測 表達(dá)情況。
1.7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的篩選
采用G418壓力選擇和有限稀釋法進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆篩選。將轉(zhuǎn)染后 的細(xì)胞板在37'C 5n/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，0.25%胰酶消化細(xì)胞孔，進(jìn)行細(xì)胞 計(jì)數(shù)，按每轉(zhuǎn)染孔稀釋5 20孔，置于37。C 5。/。C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，之后取出 細(xì)胞板加入終濃度400pg/mL的G418的10%犢牛血清的完全培養(yǎng)液0.5mL，繼 續(xù)培養(yǎng)2w。隨時(shí)進(jìn)行觀察，每隔3~4d細(xì)胞換液，至加壓篩選的細(xì)胞孔有存活 的細(xì)胞出現(xiàn)，取出一部分細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測。對(duì)檢測出有表達(dá)的細(xì)胞孔，運(yùn) 用有限稀釋法進(jìn)行3次單細(xì)胞克隆。 1.9細(xì)胞總RNA的提取及RT-PCR檢測用TRIzol試劑(Invitrogen公司)參照使用說明書提取穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合 酶的ST細(xì)胞或正常ST細(xì)胞的總RNA，分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系為 總RNA 20pL、隨機(jī)引物lnL(50pmol/VL) 、 5x反轉(zhuǎn)錄Buffer 3pL、 dNTP( 10mmol/L) lpL、反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV RT10U和RNA酶抑制劑(HPRI)20U、用ddH2O補(bǔ)足30ML， 42'C水浴lh，最后70。C 10min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，置-20。C備用。隨后用 PT7PolS/PT7PolS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10pL、引物各2^L (10pmol/L)、 Ex化《DNA聚合酵0.5mL、 IOxPCR Buffer 5^、 dNTP (各 2.5mmol/L) 4pL，用ddH2O補(bǔ)足至50pL，擴(kuò)增條件同上。 1.10穩(wěn)定細(xì)胞系外源基因表達(dá)的檢測
將純化的重組質(zhì)粒pET-PT7-RED用Lipofectamine， 2000試劑轉(zhuǎn)染篩選出的 陽性單克隆細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常ST細(xì)胞和BHK21/T7細(xì)胞對(duì)照，置于37'C 5% C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)染后24h，置于熒光顯微鏡下觀察。轉(zhuǎn)染60后，提取細(xì)胞總 RNA，用RT-PCR檢測目的基因的表達(dá)情況。 1.11穩(wěn)定細(xì)胞系穩(wěn)定性的檢測
將克隆化細(xì)胞系連續(xù)培養(yǎng)15代，約3 4d傳代l次，取其中第5、 10及15代用 重組質(zhì)粒pET-PT7-RED進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并按上述方法進(jìn)行RT-PCR檢測。
2試驗(yàn)結(jié)果
2.1 T7 RNA聚合酶在ST細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)
用重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-T7轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞后24h，在熒光顯微鏡下可以觀 察到綠色熒光，轉(zhuǎn)染后48h， EGFP表達(dá)水平明顯增加(圖l)，用針對(duì)T7RNA 聚合酶的引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，可以檢測到T7RNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄(圖2); 用pIRES2-EGFP-T7和pET-PT7-RED共轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞24h后，即可觀察到紅色熒光(圖3)。這表明，pIRES2-EGFP-T7中的T7 RNA聚合酶基因和RFP基因均 能得到瞬時(shí)表達(dá)。
2.2 T7 RNA聚合酶在ST細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)
重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-T7轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞24h后，加入終濃度400ng/mL的 G418的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2周后可見大部分細(xì)胞死亡，將存活且產(chǎn)生綠色 熒光的細(xì)胞孔取出一部分，提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，在這 些存活的細(xì)胞孔中可以檢測到T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄(圖4)。對(duì)檢測出有T7 RNA聚合酶表達(dá)的細(xì)胞孔，通過有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆化，從而建立了一 株穩(wěn)定細(xì)胞系，命名為ST/T7。對(duì)ST/T7細(xì)胞經(jīng)過3輪單細(xì)胞克隆后，提取第5 代ST/T7細(xì)胞和正常ST細(xì)胞的總RNA，以PT7PolS/PT7PolR為弓|物進(jìn)行RT-PCR 檢測，結(jié)果表明，從ST/T7細(xì)胞總RNA中可擴(kuò)增到1條2.65kb左右的特異條帶， 而正常ST細(xì)胞則無此條帶，表明T7RNA聚合酶基因在穩(wěn)定細(xì)胞系中得到了轉(zhuǎn) 錄(圖5)。
2.3 T7RNA聚合酶穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性與活性檢測
用表達(dá)載體pET-PT7-RED瞬時(shí)轉(zhuǎn)染第15代ST/T7細(xì)胞，結(jié)果顯示，幾乎100% 細(xì)胞產(chǎn)生特異性紅色熒光，穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的BHK/T7細(xì)胞對(duì)照也產(chǎn)生 特異性紅色熒光，而ST細(xì)胞對(duì)照則不產(chǎn)生特異性紅色熒光(圖6)，這表明，本 發(fā)明所構(gòu)建的ST/T7細(xì)胞系能穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶，從而介導(dǎo)T7啟動(dòng)子控制 下的RFP基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
通過上述試驗(yàn)結(jié)果可以看出，通過RT-PCR檢測，可以從ST/T7細(xì)胞系擴(kuò)增 到T7 RNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；用含有T7啟動(dòng)子控制下的RFP基因的表達(dá)質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，可以觀察到紅色熒光蛋白的表達(dá)。這表明，本發(fā)明ST/T7細(xì)胞 系能反式提供T7RNA聚合酶，可以用于豬瘟病毒等一些正鏈RNA病毒的反向遺傳操作。此外，本發(fā)明細(xì)胞系還可以作為體外轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng)，用于研究基因的 結(jié)構(gòu)與功能。
權(quán)利要求
1、一株穩(wěn)定表達(dá)T7RNA聚合酶的細(xì)胞系ST/T7，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.2444。
2、 一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述細(xì)胞系ST/T7的方法，包括將T7RNA聚 合酶基因定向插入到真核表達(dá)載體pERES2-EGFP的^oI和Bawffl位點(diǎn)之間， 得到帶有新霉素抗性基因、綠色熒光蛋白和T7 RNA聚合酶基因的三順反子表 達(dá)載體pIRES2-EGFP-T7;用pIRES2-EGFP-T7轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，通過G418壓力篩 選得到穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系ST/T7。
3、 權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系ST/T7在正鏈RNA病毒反向遺傳操作中的用途。
4、 按照權(quán)利要求3的用途，其特征在于所述的正鏈RNA病毒包括豬瘟病毒等。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系ST/T7，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.2444。本發(fā)明將T7 RNA聚合酶基因插入到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，得到pIRES2-EGFP-T7，轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系ST/T7。通過RT-PCR檢測，可以從ST/T7細(xì)胞系中擴(kuò)增到T7 RNA聚合酶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用含有T7啟動(dòng)子控制下的紅色熒光蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，可觀察到紅色熒光蛋白的表達(dá)。本發(fā)明ST/T7細(xì)胞系能反式提供T7 RNA聚合酶，可用于豬瘟病毒等一些正鏈RNA病毒的反向遺傳操作，還可作為體外轉(zhuǎn)錄表達(dá)系統(tǒng)，用于研究基因的結(jié)構(gòu)與功能。
文檔編號(hào)C12N15/52GK101285054SQ20081009321
公開日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者仇華吉, 元 孫, 娜 李, 祁巧芬 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所