核酸回收方法及核酸回收裝置的制作方法

專利名稱：：核酸回收方法及核酸回收裝置的制作方法
技術領域：
：本發明涉及從結合有核酸的固相上洗提核酸，并將核酸回收到溶液中的核酸回收方法及核酸回收裝置。
背景技術：
：核酸是攜帶遺傳信息的物質，在學術研究或醫療等多個領域中實施核酸的分析。作為核酸的分析方法，經常利用PCR(PolymeraseChainReaction)等為主的核酸擴增技術。在進行以PCR等為代表的核酸分析時，為了達到不含對分析反應有干擾物質的狀態，需要從生物試樣等中提取精制核酸。作為從生物試樣等中提取核酸的方法，有使用苯酚或氯仿等劇毒物，進行乙醇沉淀等操作的以往方法，但近年，通常采用的方法是，在離液物質的存在下利用核酸結合在含二氧化硅的固相等上的性質的方法。例如，非專利文獻l(J.Clin.Microbiol.,28(3),495-503(1990))中記載的方法，由以下工序構成(l)向含有核酸的生物試樣中混合含有離液物質的溶解液和含二氧化硅的固相，使核酸結合在固相的工序；(2)利用含有離液物質的洗液來洗滌核酸和固相的復合體的工序；(3)利用含有乙醇的洗液來洗滌核酸和固相的復合體的工序；(4)利用含有丙酮的洗液來洗滌核酸和固相的復合體的工序；(5)加溫核酸和固相的復合體，來干燥殘留的洗液的工序；(6)從含二氧化硅的固相上洗提核酸的工序。在本方法中，為了洗滌核酸和固相的復合體，依次使用含有離液物質的洗液，接著使用含有乙醇的洗液，然后使用含有丙酮的洗液，之后，加溫核酸和固相的復合體來干燥除去殘留的洗液(主要是丙酮)。但是，該方法需要多個用于洗滌核酸和固相的復合體的洗液，而且也需要加熱干燥這樣的工序，因此存在的問題是，不僅非常麻煩，而且需要很長時間才能得到精制的核酸。此外，在該方法中，用于促進有機溶劑干燥的加溫操作也存在由于有機溶劑具有易燃性而存在危險性這樣的問題。另外，專利文獻1(日本特開平11-146783)中記載了以下方法。該方法由以下工序構成(1)向含有核糖核酸的試樣中混合含有離液物質的溶解液和含二氧化硅的固相，使核酸結合在固相的工序；(2)利用含有離液物質的洗液來洗滌核酸和固相的復合體的工序；(3)利用包含水或低鹽濃度緩沖液的洗液來洗滌核酸和固相的復合體的工序；(4)使包含水或低鹽濃度緩沖液的洗提液與核酸和固相的復合體接觸并加熱，將核酸從含二氧化硅的固相中洗提的工序。該方法雖然利用不含有乙醇等有機溶劑的洗液，來實施洗滌工序，但是，其基于核糖核酸和固相的結合牢固的特性，存在不適用于脫氧核糖核酸的問題。另外，在該方法中，洗液中所含有的離液物質的殘留也是個問題。此外，專利文獻2(日本特開平11-127854)中記載了以下方法。該方法由以下工序構成(l)促進核酸從含有核酸的試樣中游離的工序；(2)混合促進游離核酸與固相結合的物質的工序；(3)使混合液與含二氧化硅的固相接觸，使核酸結合于固相的工序；(4)從混合液中分離核酸和固相的復合體的工序；(5)利用含鹽溶液來洗滌核酸和固相的復合體的工序；(6)從固相洗提核酸的工序。但是，該方法中記載，在(5)的工序中使用含有乙醇的有機溶劑的洗液，需要用于除去乙醇的處理。另外，在該方法中，并沒有研究在(5)的工序中使用的洗液所含有的鹽，在精制的核酸溶液中可含有到什么程度。專利文獻1:日本特開平11-146783號公報專利文獻2:日本特開平11-127854號公報
發明內容發明要解決的問題如上所述，雖然有技術是以洗滌核酸和固相的復合體，然后，在實施從固相洗提核酸的工序時完全除去洗液的成分來作為課題，但是，完全除去洗液的成分困難，并且是非常費功夫的操作。因此，本發明的目的是提供一種不用完全去除洗液的成分，就能回收精制的核酸的回收方法以及核酸回收裝置。解決問題的手段達成上述目的的本發明涉及的核酸回收方法為，使結合有核酸的固相與洗液接觸來洗滌該固相，所述洗液含有構成反應液的成分中的至少一種成分，所述反應液能夠應用于使用核酸的反應，從上述固相分離上述洗液，使上述洗液殘留規定的量，然后，使上述結合有核酸的固相與洗提液接觸，將核酸回收于該洗提液中。本發明核酸回收方法中的洗提液與殘留于上述固相的洗液合并，理想情況是形成能夠應用于使用上述核酸的反應的反應液的組成。另外，在本發明涉及的核酸回收方法中，核酸洗提于上述洗提液中后，與上述殘留于固相的洗液合并，還可以添加成分以使其成為能夠應用于使用上述核酸的反應的反應液。在本發明涉及的核酸回收方法中，可以進一步包含固相與含有核酸的溶液接觸從而使該核酸結合于固相的處理。作為構成上述反應液的成分，可以例舉出鹽和/或表面活性劑。在本發明涉及的核酸回收方法中，使用含有核酸的洗提液進行核酸擴增反應時，形成的洗液含有該核酸擴增反應的反應液中含有的鹽成分或表面活性劑成分的至少一種成分。作為核酸擴增反應，可以例舉出聚合酶鏈反應(PCR:PolymeraseChainReaction)或環介導等溫擴增法(LAMP:Loop-mediatedisothermalamplification)。另外，在本發明涉及的核酸回收方法中，通過調節上述洗液的添加量和廢棄量，能夠殘留上述洗液中的規定量。另外，在本發明涉及的核酸回收方法中，通過調節上述固相的含水量和定位上述固相的固相保持部件的含水量，能夠殘留上述洗液中的規定量。此外，在本發明涉及的核酸回收方法中，通過調節上述洗液從上述固相分離的排出壓力或離心力，能夠殘留上述洗液中的規定量。另一方面，達成上述目的的本發明涉及的核酸回收裝置具備洗液供給設備、洗液分離設備、洗提液供給設備，所述洗液供給設備對具有核酸結合能力的固相供給洗液，所述洗液含有構成反應液的成分中的至少一種成分，所述反應液能夠應用于使用核酸的反應，所述洗液分離設備是從上述固相分離上述洗液，以使供給于上述固相的洗液能夠殘留規定量，所述洗提液供給設備是在用上述洗液分離設備除去洗液后，向上述結合有核酸的固相供給洗提液，將核酸回收到利用上述洗提液供給設備供給的洗提液內。在本發明涉及的核酸回收裝置中，通過使由洗液供給設備供給的洗液與結合有核酸的固相接觸，來洗滌該固相。然后，在本發明涉及的核酸回收裝置中，利用洗液分離設備除去洗液，但在固相或其周邊殘存規定量的洗液。并且，在本發明涉及的核酸回收裝置中，通過使由洗提液供給設備供給的洗提液與結合有核酸的固相接觸，能夠從固相上洗提核酸。就本發明涉及的核酸回收裝置來說，上述洗提液與殘留在上述固相的洗液混合，能夠形成具有成為反應液的組成的混合液，所述反應液可以應用于使用上述核酸的反應中。另外，在本發明涉及的核酸回收裝置中，可以進一步含有成分添加設備，核酸洗提在上述洗提液中后，與殘留于上述固相的洗液混合，該成分添加設備添加成分以形成能夠應用于使用上述核酸的反應的反應液。就本發明涉及的核酸回收裝置來說，上述洗液供給設備可以例舉出向容納上述固相的容器內填充洗液的設備。作為洗液供給設備，并無特別限制，可以由填充有洗液的箱和能夠從該箱向上述容器內供給規定量的洗液的分注裝置構成。另外，作為洗液供給設備，并無特別限制，可以由填充有洗液的箱和能夠吸引規定量的洗液至該容器內的吸引裝置構成。就本發明涉及的核酸回收裝置來說，上述洗液分離設備可以例舉出將填充于容納上述固相的容器內的洗液除去的設備。作為洗液分離設備，并無特別限制，可以由能夠從供給于上述溶液內的洗液中吸引回收Mjt量的洗液的分注裝置構成。作為洗液分離設備，并無特別限制，可以例舉出能夠將供給于上述溶液內的洗液中規定量的洗液排出的排出裝置。例示的吸引裝置和排出裝置，可以作為能夠通it^"容納上述固相的容器內進行減壓、加壓來吸引或排出洗液的泵裝置而構成一體。即，就本發明涉及的核酸回收裝置來i兌，上述洗液供^i殳備和上述洗液分離i殳備可以以同一設備構成。另夕卜，就本發明涉及的核酸回收裝置來說，上述洗提液供給設備可以例舉出將洗提液填充進容納上述固相的容器內的設備。作為洗提液供給設備，并無特別限制，可以由填充有洗提液的箱和能夠從該箱向上述容器內供給規定量的洗提液的分注裝置來構成。或者，作為洗提液供給設備，并無特別限制，可以由填充有洗提液的箱和能夠將規定量的洗提液吸引進該容器內的吸引裝置來構成。構成洗提液供給設備的吸引裝置，作為能夠通過減壓、加壓容納上述固相的容器內來吸引或排出洗提液的泵裝置，上述洗液供給設備和上述洗液分離設備可以以同一設備構成。此外，就本發明涉及的核酸回收裝置來說，上述容器可以例舉出具備定位7該固相的固相保持部件的容器。此時，在核酸回收裝置中，由上述洗液供給設備供給的洗液中的身見定量，被保持在該固相保持部件和/或上述固相中。此時，發明效果根據本發明，通過使結合有核酸的固相和洗提液接觸，在洗提該核酸時，能夠將核酸回收入所要的組成液中。因而，根據本發明，不用進一步精制洗提液，就能夠應用于例如核酸擴增反應等使用核酸的反應中。圖1是表示適用本發明的核酸回收方法的一例的流程圖。圖2是表示適用本發明的核酸回收方法的其他例的流程圖。圖3是表示適用本發明的核酸回收方法的其他例的流程圖。圖4是表示構成適用本發明的核酸回收裝置的核酸提取器具的一例的截面圖。圖5是表示構成適用本發明的核酸回收裝置的核酸提取器具的其他例的圖6是表示實施例1的結果的特性圖。符號說明40移液管主體部，41一端部，42另一端部，43固相，44固相保持部件，50容器主體部，51—端部，52另一端部，53固相，54固相保持部件，55集液容器具體實施方式以下，參照附圖來詳細說明本發明。在本發明涉及的核酸回收方法中，首先，將結合有核酸的固相與洗液接觸，來洗滌該固相，所述洗液含有構成反應液的成分之中的至少l種成分，所述反應液能夠應用于使用核酸的反應。這里，結合有核酸的固相并無特別限制，其意味著核酸結合在具有核酸結合能力的固相的狀態。這里，核酸和固相的結合的意思是包括共價結合、離子結合、分子間作用力結合等化學結合中的任一種方式。作為固相，并無特別限制，可以列舉出例如玻璃、硅石、硅藻土等含二氧化硅的固相，或乙酰纖維素等有機物等。可以將這些物質加工成微粒狀或多孔性膜狀來形成固相。另外，通過利用常用方法對培養細胞等細胞、從各種組織采取的組織片、用規定的培養基培養的細菌、真菌、古細菌等微生物、植物細胞和組織片、昆蟲細胞以及昆蟲等生物材料進行處理，從而能夠以例如懸濁液的形式來得到核酸以及蛋白質成分、脂質成分、細胞壁成分等核酸以外的成分。在核酸結合在固相上時，例如，可以釆用利用在離液物質的存在下核酸結合在固相的性質的方法。作為離液物質，可以使用硪化鈉、碘化鉀、高氯酸鈉、硫氰酸鈉、硫氰酸胍、鹽酸胍等。例如，在使用微粒狀的固相時，向含有核酸的懸濁液中添加離液物質和微粒狀的固相，對其進行攪拌。這樣，懸濁液中所含有的核酸可結合在微粒狀的固相上。另夕卜，使用多孔膜狀的固相時，采用將多孔膜狀的固相固定在中空狀的配管內部中的器具。此時，多孔膜狀的固相在配管內部，可以用一對固相保持部件夾持的方式來固定。此時，一對固相保持部件例如可以由多孔性聚丙烯粒子燒結體來形成。使用該器具時，以配管的一端為開口端，將另一端連接泵裝置，通過驅動該泵裝置，而可以從一端吸引和排出溶液。這樣，能夠使溶液與多孔膜狀的固相接觸。吸引至器具內部的溶液也可以利用離心力來排出。在本發明涉及的核酸回收方法中，將按上述方法調制的結合有核酸的固相與洗液接觸。作為洗液，可以規定洗液含有構成反應液成分中的至少一種成分，所述反應液能夠應用于使用核酸的反應。這里，使用核酸的反應可以例示出核酸擴增反應、逆轉錄反應、核酸延伸反應、限制性內切酶等的酶反應以及電泳等。作為更具體的使用核酸的反應，可以例示出聚合酶鏈反應(PCR，PolymeraseChainReaction)、逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR，ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)、連才妄酶鏈反應(LCR，LigaseChainReaction)、鏈置換擴增(SDA，StrandDisplacementAmplification)、轉錄依賴的擴增系統(TAS,TranscriptionAmplificationSystem)、依賴核酸序列的擴增(NASBA,NucleicAcidSequence-BasedAmplification)、轉錄介導擴增(TMA,Transcription-MediatedAmplification)、環介導等溫才廣i曾(LAMP,Loop-mediatedisothermalamplification)、等溫的和嵌合引物起始的核酸擴增(ICAN，IsothermalandChimericprimer-initiatedAmplification'ofNucleicacids)等。能夠應用于這些反應的反應液是指含有用于維持規定pH值的緩沖劑、規定濃度的無機鹽、規定濃度的表面活性劑以及規定的酶等的溶液。反應液根據上述的各種反應而形成不同的組成，對于PCR,可以參照SaikiR.K.etal.(1985)，Science,vol.230，1350-1354的記載;對于PCR和RT-PCR，可以參,哮、MolecularCloning,alaboratorymanual(thirdedition),chapter8.16勺i己載；對于LCR，可以參照LandegrenU.等人(1988)，Science,vol.239,487-491的記載；對于SDA，可以參照WalkerG.T.等人(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.89,392-396的記載；對于TAS,可以參照KwohD.Y.等人(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.86,1173-1177的記載；對于NASBA,可以參照ComptonJ.(1991)，Nature,vol.350.91-92的記載；對于TMA，可以參照日本特許3241717的記載；對于LAMP,可以參照NotomiT.等人(2000)，NucleicAcidRes.，vol.28，e63的記載;對于ICAN,可以參照WO2000-56877等的記載，可以明確地確定其組成和組成比。因而，通過參照這些記載，能夠確定含有構成反應液的成分的至少1種成分的洗液的組成。此時，作為洗液，可以使用含有構成反應液的成分的鹽(無機鹽)或表面活性劑等成分的洗液。這些鹽或表面活性劑的濃度優選是可以維持核酸與固相的結合，并且能夠除去殘留在固相上的雜質(例如，離液物質)的濃度。作為洗液，優選含有0.5M以上的鹽，更優選含有l.OM以上的鹽，尤其優選含有1.5M以上的鹽。洗液的鹽濃度小于0.5M時，由于洗滌可能使核酸從固相上被洗提出來，其結果可能使核酸的回收率降低。另外，在使用洗液洗滌時，為了維持核酸和固相的結合，優選在低溫下實施。作為洗滌時的溫度(與固相混合時的洗液溫度)，優選為4(TC以下，更優選為20。C以下，尤其優選為10。C以下。洗滌時的溫度超過40。C時，由于洗滌可能使核酸從固相上被洗提出來，其結果可能使核酸的回收率降低。例如，作為反應液以PCR用反應液為前提時，標準的PCR反應液的成分包含10mMTris-HCl(pH8.8)、50mMKC1、1.5mMMgCl2的反應緩沖液、0.8mMdNTPmix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、0.5(oM引物l、0.5fiM引物2、2.5UTaqDNA聚合酶和作為分析對象的DNA,因而，例如可以使用洗液的成分是反應緩沖液中所含有的鹽的50倍濃度的溶液，即可以4吏用包含2.5MKC1和75mMMgCl2的溶液。以包含2.5MKC1和75mMMgCl2的溶液作為洗液時，能夠維持核酸和固相的結合，并且可以除去殘留在固相上的雜質。另外，例如，作為反應液以LAMP用反應液為前提時，標準的LAMP反應液的成分包含10mMKC1、20mMTris-HCl(pH8.8)、10mM(NH4)2S04、4mMMgS04、0.1%吹通X-100(TritonX-100)的反應緩沖液、1M甜菜堿(Betaine)、1.6mMdNTPmix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、0.8mM引物FIP、0.8|iM引物BIP、0.2pM引物F3、0.2(iM引物B3、8UBstDNA聚合酶和作為分析對象的DNA，因而，例如可以使用洗液的成分A^應緩沖液中所含有的鹽的50倍濃度的溶液，即可以使用包舍500mMKC1、500mM(NH4)2S04和200rnMMgS04的溶液。以包含500mMKCl、500mM(NH4)2SO4和200mMMgSO4的溶液作為洗液時，能夠維持核酸和固相的結合，并且可以除去殘留在固相上的雜質。此外，例如，作為反應液以限制性內切酶用反應液為前提時，例如限制性內切酶HindIII所產生的限制性內切酶反應的標準的反應液的成分包含10mMTris-HCl(pH8.5)、10mMMgCl2、100mMNaCl、10mM2-巰基乙醇的反應緩沖液、lUHindIII和作為分析對象的DNA,因此，例如洗液的成分可以使用反應緩沖液中所含有的鹽的50倍濃度的溶液，即可以使用包含500mMMgCl2和5MNaCl的溶液。以包含500mMMgCl2和5MNaCl的溶液作為洗液時，能夠維持核酸和固相的結合，并且可以除去殘留在固相上的雜質。此外，例如，作為反應液以電泳用反應液為前4是時，例如，使用標準的MOPS緩沖液(2-(N-嗎啉代)-丙烷磺酸緩沖液)的RNA電泳的試樣溶液的成分包含20mMMOPS、5mMCH3COONa、lmMEDTA、lmMEGTA、5%甘油(Glycerol)和作為分析對象的RNA,因此，例如可以使用洗液的成分是除甘油(Glycerol)之外的成分的50倍濃度的溶液，即可以使用包含1MMOPS、250mMCH3COONa、50mMEDTA、50mMEG丁A的溶液。以包含1MM0PS、250mMCH3COONa、50mMEDTA、50mMEGTA的溶液作為洗液時，能夠維持核酸和固相的結合，并且可以除去殘留在固相上的雜質。在本發明涉及的核酸回收方法中，接著，從固相上分離洗液，并使洗液殘留規定的量。由于在本工序中殘留的洗液含有上述反應液的部分成分，因此可以作為反應液的一部分來利用。換言之，在本發明涉及的核酸回收方法中，因為可以將用于除去殘留于固相的雜質的洗液直接作為后階段的反應液來利用，所以不需要用于完全除去洗液的處理、操作。作為除去洗液的方法，并無特別限制，可以適當地使用分注裝置或泵裝置、離心分離裝置。使用^效粒狀的固相時，通過將上述洗液和結合有核酸的固相在容器內攪拌，進行洗滌，然后，利用分注裝置從該容器中除去規定量的洗液。這樣，能夠從固相中分離洗液，并使洗液殘留規定的量。另外，用一對固相保持部件夾持方式將多孔膜狀的固相固定在配管內時，通過反復吸引和排出洗液來洗滌固相，然后，通過排出洗液，能夠使規定量的洗液殘留在配管內。此時，由于一對固相保持部件也能保持洗液，因此，即使全部除去配管內部的液體，也會殘留保持在固相保持部件的洗液。關于洗液的殘留量，只要從將殘留的洗液作為反應液的一部分來利用的角度考慮來適當地設定即可，并無特別的限制。殘留的洗液用在后面詳細敘述的洗提液稀釋，或者用洗提液和除洗提液之外添加的溶液稀釋，能夠成為適用于使用核酸的反應的反應液的一部分。因而，洗液的殘留量可以由洗液中含有的成分濃度和洗才是液和/或除洗提液之外添加的溶液的添加量來決定。換言之，為了從洗液中含有的成分濃度和洗提液和/或除洗提液之外添加的溶液的添加量，得到被稀釋成所要的成分濃度的反應液，可以規定洗液的殘留量。作為控制洗液的殘留量的方法，例如可以通過調節洗液的添加量和廢棄量來得到規定的殘留洗液量。或者，以一對固相保持部件夾持多孔膜狀的固相的方式將其固定于配管內時，通過調節固相和固相保持部件的含水量也可以控制洗液的殘留量。例如，能夠作為固相使用的玻璃纖維濾紙的含水量，依賴于其體積、材質、纖維徑、粒子保持徑等。另外，能夠作為固相使用的玻璃粒子的含水量，依賴于其粒子數、材質、粒徑等。另外，能夠作為固相保持部件使用的多孔性聚丙烯粒子燒結體的含水量，依賴于其體積、材質、粒徑、粒子保持徑等。另外，固相和固相保持部件的含水量依賴于洗液的廢棄方法，例如，依賴于用于廢棄洗液的排出壓力或離心力等的大小。因而，通過調節固相和固相保持部件的物理特性以及洗液的廢棄方法，可以控制固相和固相保持部件的洗液的含水量。接著，在本發明涉及的核酸回收方法中，使結合核酸的固相與洗提液接觸，將核酸回收進該洗提液中。這里，所謂洗提液，只要是具有使結合于固相的核酸從該固相上脫離，使該核酸存在于洗提液中的作用的物質，就沒有特別限制。作為洗提液，可以例舉出如水和Tris緩沖液。另外，作為洗提液，也可以使用這樣的溶液，該溶液不僅含有殘留于固相的洗液中所含有的成分，而且還含有構成后階段的反應液的組成的成分。即，洗提液的組成只要能從固相上洗提核余成分。作為洗提液，可以是含有除了規定的反應液組成中已被洗液含有的成分之外的全部其余成分的組成，也可以是含有一部分該其余成分的組成。另外，洗提液的量優選為如下的量，即，該液量可以將殘留于固相等的洗\，f^vi邵旰風餳反勝收Y日^方兄疋》二即，含有構成反應液的成分的洗液以該反應液的規定濃度的50倍的濃度含有該成分時，優選使用將殘留的洗液的液量稀釋50倍的量的洗提液。這樣，洗之外的全部其余成分的話，就可以將洗液和洗提液合并的溶液直接作為反應液外的一部分其余成分的情形中，對洗液和洗4^液合并的溶液，可通過在之后添加反應液組成中的不足成分來制備反應液。此時，添加含有反應液組成中不足的成分的溶液時，由于會稀釋包含洗液和洗提液的溶液，因此要注意洗液和洗提液中所含有的成分的濃度。例如，作為反應液以PCR用反應液為前提時，標準的PCR反應液的成分包含lOmMTris-HCl(pH8.8)、50mMKC1、1.5mMMgCl2的反應緩沖液、0.8mMdNTPmix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、0.5^M引物1、0.5,引物2、2.5UTaqDNA聚合酶和作為分析對象的DNA。使用反應液所含有的鹽的50倍濃度的溶液，即，包含2.5MKCl和75mMMgCl2的溶液作為洗液時，則作為洗提液，就可以使用含有10mMTris-HCl(pH8.8)、0.8mMdNTPmix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、0.5|iM引物1、0.5mM引物2、2.5UTaqDNA聚合酶的溶液。這些濃度為與洗液合并后的濃度。另外，該洗提液的使用量是將該洗液稀釋50倍的量。這樣，使用洗提液將核酸從固相洗提后的溶液，包含洗提的核酸(作為PCR的模板)和PCR用反應液的全部組成，能夠直接供于PCR反應。以上述的LAMP用反應液、限制性內切酶用反應液或電泳用反應液為前提時，同樣可以規定洗提液的組成和量。作為洗提液，為了防止酶由于溫度引起的失活，可以是僅不含酶的構成。此時，通過向合并洗液和洗提液的溶液中，添加作為其余成分的酶，從而可以形成-見定的反應液組成。另外，作為洗提時的溫度，并無特別的限制，但優選在2(TC以上，更優選在40。C以上，最優選在60。C以上。洗提時的溫度小于2(TC時，可能產生如下問題核酸不能從固相上完全洗提，或從固相上完全洗提核酸需要很長時間。以上說明的本發明涉及的核酸回收方法的具體的流程圖如圖13所示。圖1~3所示的流程圖各自表示本發明涉及的核酸回收方法的一例，并不是用于限定性地解釋本發明的技術范圍。本發明涉及的核酸回收方法，例如根據圖1所示的流程圖，包含如下工序(1)將核酸和固相的復合體與洗液接觸的洗滌工序，所述洗液含有后續核酸分析反應液中所含有的成分；(2)使規定量的洗提液與復合體接觸來洗提核酸的工序，所述規定量是能夠將由前工序得到的殘留洗液所含有的成分稀釋至適于后續的核酸分析反應的濃度的量；(3)添加核酸分析反應液的其余成分的工序。另外，最終得到的溶液被供于核酸分析。另外，本發明涉及的核酸回收方法，例如根據圖2所示的流程圖，包含如下工序(l)將核酸和固相的復合體與洗液接觸的洗滌工序，所述洗液含有后續核酸分析反應液中所含有的成分；(2)使規定量的洗提液與復合體接觸來洗提核酸的工序，所述規定量是能夠將由前道工序得到的殘留洗液所含有的成分稀釋至適于后續的核酸分析反應的濃度的量，并且所述規定量的洗提液含有核酸分析反應中需要的其他成分的一部分；(3)添加核酸分析反應液的其余成分的工序。另外，最終得到的溶液被供于核酸分析中。此外，本發明涉及的核酸回收方法，例如根據圖3所示的流程圖，包含如下工序(l)使洗液與核酸和固相的復合體接觸的洗滌工序，所述洗液含有后續核酸分析反應液中所含有的成分；(2)使規定量的洗提液與復合體接觸來洗提核酸的工序，所述M^定量是能夠將由前道工序得到的殘留洗液所含有的成分稀釋至適于后續的核酸分析反應的濃度的量，所述規定量的洗提液含有核酸分析反應中需要的全部其余成分。另外，最終得到的溶液被供于核酸分析。實施例以下，使用本實施例對本發明涉及的核酸回收方法和核酸回收裝置進行說明，但本發明的技術范圍并不限于這些實施例。首先，對本實施例中使用的試樣、試劑、核S爽提取器具、核酸提取方法、核酸定量方法和核酸分析方法依次進行說明。1.試樣試樣A:將pBR32質粒DNA添加入標準血清的試樣(1|ig/200|il)試樣B:將由HBV(乙肝病毒)陽性樣品精制的DNA添加入標準血清的假陽性樣品(103copy/200nl)。2.試劑溶解液A:4.0M硫氰酸胍lOOmMMES(2-(N-嗎啉)乙磺酸)25mMEDTA.2Na20%(v/v)吹通X-IOO(TritonX-100)第一洗液4.0M硫氰酸胍lOOmMMES(2-(N-嗎啉)乙磺酸)25mMEDTA'2Nal%(v/v)吹通X-IOO(TritonX-100)第二洗液lOmMTris國HCl(pH8.0)80%(v/v)EtOH第三洗液A:1510mMTris-HCl(pH8.0)80%(v/v)EtOH第三洗液B:2.5MKCl75mMMgCl2第三洗液C:2.5MKC175mMMgCl2500mMTris-HCl(pH8.0)第三洗液D:2.5MKCl75mMMgCl2500mMTris-HCl(pH8.0)0.5%吹通X-IOO(TritonX-100)第三洗液E:500mMKCl500mM(NH4)2S04200mMMgS04第三洗液F:500mMKCl500mM(NH4)2S04200mMMgS041MTris-HCl(pH8.0)第三洗液G:500mMKCl500mM(NH4)2S04200mMMgS04lMTris-HCl(pH8.0)5%吹通X-IOO(TritonX-100)洗提液A:lOmMTris-HC1(pH8.8)洗提液B:超純水洗提液C:lOmMTris國HCl(pH8.8)0.8mMdNTPmixUATP、dCTP、dGTP、dTTP)0.5|^M引物10.5^iM引物22.5UTaqDNA聚合酶洗提液D:20mMTris-HCl(pH8.8)1M甜菜堿1.6mMdNTPmix(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)0.8piM引物FIPO.^iM引物BIP0.2pM引物F30.2拜引物B38UBstDNA聚合酶3.核酸提取器具核酸提取器具A:核酸提取器具A的截面圖示于圖4中。核酸提取器具A如圖4所示，是由移液管主體部40、加減壓機器(未圖示)、固相43、固相保持部件44構成的，所述移液管主體部40是成型聚丙烯樹脂得到的，所述加減壓機器連接在移液管主體部40的開口的一端部41上，所述固相43被配設在移液管主體部40的開口的另一端部42附近，所述固相保持部件44將固相43定位于移液管主體部40的規定的位置上。核酸提取器具A通過加減壓機器產生的壓力差，能夠從另一端部42吸引和排出溶液。通過從另一端部42吸引溶液而被吸引入移液管主體部40內的溶液，會浸潤固相43和固相保持部件44。固相43是玻璃纖維濾紙，固相保持部件44是多孔聚丙烯粒子燒結體。核酸提取器具B:核酸提取器具B的截面圖示于圖5中。核酸提取器具B如圖5所示，是由容器主體部50、固相53、固相保持部件54、集液容器55構成的，所述固相53配置于另一端部52的附近，該另一端部52位于在容器主體部50的上方開口的一端部51的相反側上，所述固相保持部件54對固相53的位置進行定位，集液器55具有插入容器主體部50的開口部。核酸提取器具B中，從容器主體部50的一端部51供給溶液。被供給于容器主體部50的溶液到達固相53和固相保持部件54并與它們接觸。以此狀態對核酸提取器具B施加離心力，施加離心力的方向是從容器主體部50的一端部51至集液容器55的底部，從而，使被供給于容器主體部50的溶液從容器主體部50的另一端部52排入到集液容器55內。固相53是玻璃纖維濾紙，固相保持部件54是多孔聚丙烯粒子燒結體。核酸提取器具C:核酸提取器具C未圖示，是平均粒徑為5(am的玻璃粒子。作為固相的玻璃粒子在規定的容器內與溶液混合，利用離心力與液相分離。4.核酸提取方法核酸提取器具A所適用的核酸提取方法如下。以下的核酸提取方法是可以不限于試樣、洗液和洗提液等種類來應用的方法。(1)向0.2ml試樣中添加0.8ml溶解液，進行混合。(2)將加減壓機器連接在核酸提取器具A上，將混合液吸引排出5次。(3)廢棄混合液。(4)將1.0ml第一洗液吸引排出3次。(5)廢棄洗液。(6)將1.0ml第二洗液吸引排出3次。(7)廢棄洗液。(8)將0.5ml冰上冷卻后的第三洗液吸引排出1次。(9)廢棄洗液(殘留液量為2pl)。(10)將O.lml加溫至6(TC的洗提液吸引排出10次。(11)回收洗提液。核酸提取器具B所適用的核酸提取方法如下。以下的核酸提取方法是可以不限于試樣、洗液和洗提液等種類來應用的方法。(I)向0.2ml試樣中添加0.8ml溶解液，進行混合。(2)投入進核酸提取器具B中，進行離心分離。(3)廢棄集液容器的混合液。(4)投入1.0ml第一洗液，進行離心分離。(5)廢棄集液容器的洗液。(6)投入l.Oml第二洗液，進行離心分離。(7)廢棄集液容器的洗液。(8)投入0.5ml水上冷卻的第三洗液，進行離心分離。(9)設置新的集液容器(殘留液量為2^1)。(10)投入0.lml加溫至60。C的洗提液，進行離心分離。(II)回收洗提液。核酸提取器具C所適用的核酸提取方法如下。以下的核酸提取方法是可以不限于試樣、洗液和洗提液等種類來應用的方法。(1)向0.2ml試樣中添加0.8ml溶解液和10mg玻璃粒子。(2)混合IO分鐘。(3)用離心器進行B/F分離，廢棄液相。(4)添加l.Oml第一洗液，進行混合。(5)用離心器進行B/F分離，廢棄液相。(6)添加1.Oml第二洗液，進行混合。(7)用離心器進行B/F分離，廢棄液相。(8)添加O.5ml在冰上冷卻的第三洗液，進行混合。(9)用離心器進行B/F分離，廢棄液相(殘留液量為2ial)。(10)添加0.lml洗提液，在60。C加溫5分鐘。(11)用離心器進行B/F分離，回收洗提液。5.核酸定量方法洗液中含有的核酸為，用對雙鏈DNA特異的熒光色素對試樣中含有的DNA進行染色，通過熒光光度計測定熒光強度來算出DNA量。作為熒光色素，使用PicoGreen雙鏈DNA定量試劑盒(PicoGreendsDNAQuantitationKit)(分子探針(MolecularProbe)公司)，作為熒光光度計，使用ARVOsx1420多標記計數器(ARVOsx1420MultilabelCounter)(華萊克(wallac)公司)。6.核酸分析方法在本實施例中，作為核酸分析方法的例子按照以下要領進行PCR法和LAMP法。利用PCR法和LAMP法得到的擴增產物的確認，是實施以0.8%瓊脂糖凝膠為支持體的電泳，用對雙鏈DNA特異的熒光色素進行染色，在紫外透射儀所產生的紫外線照射下進行確認。作為熒光色素，使用SYBR綠色核酸凝月交染液(SYBRGreenInucleicacidgelstain)(分子#罙4十7>司)。PCR:以來源于HBV的DNA為模板DNA的PCR，是以(J.Clin.Microbiol.,29(9),1804-1811(1991))的報告為基礎，在下述的引物和溫度條件下實施。引物1:5，-GCGGATCCGAGTTACTCTCGTTTTTGC-3，(序列號1)引物2:5，-GCAAGCTTTCTAACAACAGTAGTTTCCGG-3，(序列號2)溫度條件在94。C維持5分鐘后，以94°C1分鐘、55°C1分鐘和72°C1分鐘為1個循環，進行30個循環，最后在72。C維持10分鐘。LAMP:以來源于HBV的DNA為模板DNA的LAMP,是以(NucleicAcidResearch,28(12),e63(2000))的報告為基礎，在下述的引物和溫度條件下實施LAMP。引物FIP:5,-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGACAAACGGGCAACATACCTT-3，(序列號3)引物BIP:5，國GATAAAACGCCGCAGACACATCCTTCCAACCTCTTGTCCTCCAA-3，(序列號4)引物F3:5，-GGTGGTTGATGTTCCTGGA-3，(序列號5)引物B3:5，-CAAAATTCGCAGTCCCCAAC-3，(序列號6)溫度條件在95。C維持5分鐘后在冰上放置3分鐘，然后，添加BstDNA聚合酶，在65"C反應1小時，最后在80。C維持IO分鐘。[實施例1]在使用試樣A、溶解試劑A、第一洗滌試劑A、第二洗液A、洗提液A、核酸提取器具A的DNA提取中，將第三洗液制成A、B的稀釋液(溶質濃度:100%、80%、60%、40%、20%)和E的稀釋液(溶質濃度100%、80。/。、60%、40%、20%)來實施DNA提取。在各自的第三洗液A的稀釋液、第三洗液B的稀釋液和第三洗液E的稀釋液中，對DNA回收量進行定量。并且，算出每個稀釋液所對應的DNA回收率，該回收率是相對于使用第三洗液A的DNA回收量的使用第三洗液B和第三洗液E時的DNA回收率。結果示于圖6中。第三洗液B隨著稀釋率的增加，DNA回收率增加，溶質濃度在60%以上時，得到與第三洗液A同等的DNA回收量。另一方面，在第三洗液E中，隨著稀釋率的增加，DNA回收率也增加，但與第三洗液B相比，DNA回收率的值低。認為是第三洗液E的鹽濃度比第三洗液B的鹽濃度低，核酸和固相的結合維持力也低。從以上看出，在洗滌工序中，含有一定濃度以上的PCR反應液所需要成分的洗液，可以維持核酸和固相的結合來洗滌核酸和固相的復合體。[實施例2]在使用試樣B、溶解試劑A、第一洗滌試劑A、第二洗液A、核酸提取器具A的DNA提取中，第三洗液、洗提液、核酸分析反應液其余成分、核酸分析都按下表所示來實施，判斷是否有核酸分析反應所產生的核酸擴增。實驗系統和實驗結果概括示于表l中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>從表1所示的結果可以確認出，在全部組合的核酸提取和核酸擴增法中，有良好的核酸擴增。以上顯示，通過用含有核酸擴增反應所需要成分的洗液來洗滌，將殘留的洗液和洗提液合并的溶液作為反應液，從而可以得到能夠適用于核酸分析反應的核酸溶液。[實施例3]在使用試樣B、溶解試劑A、第一洗滌試劑A、第二洗液A、第三洗液C、洗提液B的DNA回收以及其后的PCR中，采用核酸提取器具A、B、C,判斷是否可以實現PCR擴增。其結果示于表2中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>從表2所示的結果可以確認，在全部的核酸提取器具A、B和C中，都能實現核酸提取和核酸擴增。以上顯示，本方法在基于核酸和固相的結合特性的各種核酸提取方法中都能夠適用。序列表<110>株式會社日歷高新技術<120>核酸回收方法及核酸回收裝置<130>P06-1057〈160〉6〈170〉Patentlnversion3.4〈210〉1<211>27<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉合成DNA<400>1gcggatccgagttactctcgtttttgc<210>2〈211〉29<212>DNA<213〉人工序列<220><223〉合成■〈400〉2gcaagctttctaac犯cagtagtttccgg〈210〉3〈211>46〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉合成DNA<400>3cctgctgctatgcctcatcttctttgacaaacgggcaacatacctt<210>4〈211〉44<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉合成DNA〈400〉4gataaaacgccgcagacacatccttccaacctcttgtcctccaa44〈210〉5〈211〉19〈212〉薩<213〉人工序列〈220〉<223>合成DNA〈400〉5ggtggttgatgttcctgga〈210〉6<211〉20<212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉合成DNA〈400〉6caaaattcgcagtccccaac權利要求1.一種核酸回收方法，其特征在于，將結合有核酸的固相與洗液接觸來洗滌該固相，所述洗液含有構成反應液的成分中的至少一種成分，所述反應液能夠應用于使用核酸的反應，從上述固相中分離洗液，并使上述洗液殘留規定的量，使上述結合有核酸的固相與洗提液接觸，將核酸回收到該洗提液中。2.根據權利要求1所述的核酸回收方法，其中，上述洗提液與殘留于上述固相的洗液混合，具有形成反應液的組成，所述反應液能夠應用于使用上述核酸的反應。3.根據權利要求1所述的核酸回收方法，其中，添加成分，使核酸洗提入上述洗提液后，與殘留于上述固相的洗液混合，成為能夠應用于使用核酸的反應的反應液。4.根據權利要求1所述的核酸回收方法，其中，上述洗液含有鹽和/或表面活性劑。5.根據權利要求1所述的核酸回收方法，其中，通過調節上述洗液的添加量和廢棄量，使上述洗液殘留規定的量。6.根據權利要求1所述的核酸回收方法，其中，根據上述固相的含水量和定位上述固相的固相保持部件的含水量，使上述洗液殘留規定的量。7.根據權利要求1所述的核酸回收方法，其中，通過調節上述洗液從上述固相分離時的排出壓力或離心力，使上述洗液殘留規定的量。8.根據權利要求1所述的核酸回收方法，其中，上述反應為聚合酶鏈反應。9.根據權利要求1所述的核酸回收方法，其中，上述反應為環介導等溫擴增法。10.根據權利要求1所述的核酸回收方法，其中，上述洗液含有從氯化鉀(KC1)、氯化鎂(MgCl2)、硫酸銨((NH4)2S04)、硫酸鎂(MgS04)、Tris-HCl和聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯中選出的至少一種成分。11.根據權利要求1所述的核酸回收方法，其中，進一步包含使固相與含有核酸的溶液接觸，使該核酸結合于固相的處理。12.—種核酸回收裝置，其特征在于，該核酸回收裝置具備洗液供給設備、洗液分離設備、洗提液供給設備，將核酸回收到用上述洗提液供給設備供給的洗提液內，所述洗液供給設備對具有核酸結合能力的固相供給洗液，所述洗液含有構成反應液的成分中的至少一種成分，所述反應液能夠應用于使用核酸的反應，所述洗液分離設備由上述固相分離上述溶液，以使供給于上述固相的洗液殘留規定量，所述洗提液供給設備在用上述洗液分離設備除去洗液之后，將洗提液供給于上述結合有核酸的固相。13.根據權利要求12所述的核酸回收裝置，其中，上述洗提液與殘留于上述固相的洗液混合，具有形成反應液的組成，所述反應液能夠應用于上述使用核酸的反應。14.根據權利要求12所述的核酸回收裝置，其中，進一步具有成分添加設備，所述成分添加設備添加成分，使核酸洗提入上述洗提液中后，與殘留于上述固相的洗液混合，形成能夠應用于使用上述核酸的反應的反應液。15.根據權利要求12所述的核酸回收裝置，其中，上述洗液供給設備是將洗液填充進收容上述固相的容器內的設備。16.根據權利要求12所述的核酸回收裝置，其中，上述洗液分離設備是將填充于收容上述固相的容器內的洗液除去的設備。17.根據權利要求12所述的核酸回收裝置，其中，上述洗提液供給設備是將洗提液填充進收容上述固相的容器內的設備。18.根據權利要求12所述的核酸回收裝置，其中，上述固相被保持在容器內，利用上述洗液設備將洗液吸引至該容器內，利用洗液分離設備排出該容器內的洗液，利用上述洗提液供給設備將洗提液吸引至該容器內。19.根據權利要求18所述的核酸回收裝置，其中，上述容器具備定位該固相的固相保持部件，該固相保持部件和/或上述固相保持洗液的規定量。全文摘要本發明提供一種核酸回收方法及核酸回收裝置，其不完全除去洗液的成分，來回收精制的核酸。本發明的核酸回收方法是，將結合有核酸的固相與洗液接觸來洗滌該固相，所述洗液含有構成反應液的成分中的至少一種成分，所述反應液能夠應用于使用核酸的反應，從上述固相中分離洗液，使得上述洗液殘留規定量，然后，將上述結合有核酸的固相與洗提液接觸，使核酸回收到該洗提液中。文檔編號C12M1/00GK101255415SQ20081008093公開日2008年9月3日申請日期2008年2月29日優先權日2007年3月1日發明者山下善寬,櫻井智也申請人:株式會社日立高新技術