一種人工缺失逆反應的蔗糖磷酸化酶的基因及其應用的制作方法

專利名稱：一種人工缺失逆反應的蔗糖磷酸化酶的基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種人工缺失逆反應的蔗糖磷酸化酶的基因，這個酶的特殊在 于缺失蔗糖水解的逆反應，該基因編碼的蛋白質可用于蔗糖的降解。
背景技術：
蔗糖作為植物中通過光合作用產生的糖類物質，是一種含量豐富的生物質，
全球蔗糖的年產量超過了 l億噸。蔗糖是由a-D-葡萄糖和D-果糖通過l， 2糖苷鍵組成的二糖，該二糖分解而成的單糖長期以來作為發酵工業中的碳源 而被利用，特別是水解發酵產酒精工業的應用。
在自然界中，蔗糖被細菌分解利用主要是經過兩個途徑，不同的微生物使 用不同的途徑。 一個是PTS途徑，如芽孢桿菌屬、梭菌屬等微生物使用這樣的 途徑；另一個是蔗糖滲透酶途徑，如雙歧桿菌屬，腸膜明串珠菌屬等菌使用這 個途徑。PTS途徑通過一個稱為phosphoenolpy匿ate-dependent phosphotransferase system把蔗糖磷酸化后轉運入細胞膜內，磷酸化的蔗糖再被 磷酸蔗糖水解酶水解成6—磷酸葡萄糖和果糖。而蔗糖滲透途徑通過蔗糖滲透 酶把蔗糖運輸到細胞內，然后由蔗糖磷酸化酶把蔗糖水解成l一磷酸葡萄糖和 果糖，l一磷酸葡萄糖跟著被轉化成6—磷酸葡萄糖。6 —磷酸葡萄糖和果糖進 入微生物的糖酵解發酵途徑得到有機醇、氨基酸及生物聚合物等高附加值的化 工產品(S. J. Reid， V. R. Abratt. 2005. Sucrose utilization in bacteria: geneticorganization and regulation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 67:312-321)。蔗糖7JC角軍酶 類(磷酸蔗糖水解酶、蔗糖磷酸化酶等)是降解蔗糖代謝途徑的第一個酶，也 是微生物蔗糖代謝途徑中的關鍵酶之一，是決定蔗糖發酵時間的最主要的因素 之一。因此尋找新的蔗糖水解酶用于構建新的更適合工業化生產各種化工產品 的基因工程菌，提高微生物水解蔗糖的轉化效率和水解速度，從而縮短發酵生 產時間，對于降低直接發酵甘蔗汁生產各種化工產品的生產成本具有十分重要 的意義。
蔗糖磷酸化酶屬于糖基水解酶類(glycosyl hydrolases)，許多糖基水解酶 由一個催化功能域和一個或更多個其它的功能域組成，根據催化功能域的氨基 酸序列相似性，糖基水解酶類被劃分成不同的家族(families) (Davies G.， Henrissat B. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 3:853-859; Henrissat B., Bairoch A. 1996. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316:695-696)。根據碳水化合物活 性酶數據庫(http:〃www.cazy.org/fam/acc—GH.html)上所列糖基水解酶類的最新 清單，目前糖基水解酶類有112個家族。蔗糖磷酸化酶屬于糖基水解酶類家族 13。糖基水解酶家族13的糖基水解酶屬于以"保留"(retaining)作用方式進行 水解反應，這樣的水解作用方式具有水解作用的逆反應，這個逆反應可以把葡 萄糖基轉移到受體上形成多糖，這個就是轉糖苷作用。
蔗糖磷酸化酶催化蔗糖水解成1一磷酸葡萄糖和果糖。這個催化反應是個可 逆反應在有l一磷酸葡萄糖和果糖存在的條件下，蔗糖磷酸化酶催化逆反應 消耗1—磷酸葡萄糖和果糖生成蔗糖(E. J. Vandamme, J. V. Loo, L. Machtelinckx, A. D. Laporte. 1987. Microbial sucrose phosphorylase: fermentation process, properties, and biotechnical application. Adv. Appl. Micro. 12:163-201 )。 可逆反應 的反應結果是，在反應混合物中，蔗糖、l一磷酸葡萄糖和果糖的量形成動態平 衡，逆反應的存在使正向反應(蔗糖水解)無法進行完全。而人工缺失逆反應使反應產物無法逆向生成反應底物，從而可以使蔗糖的水解徹底進行。
雖然己有研究報告分析和研究蔗糖磷酸化酶在細菌降解利用蔗糖的過程中
所起的重要作用(E. J. Luesink， J. D. Marugg, O. P. Kuipers, W. M. Vos. 1999. Characterization of the divergent sacBK and sac^T operons, involved in sucrose utilization by /actococcws /ac"s. J. Bacterio. 181(6): 1924-1926; B. Kullin, V.R. Abratt， S. J. Reid. 2006. A functional analysis of the /owgwm cscj
and scrP genes in sucrose utilization. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:975-981)， 并 且也有研究者研究了不同的蔗糖磷酸化酶水解蔗糖的逆反應-轉糖苷作用的作 用方式(L. A. Broek， E. L. Boxtel, R. P. Kievit, R.Verhoef， G. Beldman， A. G. Voragen. 2004. Physico-chemical and transglucosylation properties of recombinant sucrose phosphorylase from 5zy do6acfen.ww ado/ascew/^ DSM20083. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65:219-227)。但是目前所發現的蔗糖磷酸化酶都具有催化 l-磷酸葡萄糖和果糖等單糖(如阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖、木糖)進 行轉糖苷反應的能力，目前也沒有發現任何成功的人工缺失蔗糖磷酸化酶逆反 應的報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一種人工缺失逆反應的蔗糖磷酸化酶的基因及其應 用，所述蔗糖磷酸化酶沒有蔗糖水解的逆反應，也沒有和各種單糖(阿拉伯糖、 果糖、半乳糖、葡萄糖、山梨糖、木糖)的轉糖苷作用。
本發明通過以下技術方案在到上述目的
一種編碼蔗糖磷酸化酶的基因，所述基因具有SEQ ID NO: 1核苷酸序列或 其功能等同變異體。
所述功能等同變異體為SEQ ID N0:1的核苷酸序列的突變形式，突變形式 包括缺失、無義、插入、錯義。所述的基因所編碼的蔗糖磷酸化酶，其具有如SEQIDNO: 2所述的氨基酸 序列，由501個氨基酸組成。
一種表達載體，它含有所述的蔗糖磷酸化酶基因。
一種宿主細胞，它含有所述的蔗糖磷酸化酶基因的原核細胞或真核細胞。 所述的蔗糖磷酸化酶在蔗糖降解和對含蔗糖材料處理中的應用。 一種編碼蔗糖磷酸化酶的基因^gx (SEQIDN0: 1)，通過分子改造蔗糖磷 酸化酶的基因(GenBank序列號FJ472846)而得到，具體是通過在 "rn;^w分子上加入一段人工設計的核苷酸序列，改造得到一個新的蔗糖磷酸化 酶。
SEQ ID N0: 2的蛋白質是基因^，gx編碼的蔗糖酶產物Spgx，由501個氨 基酸組成。
基因sp^y在大腸桿菌中表達的重組產物Spgx能降解蔗糖生成l一磷酸葡 萄糖和果糖。
本發明還涉及含有本發明基因的表達載體，及用于轉化本發明基因的宿主。 本發明的有益效果和突出的實質性特點在于
1、 通過對一個磷酸蔗糖酶進行DNA分子改造，獲得了新的基因。這個新的 基因所編碼的蛋白質具有水解蔗糖生成l一磷酸葡萄糖和果糖的功能，但是缺 失了逆向反應，不能把l一磷酸葡萄糖和果糖逆向生成蔗糖。同時也缺失了對 各種單糖的轉糖苷作用。獲得的新的基因可用于構建高效降解利用蔗糖的宿主 菌。
2、 本發明所提供的蔗糖磷酸化酶基因，在蔗糖的降解中具有廣泛的用途。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作詳細描述實施例中所用材料包括大腸桿菌(五"/^nV^"co/z')株系XU-blue (購自 TaKaRa公司)；載體為購自Intrivogen公司的表達載體pSE380;購自Stratagene 公司的基因突變試劑盒(QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit，目錄號 200521);購自Intrivogen公司的NI-NTA蛋白質組氨酸純化介質；購自TaKaRa、 MBI的限制性內切酶、修飾酶和購自Sigma公司的各種糖等試劑。
1) w;wpa^基因的克隆
用正向引物
ATTGCC-3，(包含一個Afw"I酶切位點和一個6xHis標簽在5，末端)和反向引物, 5'-CACAAGCTTCGATGGAGCGCCGGCATCGGC -3，(包含一個///"dill酶切位 點在5'端)進行PCR擴增。擴增產物用Miml和///mil11進行雙酶切然后連接到 pSE380表達載體中。
2) 明^基因的獲得
^gx基因是根據"附/ a^基因序列信息進行設計改造。使用正向引物
AGCTG-3，)和反向引物(5'-GAACGTCAGCGTGGCCT GGCTGGTTTCGCCGCGCCAGCGAAGCCGGATTTG-3，)進行PCR， PCR反應 程序第一步95°C 2分鐘；第二步進行30個循環，循環為98°C 1分鐘，46°C 50 秒，72°C 6分鐘；第三步72。C 10分鐘。PCR產物使用1 ^LD;wI在37。C酶切 一個小時，然后轉化XL10-Gold感受態細胞(CaCl2化學法轉化)。轉化產物克 隆送交大連寶生物公司進行DNA測序分析確定正確的轉化子。
3) 蔗糖磷酸化酶基因spgx的表達和純化
將含有質粒pSE-^ gx的重組大腸桿菌XL1-Blue菌株接種到20 mL含氨芐 青霉素(100pg/mL)的LB培養基中，37。C振蕩培養，待00600為0.6時，力口
7入IPTG (終濃度為0.5mmol/L)、 D-山梨醇(終濃度為100 mmol/L)和甜菜堿 (終濃度為2.5mmol/L)， 20'C誘導20小時。11000轉/分離心3分鐘，收集菌 體，用4mL裂解緩沖液(50mmol/LNaH2PO4， 300 mmol/L NaCl， 10mmol/L咪 唑，pH8.0)重懸菌體，超聲波破胞9分鐘。12000轉/分離心10分鐘，取上清 進行后面的蛋白質純化。按每4 mL上清液加入1 mL 50°/。的NI-NTA膠體，在4°C 用200轉/分搖60分鐘，把混合物灌注到柱子，收集流出物。加lmL沖洗緩沖 液(50mmol/LNaH2PO4， 300 mmol/LNaCl， 20mmol/L咪唑，pH8.0)到柱子 里，緩慢攪拌，收集流出物。重復沖洗步驟4次。加入洗脫緩沖液(50mmol/L NaH2P04， 300mmol/LNaCl， 250 mmol/L咪唑，pH8.0)洗脫蛋白質。收集洗 脫的蛋白質溶液，并用變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)驗證。 4)蔗糖磷酸化酶Spgx水解蔗糖酶活的測定和轉糖苷酶活的測試
蔗糖磷酸化酶Spgx水解蔗糖反應取10 pL蔗糖磷酸化酶Spgx純化物，與
1%蔗糖溶液(50mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0))在500 pL的反應體系中37。C作
用1小時。蔗糖磷酸化酶Spgx轉糖苷反應測試取10 )iL蔗糖磷酸化酶Spgx純化
物加入含有l-磷酸葡萄糖[2% (w/v)]和不同的受體糖(阿拉伯糖、果糖、半乳
糖、葡萄糖、山梨糖、木糖)[5%(w/v)]的磷酸緩沖液(50mmol/L,pH7.0)在
37'C放置12個小時。反應時間到后，所有反應在10(TC加熱10分鐘。蔗糖的水解
能力和轉糖苷活性用薄層層析色譜法進行檢測，薄層層析是在正丁醇/乙酸/水
(2:1:1， v/v)的展層體系中進行，層析板用溶解在甲醇中的硫酸(50% (v/v))噴
射并在11(TC加熱10分鐘。序列表
〈110〉廣西大學
〈120〉一種人工缺失逆反應的蔗糖磷酸化酶的基因及其應用 〈160〉 2
<170〉 Patentln Version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 1506
〈212〉 DNA
〈213>人工序列
<220〉
〈221〉 gene
〈222〉 (1)…(1506)
〈223〉
〈400〉 1
atgaaaaata aggttcagct tattgcctat gtcgetccgta tttccggagg aggtttccgc 60 ^gctccatg cgcc3ttaac agggccgctg gcggaaattt tcggaggagc gcatcttctg 120 ccgtttttca ctcccatcga tggtgcggat gccggattcg atcccagcga tcacacgcag 180 gtggatccac gtcttggaac ctgggacgat gtccgcattc tgggcggcgc aatxgaactg 240 gtcgcggatc tgattgtgaa tcatgtttcc tcatcatctc cgcagtttat cgattattcg 300 aagaagggga gcgattccct gtatgcgggg atgtttctaa cctatgaccg tgtttttccc 360 gagggcgcgc gcgaggcgga cattctgagg atttaccggc cgcgtcccac gcttcctttc 420 agtcctgtaa cgctgtcgtc gagagaaaga aagttattat ggactacgtt taatccggag 480 caggtggaca tcgatgtccg ccatccgg犯gcggaagcgt atctgcattc gattctcaaa 540 aaatttcagg cggcgggaat cagaa/tgata cggctggacg ctgtcgggta tgcgatcaag 600 aaaccgggcg ccagctgttt cstga^ttccg g犯accttcg acttcatcgc cgaactgacc 660 ga犯aagccc gcgca/ttggg aatagaagtt ttagttgaaa ttcacagcca ttacaggaag 720 cagatcgaaa tcgcccgcca ggtggactgg gtctacgatt ttgccttgcc gccgctggtg 780 ttgcacgctc tttttgcctc cgatcctcat cctttggcgc aatggctttc catcagtccc 840 cgcaacgcgg tgacagttct tgacacgcac gacggcatcg gcgtgatcga tgtgggcgcc 900 gatgcggagg ggaatxccgg acttctgtct ccggccgcta tcgacagcct ggtcgagacg %0 attcactcca gaagccaggg acagagccgg gaggcgaccg gcgcggccgc caataatctg 1020 gatctttatc aggtgaactg caccttcctg gacgcgcttg gagggagaga gcccgattat 1080 ctgatcgccc gcgccctcca gttttttgcg ccgggaattc cgcaggtcta ttatgtcggc 1140 ctcctgggag gaaccaatga catggacctt ctcggccgga gcggagtcgg ccgggacatc 1200 aaccgccatt attacacgga tgctgaaatc gatgcggcgc tggcgcgccc tctggtgcgg 1260 acgctgatcg cgttgattcg gcttcggaat acgcacccgg cattcgctgg ggagtttgat 1320 gtgtcggttc ctgctgcaac gcaaatccgg cttcgctggc gcggcgaaac cagccaggcc 1380 acgctgacgt tcgaacactg gattgagctg catgtggact tgtccattcc aaaggcttcc 1440 ataacgggta caggcattca tcctataact attccaggcg ccgccgatgc cggcgctcca 1500 tcgtga 1506<210〉 2 <211> 501 〈212>PRT 〈213>人工序列 〈400> 2
Met Lys Asn Lys Val Gin Leu lie Ala Tyr VaJ Asp Arg lie Ser
15 10 15 Gly Gly Gly Phe Arg Lys Leu His Ala Pro Leu Thr Gly Pro Leu
16 20 25 30 Ala Glu lie Phe Gly Gly Ala His Leu Leu Pro Phe Phe Thr Pro 31 35 40 45 lie Asp Giy Ala Asp Ala Gly Phe Asp Pro Ser Asp His Thr Gin 46 50 55 60 Val Asp Pro Arg Leu Gly Thr Trp Asp Asp Val Arg lie Leu Gly 61 65 70 75 Gly Ala lie Glu Leu Val Ala Asp Leu lie Val Asn His Val Ser 76 80 85 90 Ser Ser Ser Pro Gin Phe lie Asp Tyr Ser Lys Lys Gly Ser Asp 91 95 100 105 Ser Leu Tyr Ala Gly Met Phe Leu Thr Tyr Asp Arg Val Phe Pro 106 110 115 120 Glu Gly Ala Arg Glu Ala Asp lie Leu Arg lie Tyr Arg Pro Arg 121 125 130 135 Pro Thr Leu Pro Phe Ser Pro Val Thr Leu Ser Ser Arg Glu Arg 136 140 145 150 Lys Leu Leu Trp Thr Thr Phe Asn Pro Glu Gin Val Asp lie Asp 151 155 160 165 Val Arg His Pro Glu Ala Glu Ala Tyr Leu His Ser lie Leu Lys 166 170 175 180 Lys Phe Gin Ala Ala Gly lie Arg Met lie Arg Leu Asp Ala Val 181 185 190 195 Gly Tyr Ala lie Lys Lys Pro Gly Ala Ser Cys Phe Met lie Pro 196 200 205 210 Glu Thr Phe Asp Phe lie Ala Glu Leu Thr Glu Lys Ala Arg Ala 211 215 220 225 Leu Gly lie Glu Val Leu Val Glu lie His Ser His Tyr Arg Lys 226 230 235 240 Gin lie Glu lie Ala Arg Gin Val Asp Trp Val Tyr Asp Phe Ala 241 245 250 255 Leu Pro Pro Leu Val Leu His Ala Leu Phe Ala Ser Asp Pro His 256 260 265 270 Pro Leu Ala Gin Trp Leu Ser lie Ser Pro Arg Asn Ala Val Thr 271 275 280 285 Val Leu Asp Thr His Asp Gly lie Gly Val lie Asp Val Gly Ala 286 2%295 300
10Asp Ala 301
Ser Leu 316
Glu Ala 330
Asn Cys 346
Leu lie 361
Val Tyr 376
Leu Gly 391
Thr Asp 406
Thr Leu 421
Ala Gly 436
Leu Arg 451
His Trp 466
lie Thr 481
Asp Ala 496
Glu Val Thr Thr Ala Tyr Arg Ala lie Glu Trp lie Gly Gly
Gly Glu Gly Phe Arg Val Ser Glu Ala Phe Arg Glu Thr Ala
Asn 305 Thr 320 Ala 335 Leu 350 Ala 365 Gly 380 Gly 395 lie 410 Leu 425 Asp 440 Gly 455 Leu 470 Gly 485 Pro 500
Pro
lie
Ala
Asp
Leu
Leu
Val
Asp
lie
Val
Glu
His
lie
Ser
Gly His Ala Ala Gin Leu Gly Ala Arg Ser Thr Val His
Leu Ser Asn Leu Phe Gly Arg Ala Leu Val Ser Asp Pro
Leu Arg Asn Gly Phe Gly Asp Leu Arg Pro Gin Leu lie
Ser 310 Ser 325 Leu 340 Gly 355 Ala 370 Thr 385 lie 400 Ala 415 Asn 430 Ala 445 Ala 460 Ser 475 Thr 490
Pro Gin Asp Arg Pro Asn Asn Arg Thr Ala Thr lie lie
Ala Gly Leu Glu Gly Asp Arg Pro His Thr Leu Pro Pro
Ala Gin Tyr Pro lie Met His Leu Pro Gin Thr Lys Gly
lie
Ser
Gin
Asp
Pro
Asp
Tyr
Val
Ala
lie
Phe
Ala
Ala
Asp 315 Arg 330 Val 345 Tyr 360 Gin 375 Leu 390 Tyr 405 Arg 420 Phe 435 Arg 450 Glu 465 Ser ■ Ala 49權利要求
1、一種編碼蔗糖磷酸化酶的基因，其特征在于，所述基因具有SEQ ID NO1核苷酸序列或其功能等同變異體。
2、 根據權利要求l所述的一種編碼蔗糖磷酸化酶的基因，其特征在于，所 述功能等同變異體為SEQ ID Mhl的核苷酸序列的突變形式，突變形式包括缺 失、無義、插入、錯義。
3、 根據權利要求1所述的基因所編碼的蔗糖磷酸化酶，其特征在于，其具 有如SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列，由501個氨基酸組成。
4、 一種表達載體，其特征在于它含有權利要求1所述的蔗糖磷酸化酶基因。
5、 一種宿主細胞，其特征在于它含有權利要求1所述的蔗糖磷酸化酶基 因的原核細胞或真核細胞。
6、 權利要求3所述的蔗糖磷酸化酶在蔗糖降解和對含蔗糖材料處理中的應用。
全文摘要
一種編碼蔗糖磷酸化酶的基因spgx，含有SEQ ID NO1的核苷酸序列或其功能等同變異體。它是通過對一個磷酸蔗糖酶進行DNA分子改造而得到。所述基因所編碼的蛋白質具有水解蔗糖生成1-磷酸葡萄糖和果糖的功能，但是缺失了逆向反應，不能把1-磷酸葡萄糖和果糖逆向生成蔗糖。同時也缺失了對各種單糖的轉糖苷作用。獲得的新的基因可用于構建高效降解利用蔗糖的宿主菌，在蔗糖的降解中具有廣泛的用途。
文檔編號C12N1/15GK101608185SQ20081007398
公開日2009年12月23日 申請日期2008年12月16日 優先權日2008年12月16日
發明者杜麗琴, 韋宇拓, 黃日波 申請人:廣西大學