專利名稱：一種釀酒酵母菌株及其高效發酵甘蔗汁生產乙醇的方法
技術領域：
本發明屬于釀酒酵母生物發酵領域，具體是乙醇發酵工業領域，特別是涉及一種優良釀 酒酵母菌株及其高效發酵甘蔗汁生產乙醇的方法。
背景技術：
以糖質原料生產燃料乙醇， 一直由于高昂的原料成本，而為人們所忽視。原油價格的不 斷攀升，以及糖價的下跌，以及巴西甘蔗燃料乙醇的巨大成功，已經向世人展現出甘蔗乙醇 良好的市場潛力。我國南部，地處亞熱帶，氣溫高、陽光充足、多雨而秋旱，具有悠久的甘 蔗栽培歷史并巳形成規模，不但具備了發展甘蔗燃料乙醇產業的自然條件，同時還形成了良 好的原料產業基礎。遺憾的是，目前，在我國尚未見到規模化甘蔗汁發酵生產乙醇的產業應 用報道。盡管甘蔗乙醇還不是目前乙醇生產的主要形式，但作為一項儲備技術，是有必要對
其進行研究的。
國內有一些研究甘蔗乙醇生產技術的相關文獻報道，如
文獻1:能源甘蔗生產燃料乙醇的發酵工藝優化作者潘琢鄭穗平林影等作者 單位華南理工大學生物科學與工程學院刊名迎接工業生物技術的新世紀——第四屆 發酵工程學術研討會論文集，200文摘以能源甘蔗為原料，"新橋"酵母為發酵菌 種，在新鮮蔗汁中進行直接發酵，對氮源添加和發酵條件進行了研究。實驗結果表明，氮源
的添加可以改善酵母的生長和發酵情況，發酵周期為66h，殘糖為4.04g/l，酒精度為 11.5%，最適接種量為10%，最適發酵初始pH值為6.5，最適發酵溫度為35'C，震蕩狀態下 的發醉可顯著縮短發酵周期，發酵周期為32h。
文獻2:適合甘蔗汁發酵高產酒精酵母的選育作者范元發江賢章陳由強等作 者單位福建師范大學工業微生物教育部工程研究中心刊名生物技術，2008, (1)文 摘目的:選育出適合發酵甘蔗汁生產燃料乙醇的高產釀酒酵母的菌株。方法:以酵母菌株 YS5作為出發菌株,將酶解破壁后獲得的原生質體進行紫外誘變，通過初篩和復篩進行選 育。結果:獲得一株高產酒精的釀酒酵母突變株YS5-1，該突變株發酵甘蔗汁的乙醇含量可達 12.6n/。(V/V)，較出發菌株的11.6。/。(V/V)提高了 8.6%，其糖的轉化率高達94.5%，高于出發菌 株的87.0%。結論:通過5次連續傳代培養后其突變株的乙醇產量保持穩定，表明該突變株完 全可以用于發酵甘蔗汁生產燃料乙醇。
文獻3:甘蔗生產燃料乙醇的發展現狀及前景展望作者李苗苗于淑娟機 構華南理工大學輕工與食品學院,廣東廣州510640刊名釀酒科技.2007(6).-111-113。
3文中提到，在國外，巴西的乙醇廠采用間接發酵和連續發酵兩種工藝生產燃料乙醇，酵母被 分離出繼續回用，成熟醪乙醇濃度可達8% 11%，發酵時間縮短至6 10h， 一天可回用3 次。新西蘭的H.W.Doellel等以甘蔗汁為原料，以運動發酵單孢菌作為發酵菌株規模化生 產工業酒精，100L和1000L發酵試驗顯示，經17 20小時發酵后，其糖轉化率為91 95 %，酒精濃度為10%(v/v)。 Limtong, S.等以甘蔗汁為原料，馬克斯克魯維酵母為發酵菌株生 產燃料酒精，該酵母耐40 45。C高溫，在4(TC發酵，酒精濃度為6.78% (w/v)，酒精得率 為60.4%。
到目前為止，糖廠的酒精生產都以糖蜜為原料，雖然甘蔗汁與糖蜜一樣以含蔗糖成分為 主，但甘蔗汁有其特殊性，如甘蔗汁灰分較少，而蛋白質、膠體等較多，易引起發酵過程中 影響酵母繁殖、酵母菌絮凝、發酵速度偏慢和生產工藝繁瑣易等問題。針對甘蔗汁直接發酵 的特殊性，選育出適宜蔗汁發酵的酵母菌種，改進并優化其發酵工藝，以期提高產率方面需 開展深入研究。國內外的研究人員已經對甘蔗乙醇的生產做了大量的有價值的研究工作，其 中，巴西尤為突出，取得了顯著的成效，其采用天然優良酵母發酵，并結合酵母回用技術。 但針對我國目前乙醇廠的現狀，進行酵母回用技術，不但設備需要改進，而且對工作人員的 要求相對較高，如何有效利用現有設備進行甘蔗乙醇的生產，本發明進行了有益的探索。
發明內容
本發明的目的是針對甘蔗汁直接發酵生產乙醇菌株發酵速度偏慢、殘糖高、生產工藝繁 瑣等不足，提供一種適宜蔗汁發酵的優良釀酒酵母菌株，并提供該菌株在蔗汁產乙醇中的單 濃度連續流加發酵工藝方法，以填補我國在該項生產技術領域的空白。
本發明所提供的釀酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)，是發明人利用生物學手 段，從酒精廠排污口的土壤中分離選育得到的一株耐高溫、耐酒精、適合甘蔗發酵的菌株， 即酵母菌株gXas02，已于2008年7月19日保藏在位于中國武漢市武漢大學的中國典型培 養物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M208110。
CCTCC N0:M208110的分離選育過程如下
從酒精廠排污口采集廢棄的醪液、廢水、淤泥及周邊的泥土作分離樣品，分別接入含 50mlYPD (葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、自然pH值)液體的250ral三角瓶 中，接入的分離樣品約為lg， 3(TC， 160rpm搖瓶富集培養24h。取富集培養液進行不同濃 度的稀釋，涂YPD平板，3CTC培養2天，將菌株稀釋涂布于TTC下層平板中，3(TC培養24h, 長出可見菌落后，選擇菌落數為100 300的平板倒入約12mL TTC上層培養基覆蓋原來菌 落，之后在3(TC下避光保溫2 3h，由菌落的呈色來判定酵母產酒精能力的大小。通過TTC 顯色劑對酵母代謝產物的呈色特性，篩選出產酒精能力強的酵母。發明人按照上述方法，先后從來自于2個酒精廠，共4批的30余份樣品中，選擇出一個屬于本發明的，具有利用甘 蔗汁產酒精優良發酵特性的分離物，實驗室編號gxas 02，即CCTCC N0:M208110。 CCTCC N0:M208110的分類鑒定
CCTCC N0:M208110的細胞形態特征為圓形或卵圓形，在幼年菌落中，細胞為4 14X 3 7微米，長和寬的比率是l: 1 1: 2，在麥芽汁中沉淀，子囊孢子圓形，平滑。
挑取含CCTCC N0:M208110平板上的單菌落，接種于含3mlYPD培養基的指形瓶中，30 'C， 160rpm，過夜培養，然后，利用酵母總DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提 取CCTCC NO，8110的基因組DNA。
其中采用
正向引物NL-1:5 ， -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ，， 反向引物NL-4:5' -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3，，
以CCTCC N0:M208110的總DNA為模板，進行聚合酶鏈式反應(PCR),擴增大小為 575bp的26S rDNA Dl/D2區域核苷酸序列，擴增產物連接到pMD18—T載體(大連寶生物工 程有限公司)上，用此序列在Genbank核酸序列數據庫中進行同源序列搜索(Nucleitide — Nucleitide BLAST)。搜索結果表明CCTCC N0:M208110的26S rDNA Dl/D2區域核酸序 歹U ， 與 Genbank 現有 Saccharomyces cerevisiae isolate TJY-29 、 Saccharomyces cerevisiae isolate NY3-4 Saccharomyces cerevisiae isolate NY3-2禾口 Saccharomyces cerevisiae isolate NY3-1等同一區域核酸序列同源性均達到100%。
由于CCTCC N0:M208110單純的26S rDNA Dl/D2區域核酸序列與其他菌株的沒有區 別，為了更好的區別該菌株，對該菌株和釀酒酵母的測序菌株S288C進行了 CGH (comparative genomic hybridization)的生物芯片，并進行了熒光交換實驗，尋找到 271個與S288C有明顯差異的基因，23個基因拷貝數明顯增多，主要集中在第17條染色體 上，248個基因拷貝數明顯減少，分布在其余的16條染色體上。
將CCTCC N0:M208110進行溫度和酒精耐受度測試，發現該菌株為能耐受高溫、高糖和 高酒精菌株，其溫度耐受度為37。C，耐糖度為60%質量比的葡萄糖，酒精耐受度體積百分比 為20%。
根據上述的菌落外觀、細胞形態、生理生化與分子生物學特征的可以確定，CCTCC N0:M208110的分類地位屬于釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
本發明還提供了利用CCTCC N0:M208110直接發酵蔗汁生產乙醇的單濃度流加發酵方 法。具體工藝方法如下
將CCTCC N0:M208110按微生物發酵常規液體種子培養方法，以YPD培養基，即葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、自然pH值進行培養，當每毫升培養液含酵母菌數達 到1.5億個以上時，按1 10%的接種量轉接到處理過的甘蔗汁中(添加了濃硫酸調整pH為 3.0 4.0并添加質量比為0.1%的尿素、質量比為0.02%的磷酸)，按此比例逐步放大，一 直到可以進行發酵罐培養，當發酵罐中發酵培養液滿足流加條件時，即每毫升培養液含酵母 菌數達到1.5億個以上，開始連續流加處理過的甘蔗汁進行發酵，按常規技術控制發酵罐培 養液酵母數及各發酵罐的常規運行參數， 一直到發酵醪成熟，然后便按常規的蒸餾工藝制取 乙醇。
采用本發明的單濃度流加發酵方法，發酵過程中，各罐溫度控制在26 37°C，發酵所 用時間為12 16小時；其發酵生產乙醇全過程完成時，發酵液中乙醇體積百分比濃度為 8.6 9.4%，殘糖為0.2 0.3g/100ml。本工藝可在一個發酵罐內進行也可以在多個發酵罐中 進行。
與現有技術相比，本發明具有的突出的實質性特點和顯著的進步是
1、 分離選育出了適于蔗汁直接發酵的優良發酵菌株
本發明人通過大量篩選比較，分離選育出了具有多種優良特性的釀酒酵母菌株CCTCC N0:M208110。該菌株適合發酵的溫度范圍較廣，耐高糖的能力較好，可以滿足單濃度流加工 藝的要求，同時，還具有發酵速度快、糖利用率高等特性，適合甘蔗汁為原料的乙醇發酵。
2、 生產工藝得到了優化
通過選育并利用優良的發酵菌株，使得效率更高的單濃度流加工藝得以實現。該工藝相 較現有的雙濃度流加工藝，工藝得到了大大簡化，不但工藝更易于控制，同時還節省了發酵 罐的投入，增加了設備的使用效率，降低了生產成本，提高了生產效率，并可獲得更高酒精 濃度的發酵醪，使酒精得率明顯提高。而且，本工藝未采用巴西現行的酵母回用技術，工藝 流程和操作方法更加簡化。
圖1是CCTCC N0:M208110與釀酒酵母S288C比較的染色體差異圖。 圖2是單濃度流加發酵制備乙醇工藝流程圖。 保藏信息說明
一種釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae gxas02，真空冷凍干燥保藏于中國典型 培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏單位地址為武漢市武漢大學，保藏編號為CCTCC N0:M208110，保藏日期為2008年7月19日。
具體實施例方式
下面結合附圖2，通過具體實施例對本發明作進一步的說明，但不限制本發明。實施例一20L三聯發酵罐甘蔗汁發酵乙醇小試
1、 液體培養基小量酵母菌種培養
將在YPD平板保藏的CCTCC N0:M208110單菌落接入液體YPD培養基中，培養溫度 28°C，過夜培養。
2、 液體培養基擴大酵母菌種培養
以步驟1中的YPD培養液為種子液，按1%的接種量接入處理過的甘蔗汁(添加濃硫酸 調整pH為3.5 4.0，添加質量比為0. 1%的尿素，質量比為0.02%的磷酸)，制備得到 500ml甘蔗汁培養液。
3、 20L三聯發酵罐甘蔗汁發酵
以步驟2中的甘蔗汁培養液為種子液，接入含IOL處理過甘蔗汁的1號發酵罐(容積為 20L)中，進行發酵，在1號發酵罐中控制通氣量為100L/h，發酵溫度3(TC，當菌體數達到 1.5億個時，開始緩慢流加處理過的甘蔗汁，控制流速，維持菌體數，當1號罐體中發酵液 體積達到16L時，將1號罐與2號罐的接口打開，發酵液開始進入2號罐，當2號罐體中發 酵液體積達到16L時，將2號罐與3號罐的接口打開，發酵液開始進入3號罐，2號、3號 罐發酵溫度32°C，菌體數在2億以上，總發酵時間為12h，發酵醪成熟，酒度達到8.6 (V/V)，殘糖達到0.3g/100ml。
實施例二甘蔗汁發酵日產10噸乙醇中試
1、 液體培養基小量酵母菌種培養及液體培養基擴大酵母菌種培養同實施例一。
2、 以甘蔗汁為原料發酵，日產10噸乙醇中試。
參照附圖2，將CCTCC N0:M208110菌株擴大培養到50L后，所得的新鮮種子液接入處 理過的含10噸甘蔗汁的發酵罐(容積為120立方米)中進行發酵。甘蔗汁處理方法為在 蔗汁中添加濃硫酸調整pH為3.0 4.0，添加質量比為0.1%的尿素，質量比為0.02%的磷 酸。在1號罐中控制通氣量，發酵溫度26°C，當菌體數達到1.5億個時，開始緩慢向1號 罐泵入同樣處理過的甘蔗汁，控制流速，維持菌體數不變，當1號罐體中發酵液液面達到和 2號罐的連通管時，將1號罐與2號罐的接口打開，發酵液由于勢能的驅動，開始進入2號 罐，控制菌體數，當2號罐體中發酵液液面達到和3號罐的連通管時，將2號罐與3號罐的 接口打開，發酵液發酵液由于勢能的驅動，開始進入3號罐，待發酵醪成熟后，便送入蒸餾 塔按現有技術進行蒸餾制取酒精，二氧化碳由發酵罐上方的管路統一排出。整個過程其余各 罐發酵溫度28'C，菌體數在1.5億個以上，總發酵時間為12 16h，發酵醪成熟，酒精濃度 達到8.6% (V/V)，殘糖達至U 0.3g/100ml。
實施例三甘蔗汁發酵日產10噸乙醇中試1、 液體培養基小量酵母菌種培養及液體培養基擴大酵母菌種培養同實施例一。
2、 以甘蔗汁為原料發酵，日產10噸乙醇中試。
參照附圖2，將CCTCC N0:M208110菌株擴大培養到50L后，所得的新鮮種子液接入處 理過的含10噸甘蔗汁的發酵罐(容積為120立方米)中進行發酵。甘蔗汁處理方法為在 蔗汁中添加濃硫酸調整pH為3. 0 4. 0，添加質量比為0. 1%的尿素，質量比為0. 02%的磷 酸。在1號罐中控制通氣量，發酵溫度29°C，當菌體數達到2億個時，開始緩慢向1號罐 泵入同樣處理過的甘蔗汁，控制流速，維持菌體數不變，當1號罐體中發酵液液面達到和2 號罐的連通管時，將1號罐與2號罐的接口打開，發酵液由于勢能的驅動，開始進入2號 罐，控制菌體數，當2號罐體中發酵液液面達到和3號罐的連通管時，將2號罐與3號罐的 接口打開，發酵液發酵液由于勢能的驅動，開始進入3號罐，待發酵醪成熟后，便送入蒸餾 塔按現有技術進行蒸餾制取酒精，二氧化碳由發酵罐上方的管路統一排出。整個過程其余各 罐發酵溫度3rC，菌體數在2億以上，總發酵時間為12 16h，發酵醪成熟，酒精濃度達到 9.4% (V/V)，殘糖達到0.2g/100ml。
實施例四甘蔗汁發酵日產10噸乙醇中試
1、 液體培養基小量酵母菌種培養及液體培養基擴大酵母菌種培養同實施例一。
2、 以甘蔗汁為原料發酵，日產10噸乙醇中試。
參照附圖2，將CCTCC N0:M208110菌株擴大培養到50L后，所得的新鮮種子液接入處 理過的含10噸甘蔗汁的發酵罐(容積為120立方米)中進行發酵。甘蔗汁處理方法為在 蔗汁中添加濃硫酸調整pH為3. 0 4. 0，添加質量比為0. 1%的尿素，質量比為0. 02%的磷 酸。在1號罐中控制通氣量，發酵溫度32'C，當菌體數達到2億個時，開始緩慢向1號罐 泵入同樣處理過的甘蔗汁，控制流速，維持菌體數不變，當1號罐體中發酵液液面達到和2 號罐的連通管時，將1號罐與2號罐的接口打開，發酵液由于勢能的驅動，開始進入2號 罐，控制菌體數，當2號罐體中發酵液液面達到和3號罐的連通管時，將2號罐與3號罐的 接口打開，發酵液發酵液由于勢能的驅動，開始進入3號罐，待發酵醪成熟后，便送入蒸餾 塔按現有技術進行蒸餾制取酒精，二氧化碳由發酵罐上方的管路統一排出。整個過程各罐發 酵溫度34°C，菌體數在2億以上，總發酵時間為12 16h，發酵醪成熟，酒精濃度達到 9.1% (V/V)，殘糖達到0.25g/100ml。
實施例五甘蔗汁發酵日產10噸乙醇中試
1、 液體培養基小量酵母菌種培養及液體培養基擴大酵母菌種培養同實施例一。
2、 以甘蔗汁為原料發酵，日產10噸乙醇中試。
參照附圖2，將CCTCC N0:M208110菌株擴大培養到50L后，所得的新鮮種子液接入處理過的含10噸甘蔗汁的發酵罐(容積為120立方米)中進行發酵。甘蔗汁處理方法為在 蔗汁中添加濃硫酸調整pH為3. 0 4. 0，添加質量比為0. 1%的尿素，質量比為0. 02%的磷 酸。在1號罐中控制通氣量，發酵溫度35'C，當菌體數達到2億個時，開始緩慢向1號罐 泵入同樣處理過的甘蔗汁，控制流速，維持菌體數不變，當1號罐體中發酵液液面達到和2 號罐的連通管時，將1號罐與2號罐的接口打開，發酵液由于勢能的驅動，開始進入2號 罐，控制菌體數，當2號罐體中發酵液液面達到和3號罐的連通管時，將2號罐與3號罐的 接口打開，發酵液發酵液由于勢能的驅動，開始進入3號罐，待發酵醪成熟后，便送入蒸餾 塔按現有技術進行蒸餾制取酒精，二氧化碳由發酵罐上方的管路統一排出。整個過程各罐發 酵溫度37°C,菌體數在2億以上，總發酵時間為12 16h,發酵醪成熟，酒精濃度達到 8.6% (V/V)，殘糖達到0.3g/100ml。序列表
〈110〉廣西科學院
〈120〉一種釀酒酵母菌株及其高效發酵甘蔗汁生產乙醇的方法 <■ 1 <210> 1 <211〉 575 〈212> DNA
〈213>酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) <400> 1
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權利要求
1、一種能高效發酵甘蔗汁生產乙醇的生產菌，分類命名為釀酒酵母菌Saccharomycescerevisiae，菌株號為gxas02，是從酒精廠的排污口中采集分離得到的，真空冷凍干燥保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM208110，保藏日期為2008年7月19日。
2、 如權利要求1所述的生產菌，其特征在于所述菌株的26S rDNA Dl/D2區域具有序列1 所示的核酸序列，與Genbank現有Saccharomyces cerevisiae同一區域核酸序列同源性均 達到100%。
3、 如權利要求1所述的生產菌，其特征在于所述菌株與Genbank上公布的釀酒酵母測序 菌株Saccharomyces cerevisiae S288C在DNA水平上進行比較，有271個基因存在顯著性 差異，其中，23個基因拷貝數明顯增多，主要集中在第17條.(線粒體)染色體上，248個 基因拷貝數明顯減少，分布在其余的16條染色體上。
4、 如權利要求1所述的生產菌，其特征在于所述菌株為能耐受高溫和高酒精菌株，其溫 度耐受度為37。C，酒精耐受度體積百分比為20%，葡萄糖耐受度質量比為60%。
5、 利用權利要求1所述的生產菌發酵甘蔗汁生產乙醇的方法，其特征在于生產過程如下 將CCTCC N0:M208110按微生物發酵常規液體種子培養方法，即以YPD培養基，即葡萄糖 20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、自然pH值進行培養，當每毫升培養液含酵母菌數達 到1.5億個以上時，按1 10%的接種量轉接到添加了濃硫酸調整pH為3.0 4.0并添加質量 比0.1%的尿素、質量比0.02%的磷酸的甘蔗汁中，并按1 10%的接種比例逐步放大，一 直到可以進行發酵罐培養，當發酵罐中發酵培養液滿足流加條件時，即每毫升培養液含酵母 菌數達到1.5億個以上，開始連續流加處理過的甘蔗汁進行發酵，按常規技術控制發酵罐培 養液酵母數及各發酵罐的常規運行參數， 一直到發酵醪成熟，然后即可按照常規技術進行蒸 餾制取乙醇；發酵過程中，發酵溫度控制在26 37。C,發酵時間為12 16小時。
全文摘要
本發明涉及了一株優良釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae gxas02，及利用其為生產菌株，采用甘蔗汁為原料，進行規模化生產乙醇的方法。該菌株真空冷凍干燥保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOM208110，保藏日期為2008年7月19日，經鑒定系釀酒酵母，該菌株適合甘蔗汁發酵乙醇，速度快，殘糖低，耐高溫，耐酒精。生產工藝采取單濃度連續流加工藝，在未使用酵母回用和固定化酵母技術的條件下，將經過壓榨的但未經濃縮或稀釋的甘蔗汁直接進行發酵，在日產10噸乙醇的生產線上，連續運行，效果良好，發酵時間為12～16h，酒度達到8.6～9.4(V/V)，殘糖為0.2～0.3g/100ml。本發明具有實施方便，設備利用率高，發酵醪乙醇濃度高，糖的利用率接近論理值等特點，降低了生產乙醇的成本。
文檔編號C12R1/865GK101434911SQ20081007382
公開日2009年5月20日 申請日期2008年10月6日 優先權日2008年10月6日
發明者妮 關, 楊登峰, 米慧芝, 肖代俊, 琦 陸, 黃志民, 黃日波, 黎貞崇 申請人:廣西科學院